劉　越，羅定強(qiáng)*，康　榮，王國(guó)海

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安　710065；2.西安醫(yī)學(xué)院，西安　710021)

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平消膠囊(片)HPLC特征圖譜研究

劉越1，羅定強(qiáng)1*，康榮2，王國(guó)海1

(1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安710065；2.西安醫(yī)學(xué)院，西安710021)

目的 建立平消膠囊(片)的特征圖譜，提高其質(zhì)量控制水平。方法以甲醇為溶劑，進(jìn)行超聲提??；色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：263 nm；柱溫:35 ℃。結(jié)果平消膠囊(片)各成分得到了較好的分離，以柚皮苷為參照物，確定了9個(gè)共有色譜峰，分別來(lái)源于馬錢(qián)子、枳殼和五靈脂。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可同時(shí)分離平消制劑中的多種成分，尤其是對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法中枳殼主要成分柚皮苷薄層鑒別項(xiàng)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的現(xiàn)象進(jìn)行補(bǔ)充。

平消膠囊(片)；特征圖譜；枳殼；質(zhì)量控制

平消膠囊(片)為2013年國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)品種，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部，主要由郁金、仙鶴草、五靈脂、白礬、硝石、干漆(制)、枳殼(麩炒)和馬錢(qián)子粉8味中藥組成[1]；具有活血化瘀、散結(jié)消腫和解毒止痛的功效；對(duì)毒瘀內(nèi)結(jié)所致的腫瘤患者具有緩解癥狀、縮小瘤體、提高人體免疫力和延長(zhǎng)患者生存時(shí)間的作用。平消制劑是經(jīng)臨床實(shí)踐確證的抗癌藥，尤其是對(duì)乳腺癌、肺癌和食道癌等惡性腫瘤具有較好的療效[2]。現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法較簡(jiǎn)單，鑒別項(xiàng)中只對(duì)馬錢(qián)子和枳殼進(jìn)行了控制，含量測(cè)定項(xiàng)下只對(duì)馬錢(qián)子藥材成分中的士的寧進(jìn)行含量測(cè)定，難以有效控制平消膠囊(片)的質(zhì)量，且枳殼混偽品種較多[3]，多含有與柚皮苷結(jié)構(gòu)類似的黃酮類化合物[4-5]，依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法使用硅膠G為吸附劑，乙酸乙酯-甲酸-水三項(xiàng)系統(tǒng)為展開(kāi)劑，很難有效分離上述黃酮類化合物，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。

作為能體現(xiàn)中藥整體特征的指紋圖譜和特征圖譜分析技術(shù)在近年來(lái)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中得到了廣泛的關(guān)注和認(rèn)可[6-9]。本文對(duì)平消膠囊(片)的HPLC 特征圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)地方法學(xué)考察，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了分析總結(jié)，以期合理提高該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1　儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器(日本島津公司)；BS224S電子分析天平、BP211D電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司)；KQ-500DE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥馬錢(qián)子堿對(duì)照品(批號(hào)110706-200505)，士的寧對(duì)照品(批號(hào)110705-201307)，柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722-201312)，新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)111857-201001)，橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)110721-201316)，馬錢(qián)子對(duì)照藥材(批號(hào)121164-200302)，枳殼對(duì)照藥材(批號(hào)120981-200403)，五靈脂對(duì)照藥材(批號(hào)121348-200501)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；平消膠囊(片)樣品來(lái)源于市場(chǎng)抽樣；生產(chǎn)用藥材、陰性樣品由生產(chǎn)企業(yè)提供；甲醇(色譜純，Merck公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

2　現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法柚皮苷薄層鑒別假陽(yáng)性結(jié)果

依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法，制備供試品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。以硅膠G為吸附劑，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶2∶3)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，晾干，置于紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，提示現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法容易造成柚皮苷鑒別假陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)圖1。

圖1薄層色譜圖

1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.樣品

Fig.1 TLC chromatogram

1.naringin；2.hesperidin；3.neohesperidin；4.sample

3　特征圖譜研究

3.1色譜條件色譜柱(Kromasil C18，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 mL·L-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：263 nm；分析時(shí)間：65 min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-5 mL·L-1磷酸水溶液梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 The mobile phase program of gradient elution

時(shí)間/minA,乙腈/%B,5mL·L-1磷酸水溶液/%01585263070416040568020601585651585

3.2對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液的制備取馬錢(qián)子堿、士的寧、柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品各5 mg，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成1 mL各含0.1 mg的混合對(duì)照品溶液，用于色譜峰定位。另取馬錢(qián)子、枳殼和五靈脂對(duì)照藥材各1 g，分別加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液，用于峰歸屬。

3.3供試品溶液的制備取平消膠囊(片)適量，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，密塞，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.4測(cè)定方法分別精密量取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，以柚皮苷色譜峰為S峰，其余各峰的保留時(shí)間與S峰保留時(shí)間比值為相對(duì)保留時(shí)間。

3.5方法學(xué)考察

3.5.1精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，在相同色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定，記錄色譜圖，以柚皮苷峰為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間與其相對(duì)峰面積無(wú)明顯差異，其RSD值分別為0.1%～0.2% 和0.2%～0.5%，表明本實(shí)驗(yàn)儀器及色譜條件的精密度良好。

3.5.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，18和24 h時(shí)測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和其相對(duì)峰面積無(wú)明顯差異，以柚皮苷峰為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰，柚皮苷峰保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為0.2%和0.6%，穩(wěn)定性良好。說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批次的樣品， 按照3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和其相對(duì)峰面積無(wú)明顯變化，以柚皮苷峰為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰，其RSD值分別為0.6%～0.8%和0.3%～0.5%，重復(fù)性良好。

