宋　飏，黃　原

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安　710062

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DNA復(fù)合條形碼在太白山土壤動(dòng)物多樣性研究中的應(yīng)用

宋飏，黃原*

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安710062

DNA復(fù)合條形碼技術(shù)(metabarcoding)將DNA條形碼與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，快速便捷地鑒定群落混合樣本中的物種，成為監(jiān)測(cè)群落中物種組成和豐富度的可靠方法。采用這一方法分析了秦嶺太白山5種不同生境的中小型土壤動(dòng)物多樣性，共得到土壤動(dòng)物3門(mén)9綱28目199科。群落組成分析顯示生境的變化對(duì)土壤動(dòng)物群落組成有一定的影響。α多樣性分析顯示土壤動(dòng)物群落豐富度指數(shù)最高的生境為針葉林，最低的為農(nóng)田；土壤動(dòng)物群落多樣性指數(shù)最高的生境為針葉林，最低的為落葉小葉林。群落相似性分析顯示高山草甸、針葉林和農(nóng)田3種生境的土壤動(dòng)物群落組成相似性較高，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動(dòng)物群落組成與這3種生境的差異較大，落葉小葉林與落葉闊葉林的土壤動(dòng)物群落組成差異也較大。

DNA復(fù)合條形碼；太白山；土壤動(dòng)物；生物多樣性

DNA復(fù)合條形碼技術(shù)(metabarcoding)是一種結(jié)合了DNA條形碼技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的快速鑒定混合樣本中物種的方法[1-3]。DNA條形碼技術(shù)通過(guò)一段短的DNA序列來(lái)鑒定物種，由Hebert等人于2003年提出[4]。傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序只能對(duì)單一的DNA分子進(jìn)行測(cè)序，而高通量測(cè)序技術(shù)可以分別對(duì)混合DNA中的每一條DNA分子進(jìn)行測(cè)序。兩種技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用可以獲得混合樣本中大量的含有分類(lèi)學(xué)信息的DNA片段的序列，然后將這些序列與合適的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)即可確定其代表的類(lèi)群。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展與分析軟件的不斷完善，在分析生物多樣性時(shí)，DNA復(fù)合條形碼技術(shù)可以作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的一個(gè)選擇[2-3]。

DNA復(fù)合條形碼技術(shù)已普遍使用于微生物群落的研究，并且正越來(lái)越多的應(yīng)用到動(dòng)植物多樣性研究中[1,5]。在土壤動(dòng)物方面：Douglas等人構(gòu)建了7個(gè)節(jié)肢動(dòng)物群落，通過(guò)對(duì)這些節(jié)肢動(dòng)物群落的DNA復(fù)合條形碼研究證明了該方法可以精確估計(jì)群落內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育多樣性和群落間的差異性[2]；Bienert等人對(duì)2個(gè)不同地點(diǎn)的土壤樣品進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這一方法能很好地區(qū)分這2個(gè)地點(diǎn)的蚯蚓群落組成，并且與使用傳統(tǒng)方法得到的結(jié)果一致[6]；Yang等人對(duì)基于該技術(shù)分析土壤小型動(dòng)物多樣性的3種數(shù)據(jù)處理流程進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明3種流程的處理結(jié)果基本一致[7]；魏攀利用該技術(shù)對(duì)小五臺(tái)山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)1m2草地中無(wú)脊椎動(dòng)物多樣性進(jìn)行了研究，共調(diào)查得到125種無(wú)脊椎動(dòng)物[8]；Yang等人使用該方法對(duì)采自土壤和落葉層的樣本與采自地上的樣本進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，在研究生物多樣性格局時(shí)，兩類(lèi)樣本可以得到相似的生態(tài)學(xué)信息[9]。此外，還有許多關(guān)于土壤線蟲(chóng)的研究[10-12]。

目前, 科學(xué)界已經(jīng)認(rèn)識(shí)到土壤是地球上生物多樣性最豐富的生境之一[13]。雖然土壤生物多樣性的研究已有很長(zhǎng)時(shí)間，但是，關(guān)于土壤生物多樣性本身的很多基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題仍然不清楚。從某種意義上說(shuō)，對(duì)土壤生物多樣性的研究還處于初期階段[14]。

