張瓊瓊， 黃興如， 郭逍宇

首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院, 北京　100048

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基于T-RFLP技術(shù)的不同水位梯度植物根際細(xì)菌群落多樣性特征分析

張瓊瓊， 黃興如， 郭逍宇*

首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院, 北京100048

為了解水位梯度控制下不同濕地植物根際細(xì)菌群落多樣性，以北京市奧林匹克公園植物氧化塘人工濕地為例，采用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)結(jié)合ANOVA分析，比較了水位梯度控制下三棱草、蘆葦、香蒲、睡蓮4種植物根際細(xì)菌群落的多樣性。研究結(jié)果顯示：隨著水位梯度加深，根際細(xì)菌群落多樣性呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ 3種不同酶切所得結(jié)果一致，且綜合3種酶切的PAT比對(duì)中RFs組合數(shù)量隨水位梯度加深也呈相應(yīng)變化趨勢(shì)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨水位梯度加深植物根際可培養(yǎng)細(xì)菌RFs數(shù)量變化較顯著。不同水位梯度下各植物根際細(xì)菌群落中差異顯著的菌群為Beta變形桿菌綱，水位梯度加深可能導(dǎo)致不同生態(tài)型植物根際泌氧能力降低，進(jìn)而影響植物根際好氧細(xì)菌生存，從而出現(xiàn)三棱草根際屬水平菌群豐富度最高，其次為蘆葦、香蒲，最少為睡蓮。各植物根際細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)屬多數(shù)為變形桿菌門，是脫氮除磷的功能性菌門，其中產(chǎn)堿桿菌屬和黃桿菌屬為四種植物根際細(xì)菌的共同優(yōu)勢(shì)屬，在碳氮循環(huán)中起重要作用。

水位梯度；濕地植物；細(xì)菌多樣性；T-RFLP

濕地是自然環(huán)境中自凈能力最強(qiáng)的生態(tài)系統(tǒng)之一[1]，可利用基質(zhì)-植物-微生物復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的物理、化學(xué)、生物三重協(xié)同作用，通過過濾、沉淀、吸附、離子交換、植物吸收和微生物分解等多種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)污水的高效凈化[2]。濕地植物在污水凈化過程中扮演著重要角色。植物可以直接吸收利用水體中的氮磷等富營(yíng)養(yǎng)化元素，進(jìn)而通過植物收割使其從濕地去除。但通過植物吸收同化的去除量?jī)H是一少部分，Oostrom等認(rèn)為僅有13%的氮是通過基質(zhì)的過濾和植物吸收作用被去除[3]。棲息于濕地植物根際的多種微生物是水體中污染物主要降解者，原因是根際是植物、微生物和基質(zhì)共同作用最直接、最強(qiáng)烈的區(qū)域[4]，且植物根分泌物、通氣條件及凋落物的分解過程會(huì)影響植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)特性進(jìn)而影響系統(tǒng)的凈化效能[5-6]。細(xì)菌在根環(huán)境中對(duì)各種根分泌物利用率和敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過真菌、放線菌及藻類等，在根際微生物活動(dòng)中較活躍且占主導(dǎo)地位，并能與根際聯(lián)合生存、定殖及保持在根部[7]。

水位是影響濕地生態(tài)過程的關(guān)鍵因素[8]。水位梯度變化是影響濕地植物空間異質(zhì)分布的主導(dǎo)因子[9]，濕地水位梯度變異影響植物氧氣的供給，從而于濕地近岸帶依次形成濕生植物、挺水植物、浮葉植物等生態(tài)型的植物分布格局?；谒惶荻茸儺惖难鯕夤┙o調(diào)節(jié)導(dǎo)致不同類型的濕地植物生物地化循環(huán)中好氧和厭氧過程的相互影響。高水位促進(jìn)反硝化[10]、甲烷生成[11]等厭氧過程的速率，同時(shí)降低硝化作用等好氧過程的速率[12]。