3.5.4色譜峰歸屬取馬錢(qián)子堿、士的寧、柚皮苷和新橙皮苷混合對(duì)照品溶液以及馬錢(qián)子、枳殼和五靈脂對(duì)照藥材溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，確定各藥材主峰的保留時(shí)間，與樣品色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果各藥材主峰均在樣品色譜圖中呈現(xiàn)，且分離度良好，見(jiàn)圖2。

圖2HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.樣品；C.薄層鑒別易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果樣品；

1.馬錢(qián)子堿；2.士的寧；S.柚皮苷；4.新橙皮苷

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.sample；C.sample of false-positive result；1.brucine；2.strychnine；S.naringin；4.neohesperidin

3.5.5專屬性考察取不含每種藥材的陰性樣品，按照3.3項(xiàng)下方法制備陰性溶液，在相同色譜條件下進(jìn)樣，按照各峰的保留時(shí)間對(duì)主要色譜峰進(jìn)行峰歸屬。

4　樣品特征圖譜的建立

抽取不同生產(chǎn)企業(yè)的平消片和平消膠囊樣品共10批，按照3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，通過(guò)對(duì)10批樣品的色譜圖進(jìn)行比較，選定其中9個(gè)峰為特征峰，并以柚皮苷峰為S峰，計(jì)算其余峰的相對(duì)保留時(shí)間。平消膠囊(片)特征圖譜見(jiàn)圖2，各峰保留時(shí)間及峰歸屬結(jié)果見(jiàn)表2。

表2各特征峰的保留時(shí)間及歸屬

Tab.2 The retention time and the corresponding medicinal materials of characteristic peaks

峰名稱保留時(shí)間相對(duì)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)藥材馬錢(qián)子堿7.8830.471馬錢(qián)子士的寧8.2350.492馬錢(qián)子峰315.4130.921枳殼柚皮苷峰(S)16.7251.000枳殼新橙皮苷18.9231.131枳殼峰528.5231.705枳殼峰640.0752.396枳殼峰741.0672.455五靈脂峰842.7732.557枳殼

5　討論

5.1方法特點(diǎn)本研究建立的平消膠囊(片)特征圖譜，能夠同時(shí)控制制劑中馬錢(qián)子、枳殼和五靈脂3味藥材的質(zhì)量，能夠從一定程度上體現(xiàn)出平消制劑不同廠家、不同批次之間的穩(wěn)定性和均一性。另外，枳殼混偽品種較多，多含有與柚皮苷結(jié)構(gòu)類似的黃酮類成分，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法薄層鑒別容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。新建立的高效液相特征圖譜方法能夠準(zhǔn)確地區(qū)別上述黃酮類化合物，可用于鑒別制劑中枳殼藥材的混偽品。

5.2色譜峰歸屬制劑中藥材的主要色譜峰在263 nm 處均能體現(xiàn)，且在此波長(zhǎng)處檢測(cè)的色譜峰數(shù)量較多，響應(yīng)值較好，故選擇263 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)處，3種藥材均有特征峰呈現(xiàn)，根據(jù)峰歸屬結(jié)果，馬錢(qián)子的特征峰為1和2 號(hào)峰，分別為馬錢(qián)子堿和士的寧，枳殼的特征峰為3，4，5，6和8號(hào)峰，S峰柚皮苷和4號(hào)峰新橙皮苷為枳殼的主要化學(xué)成分，五靈脂藥材的特征峰為7號(hào)峰。

5.3平消制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法及平消膠囊(片)特征圖譜，仍不能有效控制該制劑君藥郁金和仙鶴草的質(zhì)量，同時(shí)制干漆為毒性藥材，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)相應(yīng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目，五靈脂僅收載于地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)理化檢驗(yàn)項(xiàng)目，難以有效控制成品的質(zhì)量，無(wú)法對(duì)生產(chǎn)企業(yè)可能使用質(zhì)量不合格的原料藥及偷工減料等問(wèn)題進(jìn)行有效監(jiān)管。另一方面，由于礦物藥白礬和硝石的存在，可能存在重金屬及有害元素超標(biāo)的隱患，這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步深入研究。

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HPLC specific chromatograms of Pingxiao Capsules(Tablets)

LIU Yue1，LUO Dingqiang1*，KANG Rong2，WANG Guohai1

(1.Shaanxi Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710065，China；2.Xi′an Medical College，Xi′an 710021，China)

Objective To establish the specific chromatogram of Pingxiao Capsules (Tablets) by HPLC，and to improve the quality control.Methods Samples were prepared by ultrasonic extraction with methanol；the Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) chromatographic column and the mobile phase of acetonitrile-5 mL·L-1aqueous phosphoric acid were used for gradient elution with the flow rate at 1.0 mL·min-1and the detection wavelength at 263 nm.The column oven temperature was kept at 35 ℃.Results The constituents of Pingxiao Capsules (Tablets) showed a good separation and nine common peaks were identified with naringin as a reference，which were derived fromStrychnisemen，F(xiàn)ructusaurantiiandFaecestrogopterori，respectively.Conclusions The method has advantages of good accuracy as well as reproducibility and can simultaneously separate the multiple components of Pingxiao Capsules (Tablets)，which is also a significant supplement of frequently false-positive results in current standard TLC identification for naringin.

Pingxiao Capsules(Tablets)；specific chromatogram；Fructusaurantii；quality control

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局上市藥品質(zhì)量分析專項(xiàng)項(xiàng)目

劉越，男，博士，主管藥師

羅定強(qiáng)，男，副主任藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.003

R284

A

1004-2407(2016)05-0448-04

2016-03-13)