我國(guó)對(duì)土壤動(dòng)物的研究主要集中在東北、亞熱帶地區(qū)、熱帶雨林地區(qū)以及新疆地區(qū)，對(duì)于中西部地區(qū)的土壤動(dòng)物研究還很少[15-16]。太白山為秦嶺主峰，位于動(dòng)物古北界與東洋界的交匯和過(guò)渡地帶，是華北、華中和橫斷山脈3個(gè)植物區(qū)系的交匯處，自然植被帶完整，生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多樣，生物資源豐富，在海拔3400m以上存有完整的第四紀(jì)古冰川遺跡，是一個(gè)保存完好的自然生態(tài)系統(tǒng)，是我國(guó)生物多樣性保護(hù)的關(guān)鍵區(qū)域[17]。

本文選取18S核糖體小亞基RNA(18S rRNA)基因和細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因的部分序列作為分子標(biāo)記，應(yīng)用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)對(duì)秦嶺太白山地區(qū)5種不同生境(高山草甸，針葉林，落葉小葉林，落葉闊葉林，農(nóng)田)的中小型土壤動(dòng)物多樣進(jìn)行研究，并討論該方法目前應(yīng)用于中小型土壤動(dòng)物研究的優(yōu)缺，為進(jìn)一步探討秦嶺中小型土壤動(dòng)物多樣性格局以及秦嶺生物多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1　研究方法

1.1樣本的采集和分離

于2014年6月上旬在太白山自然保護(hù)區(qū)及周?chē)x取高山草甸、針葉林、落葉小葉林、落葉闊葉林和農(nóng)田5種生境進(jìn)行取樣。每種生境選取10m×10m的3個(gè)樣方，在每個(gè)樣方內(nèi)隨機(jī)采取3份土樣，采樣深度為0—15cm。將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，用Tullgren漏斗進(jìn)行分離(40W白熾燈分離48 h)。將收集到的土壤動(dòng)物保存在100%乙醇中，用于總DNA的提取。樣地詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1　樣地詳細(xì)信息

*采樣時(shí)該地點(diǎn)GPS無(wú)法定位

1.2總DNA提取

將一個(gè)樣方分離到的所有土壤動(dòng)物混合放入一個(gè)1.5mL離心管，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)進(jìn)行總DNA提取，得到15份總DNA。將每種生境的3份總DNA進(jìn)行等濃度混合，得到用于后續(xù)PCR的5份總DNA。

1.3PCR及測(cè)序

PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 12.5μL，滅菌超純水9.5μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1.0μL，總DNA 1.0μL。

18S rRNA基因部分序列(大約350bp)的擴(kuò)增使用正向引物#3：5′-GYGGTGCATGGCCGTTSKTRGTT-3′和反向引物#5_RC：5′-GTGTGYACAAAGGBCAGGGAC-3′[18]。為了同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，在每個(gè)樣本的正向引物5′端加上了7bp的barcode序列，用于后續(xù)分析中區(qū)分序列來(lái)自哪個(gè)樣本。PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?5℃ 10min；10個(gè)循環(huán)：95℃ 10s，57℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 60s；30個(gè)循環(huán)：95℃ 10s，55℃ 30s，75℃ 60s；最后在72℃下延長(zhǎng)5min。

COI基因部分序列(大約313bp)的擴(kuò)增使用正向引物mlCOlintF：5′-GGWACWGGWTGAACWGT WTAYCCYCC-3′[19]和反向引物jgHCO2198：5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′[20](用N替換了原序列中的I)。同樣在每個(gè)樣本的正向引物5′端加上了7bp的barcode序列。PCR的循環(huán)程序?yàn)椋?6個(gè)循環(huán)：95℃ 10s，62℃ 30s(每個(gè)循環(huán)降低1℃)，72℃ 60s；25個(gè)循環(huán)：95℃ 10s，46℃ 30s，72℃ 30s；最后在72℃下延長(zhǎng)5min。