基于末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(Terminal restriction fragment length polymorphism analysis, T-RFLP)可以定性和定量的進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析及不同群落結(jié)構(gòu)間的比較[13]，它是建立在16S rDNA基礎(chǔ)上，其數(shù)據(jù)輸出形式在測(cè)序過程中直接數(shù)字化完成對(duì)大量信息的快速分析，前期限制性內(nèi)切酶選擇是影響分析結(jié)果的關(guān)鍵因素[14]，選擇內(nèi)切酶應(yīng)考慮其消化后產(chǎn)生單峰具有特異性及可測(cè)定范圍內(nèi)末端片段長(zhǎng)度(T-RFs)的數(shù)量[15]。在樣品群落多樣性超過100種時(shí)，使用單酶切可能只識(shí)別50%的群落，適宜選擇2—4種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行多重酶切，可檢測(cè)50%—70%的群落豐富度表達(dá)[16]。研究表明，分析細(xì)菌16S rDNA多態(tài)性時(shí)，MspⅠ最易得到可分辨的單一片段，HhaⅠ和RsaⅠ可產(chǎn)生數(shù)量最多的T-RFs[17]。HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ 三種四堿基限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)分別為GCG′C、C′CGG、GT′AC，綜合包括了AT和GC位點(diǎn)，且酶切位點(diǎn)特異性高，可提高16S rDNA片段中的酶切頻率、豐富酶切片段[18-19]。由于雙酶切不一定比單酶切產(chǎn)生更多T-RFs，甚至可能少于單酶切，因此綜合3種酶切在各自反應(yīng)體系中進(jìn)行分別酶切，提高操作分類單元的精確有效性[20]。

近年來，已有學(xué)者嘗試借用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在海量數(shù)據(jù)中挖掘數(shù)據(jù)的內(nèi)在規(guī)律方面的優(yōu)勢(shì)對(duì)T-RFLP分析中酶切片段進(jìn)行分析。儲(chǔ)昭瑞等采用T-RFLP技術(shù)，選取合適的HhaⅠ和RsaⅠ限制性內(nèi)切酶，使得不同厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)應(yīng)不同T-RFs，進(jìn)而完成對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌群落組成的快速分析[21]。黃藝等借助加權(quán)平均回歸方法根據(jù)滇池流域38個(gè)樣品產(chǎn)生的110個(gè)T-RFs片段對(duì)各環(huán)境因子的生態(tài)適宜性將其劃分為對(duì)環(huán)境干擾的敏感片段、中間片段和耐受片段，進(jìn)而成功地對(duì)滇池流域浮游生物的完整性進(jìn)行評(píng)價(jià)[22]。Ding T等采用Average Proportion per Existence (APE)和部分主成分分析(pCCA)的方法對(duì)不同物種、不同季節(jié)、不同環(huán)境條件下植物葉內(nèi)生細(xì)菌群落所產(chǎn)生的T-RFs片段進(jìn)行差異性分析，表明物種變異是影響T-RFs片段變異的主要因素，其次是生長(zhǎng)季節(jié)和生長(zhǎng)環(huán)境[23]。

本文利用T-RFLP技術(shù)結(jié)合HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ綜合酶切結(jié)果的多樣性指數(shù)、片段類型、片段豐度和基于MiCA的PAT比對(duì)分析比較不同水位梯度下濕地近岸帶優(yōu)勢(shì)植物即濕生植物三棱草(CarexphacotaSpr.)、挺水植物蘆葦(Phragmitescommunis)和香蒲(Typhaorientalis)、浮葉植物睡蓮(Nymphaeatetragona)的根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性差異，并嘗試借助方差分析檢驗(yàn)基于水位梯度變異的不同植物根際細(xì)菌群落屬特征差異，探討同一水域不同水位梯度條件下植物根際細(xì)菌群落間變異關(guān)系及細(xì)菌群落與宿主植物根際微環(huán)境間響應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)果預(yù)期在多元統(tǒng)計(jì)分析與T-RFLP相結(jié)合的微生物生態(tài)學(xué)問題分析中進(jìn)行有益嘗試，并預(yù)期揭示基于水位梯度濕地植物根際細(xì)菌群落多樣性變異特征，對(duì)構(gòu)建高效的濕地凈化系統(tǒng)及改善和維護(hù)生態(tài)平衡提供科學(xué)參考。

1　研究區(qū)概況

奧林匹克公園南園濕地位于奧林匹克公園內(nèi)，地處北京市區(qū)北部。該區(qū)屬暖溫帶半干旱半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候。多年平均氣溫11—12 ℃，極端最高氣溫41.6 ℃，極端最低氣溫-21.2 ℃；多年平均水面蒸發(fā)量在1200 mm左右；多年平均降雨量約600 mm，年內(nèi)分配不均，多集中在汛期6—9月，約占全年的85%。奧林匹克公園以清河、北小河再生水處理廠的出水為補(bǔ)水水源，并循環(huán)利用，且補(bǔ)水入湖前流經(jīng)南園濕地以改善水質(zhì)。作為奧林匹克南園濕地的子系統(tǒng)之一，植物氧化塘水位梯度約1—2 m之間，兼具好氧塘和厭氧塘的優(yōu)點(diǎn)，塘內(nèi)各個(gè)部分均分布有大量水生植物，主要包括三棱草、蘆葦、香蒲、睡蓮等，集中分布于濕地近岸帶0—10 m處，并形成較為明顯的近岸帶植被分布格局。植被覆蓋度較高，可達(dá)70%—90%。通過植物的凈化作用出水水質(zhì)可以達(dá)到地表Ⅲ類水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002)。

2　材料與方法

2.1樣品采集及DNA提取

2012年6月14日分別從奧林匹克公園南園濕地植物氧化塘基于塘中心到近岸帶設(shè)置東、南、西、北四條樣帶，并在樣帶上依據(jù)不同水位梯度下優(yōu)勢(shì)物種采集濕生植物三棱草(0—1cm水深)、挺水植物蘆葦(約10cm水深)和香蒲(約15cm水深)、浮葉植物睡蓮(約100cm水深)根際土壤樣品，新鮮表面附著基質(zhì)的各植物根際樣品裝入消菌的三角瓶密封，立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理分析。將三棱草、蘆葦、香蒲、睡蓮各根際新鮮泥土通過真空抽濾泵過濾去除水分，濾膜上即留有植物根際微生物樣品，隨后將根際樣品冷凍儲(chǔ)藏于-20 ℃?zhèn)溆?。采用土壤樣品提取試劑?天根生化科技北京有限公司)提取根際樣品總DNA，操作步驟按照使用說明書進(jìn)行。提取總DNA經(jīng)0.8%(m/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定，提取的DNA放置于-20 ℃條件下保存、備用。

2.216S rDNA的PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌引物選用正向引物5′端帶熒光物質(zhì)FAM標(biāo)記的27f(6-FAM-5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)和反向引物1492r(5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT -3′)對(duì)根際樣品進(jìn)行16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系成分(50 μL)包含25 μL 2×Taq PCR Master Mix，2 μL正反向引物，4 μL根際土壤總DNA，17 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)的常規(guī)PCR(95 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃引物延伸1 min)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。熒光PCR產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

2.3末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)分析

采用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ分別對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系成分(20 μL)包含：1 μL內(nèi)切酶，2 μL 10×buffer，10 μL PCR產(chǎn)物，7 μL ddH2O。將體系混勻后，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃反應(yīng)4 h。然后，在65 ℃條件下水浴15 min使限制性內(nèi)切酶失活，終止消化反應(yīng)。之后將消化產(chǎn)物經(jīng)ABI測(cè)序儀掃描檢測(cè)，得到T-RFLP圖譜。

2.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

依據(jù)T-RFLP圖譜文件(選擇末端限制性片段(Terminal restriction fragments T-RFs)在50—660 bp范圍內(nèi)且熒光強(qiáng)度超過100 U的峰[24])運(yùn)用Peak Scanner Software V1.0軟件進(jìn)行分析，將其分析結(jié)果輸入T-REX程序(http://trex.biohpc.org/)進(jìn)行處理，輸出T-RFs類型及相對(duì)豐度的組成矩陣，將每個(gè)T-RF所占的百分比作為權(quán)重輸入Primer 5.0軟件進(jìn)行等級(jí)多元聚類分析及非度量多維標(biāo)度分析(non-metric multidimensional scaling，MDS)?；蚨鄻有灾笖?shù)分析即利用Margale 指數(shù)(S)評(píng)價(jià)物種豐富度，均勻度指數(shù)(J′)計(jì)算均勻度，Shannon-weaver指數(shù)(H′)評(píng)價(jià)細(xì)菌群落綜合多樣性。

基于HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ三種限制性內(nèi)切酶消化的T-RFs類型及相對(duì)豐度組成矩陣，依據(jù)MiCA3(http://mica.ibest.uidaho.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Phylogenetic Assignment Tool(PAT)程序(https://secure.limnology.wisc.edu/trflp/newuser.jsp)比對(duì)分析細(xì)菌菌群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。依據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建基于屬水平的0、1數(shù)據(jù)矩陣(將特定樣品中出現(xiàn)的屬定義為1，未出現(xiàn)的屬定義為0)，從而構(gòu)建了樣品數(shù)×RFs數(shù)(16×4646)的矩陣和樣品數(shù)×屬數(shù)的16×199的原始0、1數(shù)據(jù)矩陣。在數(shù)據(jù)矩陣的基礎(chǔ)上，方差分析采用SPSS 16.0中的ANOVA方法(所有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平指數(shù)P<0.05)。

2.5水質(zhì)檢測(cè)