每份總DNA擴(kuò)增3次，然后將3份PCR產(chǎn)物等濃度混合。PCR產(chǎn)物的測(cè)序使用Illumina MiSeq平臺(tái)，采用250PE測(cè)序策略，由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4數(shù)據(jù)處理

1.4.1原始數(shù)據(jù)處理

步長(zhǎng)為1的5bp窗口從序列起始位置開(kāi)始滑動(dòng)，要求窗口中堿基平均質(zhì)量≥Q20，低于該值則截?cái)嘈蛄小Ｈ缓笫褂肍LASH(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)對(duì)通過(guò)質(zhì)量過(guò)濾的序列進(jìn)行拼接。使用Qiime[21]對(duì)拼接后的序列進(jìn)一步過(guò)濾，舍棄含有N堿基、長(zhǎng)度<150bp、barcode有錯(cuò)配和引物錯(cuò)配堿基數(shù)>1的序列。使用mothur[22]去除嵌合體序列，得到用于后續(xù)分析的序列。

1.4.2OTU聚類(lèi)及注釋

使用Qiime將序列按相似度0.97聚類(lèi)為OTU(Operational Taxonomic Unit)[23]，選取每個(gè)OTU最長(zhǎng)的序列作為代表序列。將18S rRNA基因和COI基因的OTU代表序列分別與Silva[24]數(shù)據(jù)庫(kù)(115版)和BOLD[25]數(shù)據(jù)庫(kù)(截止到Release 5.00-v1)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU的分類(lèi)學(xué)信息。使用兩個(gè)標(biāo)記的OTU列表生成物種列表，然后合并，刪去不屬于土壤動(dòng)物的類(lèi)群。使用Excel繪制目水平上的群落組成百分比堆積圖。使用R軟件VennDiagram程序包繪制Venn圖。

1.4.3α多樣性分析

使用R軟件vegan程序包對(duì)各樣本的Chao1豐富度指數(shù)，ACE豐富度指數(shù)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.4.4群落相似性分析

使用R軟件vegan程序包對(duì)各樣本之間的Bray-Curtis距離進(jìn)行計(jì)算，然后使用ape程序包基于Bray-Curtis距離對(duì)樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis; PCoA)。

1.4.5 聚類(lèi)分析

根據(jù)物種列表，使用R軟件pheatmap程序包將科水平上的分類(lèi)信息進(jìn)行聚類(lèi)分析并繪制Heatmap圖。

圖1　各樣本在科水平的Venn圖Fig.1　Venn diagram for families of samplesA: 高山草甸represents alpine meadow，B: 針葉林represents coniferous forest，C: 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D: 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農(nóng)田represents farmland

2　結(jié)果

2.1原始數(shù)據(jù)處理與OTU聚類(lèi)

經(jīng)最初的質(zhì)量過(guò)濾與拼接后得到611959序列，其中18S rRNA基因309167條，COI基因302792條。經(jīng)Qiime與mothur進(jìn)一步過(guò)濾后得到用于后續(xù)分析的序列，共437313條，其中18S rRNA基因211436條，COI基因225877條。合格序列聚類(lèi)后，18S rRNA基因共得到1653個(gè)OTU，COI基因共得到2138個(gè)OTU。

2.2種類(lèi)組成

本文的土壤動(dòng)物分類(lèi)參照《中國(guó)土壤動(dòng)物檢索圖鑒》[26]。調(diào)查共鑒定到土壤動(dòng)物3門(mén)9綱28目199科，其中18S rRNA基因鑒定到2門(mén)8綱23目101科，COI基因鑒定到3門(mén)7綱16目128科，兩者共同鑒定到2門(mén)6綱12目31科。高山草甸包含21目136科，針葉林包含20目141科，落葉小葉林包含21目122科，落葉闊葉林包含21目138科，農(nóng)田包含23目132科。各樣本所包含的類(lèi)群及各類(lèi)群在各樣本中所含序列條數(shù)見(jiàn)附表。