3　結(jié)果與分析

3.1基于水位梯度的植物根際細(xì)菌群落分類和排序

基于HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ三種酶切的T-RFLP圖譜分類排序結(jié)果見圖1和圖2。聚類分析能反應(yīng)樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似度。從圖1可以看出，基于相似性系數(shù)為50%—55%對(duì)3種酶切結(jié)果分群并類，各酶切結(jié)果均表現(xiàn)為濕生植物三棱草根際細(xì)菌群落、挺水植物蘆葦根際細(xì)菌群落、挺水植物香蒲根際細(xì)菌群落和浮葉植物睡蓮根際細(xì)菌群落四大類。其次，隨不同生態(tài)型植物立地水位梯度加深，其根際細(xì)菌群落相似性降低。不同酶切具有相同的結(jié)論，表明基于T-RFLP的酶切分型效果具有穩(wěn)定性。

圖1　基于T-RFLP圖譜的植物樣品根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析Fig.1　Cluster analysis of plant samples rhizosphere bacterial community structure based on T-RFLP patterns

基于3種酶切的MDS排序圖的壓力系數(shù)均在正常范圍內(nèi)，即配合度適宜。從圖可以看出隨著水位梯度的變化各生態(tài)型植物根際群落細(xì)菌結(jié)構(gòu)具有獨(dú)立的分布范圍。其次，不同生態(tài)型植物根際細(xì)菌群落分布格局及其范圍表現(xiàn)出差異性，具體表現(xiàn)為三棱草因其適應(yīng)干濕交替的水環(huán)境波動(dòng)幅度較大的立地條件而具較寬生態(tài)幅度，在排序圖上具較廣分布格局和范圍；蘆葦和香蒲在挺水界面范圍內(nèi)分布較為集中，在排序圖上具較為相似的分布格局和范圍；睡蓮因其對(duì)水位深度要求較為嚴(yán)格使其在排序圖上表現(xiàn)為較窄的生態(tài)幅度和分布格局?；谂判虻姆治鼋Y(jié)果與分類結(jié)果具一致性。

圖2　植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的MDS分析Fig.2　 MDS analysis of plant rhizosphere bacteria community structure

3.2基于水位梯度的植物根際細(xì)菌群落多樣性分析

3.2.1基于單一酶切的多樣性分析

依據(jù)上述聚類結(jié)果，計(jì)算不同聚類菌群中T-RFs的平均豐度。在此基礎(chǔ)上定義T-RF片段豐度值>4%的類型為優(yōu)勢(shì)菌群，片段豐度值<1%的類型為偶見菌群，其余為非優(yōu)勢(shì)菌群[25]。采用多樣性指數(shù)、片段數(shù)和片段豐度3種指標(biāo)描述基于水位梯度的植物根際細(xì)菌群落多樣性變異(表1)，并對(duì)其分析結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。從表中多樣性指數(shù)變化趨勢(shì)可以看出，隨水位梯度加深各植物根際細(xì)菌群落物種豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)、多樣性指均呈遞減趨勢(shì)。結(jié)合不同菌群片段數(shù)和片段豐度和可知睡蓮根際細(xì)菌群落不僅具有最豐富優(yōu)勢(shì)菌群片段數(shù)和最高優(yōu)勢(shì)菌群豐度和，而且具有最低的偶見菌群片段數(shù)和最低偶見菌群豐度和，二者綜合作用使得睡蓮根際細(xì)菌群落具最低均勻度指數(shù)。三棱草根際細(xì)菌群落因其具最低優(yōu)勢(shì)菌群片段數(shù)和較高偶見菌群片段數(shù)使其具最高群落均勻度指數(shù)。不同酶切類型相比較，MspⅠ較其它兩種酶切類型對(duì)基于水位梯度的多樣性變化更為敏感；不同多樣性表征參數(shù)相比較，多樣性指數(shù)較片段數(shù)及片段豐度和對(duì)基于水位梯度的多樣性變化更為敏感；不同多樣性指數(shù)相比較，對(duì)基于水位梯度多樣性變化的敏感程度依次為物種豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和綜合多樣性指數(shù)的減小趨勢(shì)。

表1　HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ三種單一酶切的植物根際細(xì)菌群落多樣性分析

平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；不同字母表示處理間差異顯著性(P<0.05)

3.2.2基于多酶切綜合比對(duì)的多樣性分析

為進(jìn)一步檢驗(yàn)分析基于水位梯度的植物根際細(xì)菌群落多樣性的變異規(guī)律，以樣品數(shù)×RFs數(shù)(16×4646)數(shù)據(jù)矩陣為原始數(shù)據(jù)得到各植物根際可培養(yǎng)細(xì)菌與非培養(yǎng)細(xì)菌的酶切組合RFs結(jié)果(表2)。從表中RFs組合數(shù)在不同RFs組成類型和水位梯度控制下的不同植物類型條件下具顯著差異，其中基于3種酶切的PAT比對(duì)RFs組合數(shù)量隨水位梯度變異呈顯著的變化趨勢(shì)，即近岸帶的濕生植物根際細(xì)菌RFs豐富度最高，由挺水植物向浮葉植物過度過程中植物根際細(xì)菌RFs豐富度呈減少趨勢(shì)。依據(jù)可培養(yǎng)和非培養(yǎng)對(duì)3種酶切的PAT比對(duì)RFs組合進(jìn)行菌種劃分，采用ANOVA分析可以看出基于水位梯度變化的植物根際細(xì)菌群落多樣性變化主要是由植物根際可培養(yǎng)細(xì)菌RFs片段數(shù)的差異引起(P<0.05)；其次基于T-RFLP分析中可培養(yǎng)RFs片段數(shù)占到總細(xì)菌RFs片段數(shù)量4%—10%，符合可培養(yǎng)細(xì)菌種類低于細(xì)菌總量1%—10%的研究結(jié)果，進(jìn)一步證明了基于T-RFLP方法本試驗(yàn)結(jié)果的可靠性?；诙嗝盖芯C合多樣性分析結(jié)果可客觀的反應(yīng)基于水位梯度變異的濕地植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律。

表2　基于水位梯度植物根際細(xì)菌RFs組合數(shù)量

3.3基于水位梯度變異的植物根際細(xì)菌群落組成特征分析

3.3.1基于水位梯度變異的濕地植物根際菌群差異分析

(1)基于門水平的植物根際菌群差異分析

為進(jìn)一步分析基于門水平的不同水位梯度下的植物根際細(xì)菌群落多樣性變異特征，以樣品數(shù)×屬數(shù)(16×199)矩陣和樣品數(shù)×RFs數(shù)(16×4646)數(shù)據(jù)矩陣為原始數(shù)據(jù)，采用ANOVA分析對(duì)基于屬數(shù)的門水平的細(xì)菌豐富度進(jìn)行差異檢驗(yàn)。屬的結(jié)果表明Beta、Alpha、Gamma變形桿菌綱(β、α、γ-Proteobacteria)在不同水位梯度條件下由岸邊向塘中心呈遞減趨勢(shì)(P<0.01)，其余門類不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變異特征。RFs數(shù)的結(jié)果表明Beta變形桿菌綱(β-Proteobacteria)在不同水位梯度條件下由岸邊向塘中心呈現(xiàn)相應(yīng)減少趨勢(shì)(P<0.01)，其余門類不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變異特征?；赗Fs數(shù)的門水平的細(xì)菌豐富度的差異檢驗(yàn)與屬數(shù)的分析結(jié)果具有部分相似的變化趨勢(shì)，但后者分辨率低于前者。β-Proteobacteria細(xì)菌豐富度較其余門類差異性極顯著，包括多種好氧或兼性細(xì)菌。

圖3　不同水位梯度下基于屬數(shù)(a)和RFs數(shù)(b)的門水平的植物根際細(xì)菌群落多樣性條形圖Fig.3　Diversity of plant rhizosphere bacterial communities in different water level gradients based on the genus numbers (a) and RFs numbers (b) ▲▲和●●分別為圖a和圖b中不同水位梯度下基于門水平的同一菌群在不同植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中的極顯著差異(0.01)分布

(2) 基于屬水平的植物根際菌群差異分析

基于RFs片段數(shù)的屬水平的菌群豐富度進(jìn)行差異檢驗(yàn)，結(jié)果表明不同水位梯度條件下Beta變形菌綱(β-Proteobacteria)中具有顯著差異的屬為產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)(P<0.01)、伯克氏菌屬(Burkholderia)(P<0.01)、無色桿菌屬(Achromobacter)(P<0.01)、戴爾福特菌屬(Delftia)(P=0.043)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)(P<0.01)、草螺菌屬(Herbaspirllum)(P=0.027)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)(P<0.01)、Pelomonas(P=0.019)，且顯著差異的屬數(shù)隨水位梯度增加呈減少趨勢(shì)，其余門類中不具顯著差異屬。

圖4　不同水位梯度下植物根際細(xì)菌群落中Beta變形桿菌綱的菌屬多樣性條形圖Fig.4　Bar graph showing β-Proteobacteria species diversity of plant rhizosphere bacteria community based on water level gradient▲▲和▲分別為不同水位梯度下基于屬水平的同一菌群在不同植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中的極顯著差異(0.01)分布和顯著差異(0.05)分布