對(duì)各樣本做Venn圖(圖1)可得，各樣本在科水平共有的類(lèi)群數(shù)為84，在高山草甸、針葉林、落葉小葉林、落葉闊葉林、農(nóng)田各自總類(lèi)群數(shù)中所占比例分別為61.76%、59.57%、68.85%、60.87%、63.64%。高山草甸獨(dú)有的類(lèi)群數(shù)為9，占其總類(lèi)群數(shù)6.62%；針葉林獨(dú)有的類(lèi)群數(shù)為13，占其總類(lèi)群數(shù)9.22%；落葉小葉林獨(dú)有的類(lèi)群數(shù)為7，占其總類(lèi)群數(shù)5.74%；落葉闊葉林獨(dú)有的類(lèi)群數(shù)為10，占其總類(lèi)群數(shù)7.25%；農(nóng)田獨(dú)有的類(lèi)群數(shù)為7，占其總類(lèi)群數(shù)5.30%。

圖2　目水平上各類(lèi)群的序列豐度在各樣本中所占的百分比　Fig.2　Percentage of sequence aboundance of taxa for order in each sanple

如圖2所示，在目水平上，真螨目、彈尾目和蜘蛛目的豐度在各個(gè)樣本中都較高，其中蜘蛛目在落葉小葉林中所占比例達(dá)64.62%。鱗翅目在高山草甸、針葉林和農(nóng)田中的豐度較高，而在落葉小葉林和闊葉林中豐度較低。半翅目在高山草甸、針葉林和落葉小葉林中豐度較高，而在落葉闊葉林和農(nóng)田中豐度較低。雙尾目在落葉闊葉林中所占比例達(dá)61.04%，而在其他生境中含量較低。條馬陸目在針葉林中含量較高，鞘翅目在農(nóng)田中含量較高。其余類(lèi)群在各生境中含量均較低。

2.3α多樣性分析

各生境的土壤動(dòng)物群落Chao1豐富度指數(shù)為：針葉林>落葉小葉林>落葉闊葉林>高山草甸>農(nóng)田；ACE豐富度指數(shù)為：針葉林>落葉闊葉林>高山草甸>落葉小葉林>農(nóng)田；Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為：針葉林>高山草甸>農(nóng)田>落葉闊葉林>落葉小葉林；Simpson多樣性指數(shù)為：針葉林>高山草甸>農(nóng)田>落葉闊葉林>落葉小葉林。各生境多樣性指數(shù)見(jiàn)表2。

2.4群落相似性分析

Bray-Curtis距離可以作為衡量群落間相似性的指標(biāo)，Bray-Curtis距離越小，表示兩個(gè)樣本的群落組成越相似。表3為各樣本之間的Bray-Curtis距離。根據(jù)各樣本之間的Bray-Curtis距離，可以做PCoA分析。樣本的相似性越高，它們?cè)赑CoA圖中的距離就越近。圖3為根據(jù)各樣本間的Bray-Curtis距離，選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合所做的PCoA圖。圖3顯示土壤動(dòng)物群落組成在高山草甸、針葉林、農(nóng)田3種生境中的相似性較高，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動(dòng)物群落組成與這3種生境的相似性較低，落葉小葉林與落葉闊葉林之間的土壤動(dòng)物群落組成相似性也較低。

表2　各生境多樣性指數(shù)

2.5聚類(lèi)分析

Heatmap圖可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以顏色的深淺表示出來(lái)，同時(shí)可根據(jù)需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行物種或樣本間的相似性聚類(lèi)。圖4為使用歐式距離和最長(zhǎng)聚類(lèi)法所作的Heatmap圖，展現(xiàn)了科水平各類(lèi)群在各樣本中的豐度分布，同時(shí)也在科水平對(duì)各樣本進(jìn)行了聚類(lèi)?？梢钥吹?，高山草甸與針葉林首先聚類(lèi)，然后與農(nóng)田聚類(lèi)，然后與落葉闊葉林聚類(lèi)，最后與落葉小葉林聚類(lèi)。

表3　各樣本之間的Bray-Curtis距離

圖3　PCoA分析Fig.3　PCoA analysis　A: 高山草甸 represents alpine meadow，B: 針葉林represents coniferous forest，C: 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D: 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農(nóng)田represents farmland

圖4　 聚類(lèi)分析Heatmap圖Fig.4　 Heatmap of cluster analysisA： 高山草甸represents alpine meadow，B： 針葉林represents coniferous forest，C： 落葉小葉林represents deciduous small-leaved forest，D： 落葉闊葉林represents deciduous broad-leaved forest，E: 農(nóng)田represents farmland

3　結(jié)論與討論

從類(lèi)群列表來(lái)看，兩個(gè)分子標(biāo)記鑒定到的類(lèi)群沒(méi)有完全重疊，兩者共同鑒定到的類(lèi)群只有31科。而18S rRNA基因單獨(dú)鑒定到70科，COI基因單獨(dú)鑒定到97科，遠(yuǎn)大于它們共同鑒定到的類(lèi)群數(shù)。即使是在目水平上，兩者鑒定到的類(lèi)群也有很大的區(qū)別。這是由于不同分子標(biāo)記的通用引物在不同類(lèi)群中的擴(kuò)增能力不同與數(shù)據(jù)庫(kù)的覆蓋度不同造成的[18-19,27]。因此單獨(dú)使用一種分子標(biāo)記來(lái)鑒定樣本中含有的類(lèi)群會(huì)造成對(duì)類(lèi)群數(shù)的低估，同時(shí)使用多種分子標(biāo)記可以更全面的鑒定樣本中所含類(lèi)群[10,28]?？紤]到數(shù)據(jù)庫(kù)的可用性，對(duì)于后生動(dòng)物來(lái)說(shuō)，較好的分子標(biāo)記有COI、18S rRNA和28S rRNA基因[18,25,29-30]。

盡管采樣地點(diǎn)的海拔跨度高達(dá)2500m以上，生境類(lèi)型發(fā)生了劇烈的變化，但從各樣本群落組成來(lái)看，在目水平，真螨目、彈尾目和蜘蛛目在各生境中所占的比例都較大，在科水平，5種生境的共有類(lèi)群達(dá)84種，在各生境類(lèi)群數(shù)中所占比例大多超過(guò)60%(在針葉林中為59.57%)，這表明太白山中小型土壤動(dòng)物中大多數(shù)類(lèi)群為廣布類(lèi)群。另外，各生境均含有類(lèi)群數(shù)低于10%的特有類(lèi)群，表明海拔與生境的變化會(huì)對(duì)太白山中小型土壤動(dòng)物的群落組成造成一定的影響。這與以往的研究結(jié)果一致[31-33]。

在α多樣性分析中，雖然Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)同為豐富度指數(shù)，但它們的排序結(jié)果卻有細(xì)微的差別，落葉小葉林中的土壤動(dòng)物群落Chao1指數(shù)排在落葉闊葉林和高山草甸之前，而ACE指數(shù)卻排在了落葉闊葉林和高山草甸之后。這是因?yàn)锳CE指數(shù)的計(jì)算公式中加入了一個(gè)定義“優(yōu)勢(shì)”類(lèi)群的閾值，這個(gè)閾值在vegan程序包中為類(lèi)群包含10條序列，而Chao1指數(shù)并沒(méi)有這個(gè)規(guī)則[34]。因此可以推斷落葉小葉林土壤動(dòng)物群落中包含較多的低豐度類(lèi)群(所含序列數(shù)<10)。在DNA復(fù)合條形碼技術(shù)中，Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數(shù)是基于一個(gè)類(lèi)群所含序列數(shù)計(jì)算的，而不是基于一個(gè)類(lèi)群的個(gè)體數(shù)。Carew等人[28]指出，在一個(gè)樣本中，一個(gè)物種的序列數(shù)和個(gè)體數(shù)是正相關(guān)的，但序列的頻率并不能完美的反映物種的頻率。Piol等人[35]的研究也表明該技術(shù)的定量潛力有限，只有定性的研究是可靠的。因此，Shannon-Wiener和Simpson多樣性指數(shù)僅能作為一個(gè)參考，不能通過(guò)這兩個(gè)指數(shù)很好的判斷土壤動(dòng)物群落的多樣性。定量問(wèn)題是目前該技術(shù)用于土壤動(dòng)物研究的局限性。