3.3.2基于優(yōu)勢(shì)屬的植物根際細(xì)菌菌群組成特征分析

依據(jù)HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ三種酶切優(yōu)勢(shì)片段，以T-RF片段豐度>4%的類型為優(yōu)勢(shì)菌群，篩選出不同水位梯度下的植物根際細(xì)菌菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬(表3)。從表中看出，不同水位梯度下各植物根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬呈現(xiàn)數(shù)量差異，其中近岸帶濕生植物三棱草根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量少為3種，低于深水位其余植物根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量，蘆葦根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量最多，同時(shí)各植物根際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬呈現(xiàn)類型差異，產(chǎn)堿桿菌屬和黃桿菌屬(Flavobacterium)為4種植物根際細(xì)菌群落的共有優(yōu)勢(shì)屬，伯克氏菌屬為除睡蓮之外3種植物根際細(xì)菌菌群的優(yōu)勢(shì)屬，而節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)為除3棱草之外3種植物根際細(xì)菌菌群的優(yōu)勢(shì)屬。由于環(huán)境因素或植物根系差異導(dǎo)致了蘆葦和睡蓮根際細(xì)菌菌群中紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)和 二氧化碳嗜纖維菌屬(Capnocytophaga)等特有屬的出現(xiàn)。

表3　不同水位梯度下植物根際細(xì)菌群落可能優(yōu)勢(shì)屬

+優(yōu)勢(shì)屬；-未出現(xiàn)

3.4基于水位梯度的植物根際細(xì)菌群落與水質(zhì)狀況的響應(yīng)關(guān)系

表4　研究區(qū)主要水質(zhì)指標(biāo)及水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

4　討論

4.1水位梯度控制下植物根際細(xì)菌群落多樣性差異分析

本試驗(yàn)采用T-RFLP技術(shù)結(jié)合單一酶切及綜合酶切結(jié)果分析不同水位深度的4種典型植物的根際細(xì)菌群落多樣性差異，基于ANOVA方法檢測(cè)表明基于水位梯度變化各植物根際細(xì)菌群落間多樣性差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)結(jié)果顯示，基于單一酶切不同植物間根際細(xì)菌群落的物種豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)及綜合多樣性指數(shù)均存在一定差異；綜合3種酶切可見濕生植物三棱草根際細(xì)菌群落中菌種數(shù)量、屬數(shù)量及門數(shù)量最多，其次為挺水植物蘆葦和香蒲，睡蓮所占數(shù)量最少。導(dǎo)致此差異結(jié)果的主要因素與水位深度、植物種類、根系泌氧及根際分泌物等生態(tài)因子有關(guān)[28]。

4.1.1水位深度對(duì)植物根際細(xì)菌群落多樣性差異影響

水位深度決定了植物生長(zhǎng)分布格局[29]，而不同植物類型的根際微生物多樣性會(huì)有所不同，本試驗(yàn)中三棱草、蘆葦、香蒲和睡蓮根際細(xì)菌群落多樣性指數(shù)、T-RFs數(shù)量及相對(duì)豐度均存在一定差異。封曄等通過T-RFLP方法對(duì)神木縣六道溝流域8種植物根際細(xì)菌群落多樣性的研究結(jié)果表明，8種植物根際細(xì)菌數(shù)量和大小均表現(xiàn)出一定差異[30]。趙慶節(jié)等采用PCR-DGGE方法對(duì)不同植物人工濕地土壤微生物特性研究同樣指出蘆葦與香蒲根際土壤微生物多樣性存在差異，且蘆葦高于香蒲[31]。同時(shí)水位條件直接影響水中基質(zhì)氧的可利用率、氣體擴(kuò)散率[32]，進(jìn)而影響植物根系的生長(zhǎng)及微生物活性。隨水位深度增加，基質(zhì)中含氧量減少，降低了水體及基質(zhì)中有機(jī)污染物降解效率[33]，導(dǎo)致有機(jī)負(fù)荷的相對(duì)增加帶來微生物多樣性的減少[34]，本文4種植物中三棱草根際細(xì)菌群落多樣性最豐富，可能由于三棱草地處干濕交替的水分環(huán)境，人工基質(zhì)疏松，含氧量充足，有助于提高植物根際氧氣利用率，促進(jìn)基質(zhì)中硝化作用與反硝化作用的偶聯(lián)，加速營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解，減少基質(zhì)中有機(jī)負(fù)荷，增加細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖速率，促使其根際細(xì)菌多樣性增加。馮勝等認(rèn)為細(xì)菌群落多樣性與水體營(yíng)養(yǎng)水平呈負(fù)相關(guān)性[35]。同理可解釋隨水位深度增加，蘆葦、香蒲、睡蓮根際細(xì)菌多樣性在屬水平上呈減少趨勢(shì)。武鈺坤等對(duì)人工濕地蘆葦和香蒲根際微生物群落多樣性的研究結(jié)果表明，蘆葦根際微生物具有最多的常見物種及最大的物種均勻性[36]?？梢姡簧疃茸兓瘯?huì)通過影響植物類型及飽和基質(zhì)的含氧量來改變微生物活性[32]，間接影響濕地植物間根際環(huán)境細(xì)菌群落多樣性。

4.1.2水位梯度控制下植物根際微環(huán)境對(duì)其根際細(xì)菌群落多樣性差異影響

根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性受宿主植物的影響，可能是由于不同植物類型形成獨(dú)特的根際微環(huán)境，如植物根際泌氧、分泌物等對(duì)細(xì)菌具有趨化、富集作用[37]，會(huì)導(dǎo)致不同植物間根際細(xì)菌群落種類及數(shù)量的變化，使微生物多樣性與宿主植物呈現(xiàn)專一性[30]。本文中基于水位梯度植物根際細(xì)菌RFs組合數(shù)量，濕生植物三棱草綜合種的數(shù)量最多，其次為挺水植物蘆葦和香蒲，睡蓮最少。原因是濕地植物具有根系生物量大及通氣組織發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，增加植物根在飽和基質(zhì)中的輸氧能力。植物根際泌氧在根際還原態(tài)介質(zhì)中形成氧化態(tài)的區(qū)域環(huán)境[38]，促使根際形成好氧微生物生存的微氧環(huán)境[39]。根際泌氧能力與植物根系生物量及通氣組織呈正相關(guān)關(guān)系[40-41]，且根際泌氧速率因不同植物種類存在差異，導(dǎo)致植物根際土壤性質(zhì)發(fā)生明顯變化[6,42]，從而形成根際微生物群落多樣性差異。研究表明，5月份和8月份蘆葦根系生物量增幅均高于香蒲[43]，且蘆葦?shù)拿谘跄芰Ω哂谙闫裑44]，同時(shí)根莖型濕地植物根系生物量顯著高于須根型濕地植物[45]，由此進(jìn)一步說明，三棱草、蘆葦(根莖型)根際細(xì)菌群落屬數(shù)量及門數(shù)量均高于香蒲、睡蓮(須根型)。

基于屬水平的植物根際細(xì)菌群落間存在一定差異，顯著差異屬主要包括產(chǎn)堿桿菌屬、伯克氏菌屬、無色桿菌屬、戴爾福特菌屬、紫色桿菌屬、草螺菌屬、羅爾斯通氏菌屬和Pelomonas，其中產(chǎn)堿桿菌屬為專性好氧，紫色桿菌屬為兼性好氧，伯克氏菌屬、羅爾斯通菌屬為好氧，其它均為微好氧[46]，這些屬的分布程度均隨水位梯度加深呈遞減趨勢(shì)，且均與植物根泌氧能力呈正相性。不同水位梯度下植物根際細(xì)菌群落可能優(yōu)勢(shì)屬產(chǎn)堿桿菌屬、黃桿菌屬、伯克氏菌屬及節(jié)桿菌屬均以好氧菌為主，符合人工濕地優(yōu)勢(shì)屬的分布特征[47]。

植物根際分泌的有機(jī)、無機(jī)化合物是刺激根際微生物繁殖的重要能源和養(yǎng)分源[5]，其中脂肪族和芳香族的碳?xì)浠衔铩被峒疤穷愇镔|(zhì)的改變會(huì)直接影響根際分泌物的種類和數(shù)量，間接影響不同植物根際間微生物的種類及數(shù)量[48]，且細(xì)菌較真菌、放線菌等對(duì)植物根際分泌物具更高的敏感性及利用率[7]。植物根際分泌物對(duì)根際微生物的作用是松散的、非特異性的，主要是促進(jìn)革蘭氏陰性無芽胞桿菌在根際的聚積[49]，本文中各植物根際優(yōu)勢(shì)屬產(chǎn)堿桿菌屬和黃桿菌屬均為革蘭氏陰性無芽胞桿菌[50]，且隨水位梯度加深呈豐富度減少趨勢(shì)。產(chǎn)堿桿菌屬可利用不同有機(jī)酸和氨基酸作為碳源，伯克氏菌屬可氧化分解單糖、雙糖、多糖，并可利用作為唯一碳源。唐利等利用連續(xù)收集裝置對(duì)蘆葦和香蒲根際分泌物比較分析結(jié)果表明，香蒲根際微生物數(shù)量多于蘆葦[51]。不同水位梯度植物根際優(yōu)勢(shì)屬出現(xiàn)共性及細(xì)菌群落相似性特征，這可能與該4種植物間根際微環(huán)境的相似性，促使其根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相似性。