從各樣本之間的Bray-Curtis距離與PCoA圖來(lái)看，針葉林與高山草甸的土壤動(dòng)物群落組成最為相似，針葉林與農(nóng)田次之。針葉林、高山草甸與農(nóng)田三者的土壤動(dòng)物群落組成相似性較高，而落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動(dòng)物群落組成與這3種生境的相似性都較低，落葉小葉林和落葉闊葉林的土壤動(dòng)物群落組成相似性也較低。聚類(lèi)分析得到了與PCoA分析相符的結(jié)果。這種相似性的形成可能與各生境中的氣溫和土壤的理化條件相關(guān)[32]，有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)以往的土壤動(dòng)物研究可知，在一次調(diào)查中會(huì)得到成千上萬(wàn)的土壤動(dòng)物，且土壤動(dòng)物包含的類(lèi)群很多，鑒定這些土壤動(dòng)物需要多人長(zhǎng)時(shí)間作業(yè)。對(duì)于其它的環(huán)境樣本，也存在同樣的問(wèn)題。而通過(guò)DNA復(fù)合條形碼技術(shù)，則可以快速簡(jiǎn)便的完成大量樣本的分類(lèi)鑒定，與傳統(tǒng)方法相比，省時(shí)省力，這也是該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)所在。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和分析方法的不斷完善，DNA復(fù)合條形碼技術(shù)的高成本效益和全面性將使更容易的大尺度監(jiān)測(cè)生物多樣性趨勢(shì)成為可能[36-37]。

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The application of DNA metabarcoding in the study of soil animal diversity in Taibai Mountain

SONG Yang, HUANG Yuan*

CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062,China

DNA metabarcoding which couples DNA barcoding with high-throughput sequencing technology enables quick and easy identification of species in a multiple sample, and has become a reliable method for surveying species composition and richness of a community. Taibai Mountain is the main peak of the Qinling Mountains. It is a well-preserved natural ecological system, and is a key area of biodiversity protection in China. Surveys on the diversity of soil meso-microanimals in Taibai Mountain will enrich the data of soil fauna composition and provide scientific basis for biodiversity protection in China. In this paper, we used the metabarcoding approach to analyze the diversity of soil meso-microanimals in 5 different habitats of Taibai Mountain in the Qinling Mountains. These habitats include alpine meadow, coniferous forest, deciduous small-leaved forest, deciduous broad-leaved forest, and farmland. We set 3 plots of 10 m × 10 m in each habitat, and 3 soil samples were collected randomly from each plot, the sampling depth was 0—15cm under ground. A Tullgren funnel was used to separate soil animals from soil samples. Soil animals from the same plot were transferred to 1.5-mL centrifuge tubes and the total DNA was extracted. The universal primers for the fraction of 18S rRNA and COI genes were used to amplify specific barcoding sequences. Sequencing of PCR amplicons was performed on a MiSeq Illumina sequencing platform. Raw data was analyzed using the Qiime and Mothur software to obtain the OTUs list and species list. Ecological analysis was performed using software R. A total of 199 families from 28 orders, 9 classes, and 3 phyla for soil animals were observed. Community composition analysis showed that habitat changes have some effect on the soil animal community composition. Alpha diversity analysis showed that the highest community richness index for soil animals is the coniferous forest and the lowest is the farmland; in addition, the highest community diversity index for soil animals is the coniferous forest and the lowest is the deciduous small-leaved forest. The community similarity analysis showed that the soil animal community composition in alpine meadow, coniferous forest, and farmland has a high similarity. The soil animal community composition in deciduous small-leaved forest and deciduous broad-leaved forest greatly differed from that in alpine meadow, coniferous forest, and farmland. The difference between the soil animal community composition in deciduous small-leaved forest and deciduous broad-leaved forest also differed greatly. The results of cluster analysis was in conformity with the community similarity analysis.

DNA metabarcoding; Taibai Mountain; soil animals; biodiversity

國(guó)家自然科學(xué)基金(31172076, 31372192)

2014-12-12; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-10-30

Corresponding author.E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

10.5846/stxb201412122475

宋飏，黃原.DNA復(fù)合條形碼在太白山土壤動(dòng)物多樣性研究中的應(yīng)用.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(14):4531-4539.

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