4.2濕地植物根際細(xì)菌群落組成特征與水環(huán)境質(zhì)量的關(guān)系

5　結(jié)論

本研究采用T-RFLP技術(shù)分析水位梯度控制下濕地植物根際細(xì)菌群落多樣性特征，并結(jié)合ANOVA解釋了植物間根際細(xì)菌群落多樣性差異，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析得出：(1)文中選取HhaⅠ、MspⅠ、RsaⅠ三種不同酶切產(chǎn)生結(jié)果一致，均為隨水位梯度加深各植物生態(tài)幅逐漸變窄，根際細(xì)菌群落多樣性逐漸減少，且基于3種酶切的PAT比對(duì)RFs組合數(shù)量隨水位梯度變化呈相應(yīng)變化趨勢(shì)，其差異結(jié)果主要是由植物根際可培養(yǎng)細(xì)菌RFs片段數(shù)的變異引起。(2)不同水位梯度控制下各生態(tài)型植物根際的Beta變形桿菌綱中屬水平的菌群豐富度隨水位梯度增加而減少，且差異性顯著，產(chǎn)堿桿菌屬、伯克氏菌屬、無色桿菌屬、戴爾福特菌屬、紫色桿菌屬、草螺菌屬、羅爾斯通氏菌屬和Pelomonas均為好氧菌，其豐富度可能與各植物根系泌氧能力密切相關(guān)。濕生植物泌氧能力最強(qiáng)的三棱草根際屬水平的菌群豐富度最高，其次為蘆葦、香蒲，最少為睡蓮。(3)水位梯度控制下四種植物根際細(xì)菌群落的多數(shù)優(yōu)勢(shì)屬屬于變形桿菌門，是脫氮除磷的功能性菌門，其中產(chǎn)堿桿菌屬和黃桿菌屬為四種植物根際細(xì)菌共同優(yōu)勢(shì)屬，在碳氮循環(huán)中起重要作用，有助于人工濕地水體凈化。

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Analysis of the characteristics of rhizosphere bacterial diversity from plants with different water level gradients based on T-RFLP

ZHANG Qiongqiong, HUANG Xingru, GUO Xiaoyu*

CollegeofResourcesEnvironmentandTourism,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China

To elucidate rhizosphere bacterial diversity from plants with different water level gradients, we examined bacterial diversity in Beijing Olympic Park plant oxidation pond, an artificial wetland. The rhizosphere bacterial diversities forCarexphacotaspr.,Phragmitescommunis,Typhaorientalis, andNymphaeatetragonagrown in plants with different water levels were compared based on terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis combined with analysis of variance (ANOVA). Our results showed that rhizosphere bacterial diversity decreased with increasing water levels. Different restriction enzymes, i.e.,HhaI,MspI, andRsaI, yielded the same digestion results. By combing results from digestion with these three restriction enzymes, RF combination numbers from PAT alignment also decreased with increasing water levels, consistent with the results of single restriction enzyme digestion. Further analysis showed that RF numbers in cultured rhizosphere bacteria changed significantly with the increase in water level; in contrast, the RF numbers of uncultured bacteria did not change significantly. Under different water gradients,β-Proteobacteriaexhibited the most significant variations among the four plants, possibly because the increase in water level may have reduced the abilities of the different plants to secrete oxygen, thereby affecting the survival of plant rhizosphere aerobic bacteria. The triangular had the highest number of rhizosphere bacterial genera, followed by reeds, cattails, and finally water lilies. The abundances of the aerobic bacteriaAlcaligenessp.,Burkholderiasp.,Achromobactersp.,Delftiasp.,Janthinobacteriumsp.,Herbaspirllumsp.,Ralstoniasp., andPelomonassp. were probably related to the capacity of plant roots to secrete oxygen. Moreover, the oxygen-secreting capacity of rhizospheres and root exudates varied because wetland plants with different water level gradients exhibited different growth conditions and metabolic activities, affecting rhizosphere bacteria growth and reproduction. The most dominant organisms in the rhizosphere bacterial communities of these four plants wereProteobacteria, which function in the removal of nitrogen and phosphorus. The common dominant genera among these rhizosphere bacteria wereAlcaligenesandFlavobacterium, which play important roles in carbon and nitrogen cycles and contribute to wetland water purification.

water level gradient; wetland plant; bacterial diversity; T-RFLP

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(40901281)；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201310028012)

2014-12-18;

2015-06-15

Corresponding author.E-mail: xiaoyucnu@126.com

10.5846/stxb201412182516

張瓊瓊， 黃興如， 郭逍宇.基于T-RFLP技術(shù)的不同水位梯度植物根際細(xì)菌群落多樣性特征分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(14):4518-4530.

Zhang Q Q, Huang X R, Guo X Y.Analysis of the characteristics of rhizosphere bacterial diversity from plants with different water level gradients based on T-RFLP.Acta Ecologica Sinica,2016,36(14):4518-4530.