郭彩霞

(河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州 450000)

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阿奇霉素經(jīng)TLR-4/NF-κB信號通路干預(yù)COPD大鼠炎癥的機制研究

郭彩霞

(河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，鄭州 450000)

目的探討阿奇霉素通過TLR-4/NF-κB信號通路干預(yù)慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠炎癥的機制。方法36只SD大鼠分為健康對照組、模型組、阿奇霉素組。模型組及阿奇霉素組采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴入脂多糖1個月建立COPD大鼠模型。阿奇霉素組煙熏前30 min給予50 mg/kg阿奇霉素灌胃，健康對照組及模型組給予等量生理鹽水。1個月后，處死大鼠，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理形態(tài)；ELISA法檢測肺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6水平；RT-PCR檢測Toll樣受體4(TLR4)及核因子-κB(NF-κB)、磷酸化p65(pp65) mRNA表達；Western blot檢測TLR4、pp65、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)及MMP-9表達水平。并對大鼠支氣管肺泡灌洗液進行細胞分類和計數(shù)。結(jié)果與模型組比較，阿奇霉素組能改善肺組織形態(tài)，降低中性粒細胞數(shù)(P<0.01)，減少肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-2及MMP-9的分泌(P<0.01)，并抑制TLR4 表達及pp65(P<0.01)。結(jié)論阿奇霉素能通過TLR-4/NF-κB信號通路干預(yù)COPD大鼠炎癥。

肺疾病，慢性阻塞性；阿奇霉素；炎癥；TLR-4/NF-κB信號通路

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是指患者肺實質(zhì)、氣道、肺血管等發(fā)生慢性炎癥病變，具有氣道氣流受阻的臨床癥狀，患者氣流受限且不可逆，呈現(xiàn)進行性[1]。且COPD的核心主要是炎性反應(yīng)，包括中性粒細胞、淋巴細胞和肺泡巨噬細胞等的浸潤，該類炎性細胞被激活后，釋放出大量炎性介質(zhì)，并參與到炎癥病變發(fā)生發(fā)展中[2-3]。Toll樣受體(TLR)是一類天然免疫受體，其被革蘭陰性菌外膜脂多糖(LPS)等刺激活化后，經(jīng)過一系列磷酸化促進作用，可激活核因子-κB(NF-κB)信號通路，從而調(diào)節(jié)各種炎癥因子的表達，且在COPD患者中TLR4及NF-κB處于活化狀態(tài)，并調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子分泌[4-6]，因此通過干預(yù)TLR4/NF-κB信號通路能一定程度上緩解COPD。

阿奇霉素是第2代抗菌藥物，屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，具有抗菌廣譜、抗菌活性高、口服方便等特點，已在臨床上及動物實驗研究中應(yīng)用于肺炎等疾病的治療，并取得一定療效，如阿奇霉素能減輕香煙引起的肺炎疾病[7]。氨溴索聯(lián)合小劑量阿奇霉素長期應(yīng)用能明顯改善 COPD患者的肺功能，改善患者生活質(zhì)量[8]。通過隨機、雙盲、安慰劑對照試驗證實阿奇霉素可一定程度減少30例COPD受試者痰中中性粒細胞數(shù)量[9]。同時200 mg/kg阿奇霉素能顯著降低LPS刺激的小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)內(nèi)中性粒細胞數(shù)目及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，降低肺組織中IL-6和IL-1β水平[10]。說明阿奇霉素一定程度上能緩解COPD炎癥，但具體機制未知，有報道稱阿奇霉素能減輕酵母聚糖誘導(dǎo)人結(jié)膜上皮細胞炎癥，與抑制TLR和NF-κB信號通路有關(guān)[11]，因此作者推測阿奇霉素可能可通過TLR4/NF-κB信號通路來干預(yù)COPD炎癥，本文通過香煙聯(lián)合LPS構(gòu)建COPD模型大鼠，來探討阿奇霉素是否通過此通路來干預(yù)CODP炎癥，從而為阿奇霉素在臨床上治療COPD打下理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物體質(zhì)量(200±20)g的SD雄性大鼠36只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器阿奇霉素(輝瑞制藥有限公司)；LPS(美國Sigma公司)；兔抗TLR4、NF-κB、磷酸化p65(pp65)單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9單克隆抗體(Epitomics公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒(美國RB公司分裝)；定量PCR引物(大連寶生物公司合成)；總RNA提取試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；BCA法蛋白定量試劑盒，ECL超敏發(fā)光液(碧云天生物技術(shù)研究所)。電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；ROTOR-GENE3000型定量PCR儀(澳大利亞Cotbett公司)；酶標(biāo)分析儀(美國Bio-Tek公司)。

1.3COPD模型大鼠的建立及分組[12]36只大鼠分為健康對照組、模型組、阿奇霉素組。采用煙熏+LPS滴入的方法，大鼠每天置于煙室3次，每次45 min，COPD組和阿奇霉素組向煙室注入香煙煙霧，共30 d，在第15天時模型組及阿奇霉素組氣道內(nèi)注入1 mg/mL的LPS 200 μL，健康對照組正常飼養(yǎng)。阿奇霉素組在每天煙熏前30 min灌胃給藥，給予50 mg/kg阿奇霉素，健康對照組及模型組給予等量生理鹽水。

1.4支氣管肺泡灌洗液處理在第30天，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，并氣管插管后，用5 mL PBS進行左肺支氣管肺泡灌洗。將灌洗液離心、重懸，總細胞數(shù)經(jīng)過血細胞分析儀進行測定，細胞涂片后，Kwik-Diff染色檢測中性粒細胞、單核巨噬細胞及淋巴細胞數(shù)目。并取下右肺組織，-80 ℃冰箱凍存待測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色肺組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林浸泡固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，烘箱中烘烤30 min。二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各15 min；梯度乙醇脫水各5 min，自來水沖洗5 min；蘇木素浸泡2～3 min，流水沖洗5 min，1%鹽酸乙醇浸泡5 s，自來水沖洗至反藍，伊紅復(fù)染30 s，自來水沖洗5 min；梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明5 min，吹干后中性樹膠封片，鏡檢。

1.6ELISA法檢測TNF-α、IL-1β及IL-6水平各組肺組織攪碎勻漿，并離心取上清液進行檢測。首先將大鼠TNF-α試劑盒取出，室溫下放置20 min，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為：500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 pg/mL，并在第1孔加樣品稀釋液作為凋零孔，并分別加入各組100 μL上清液，總共10孔，各組樣品3個復(fù)孔。每孔加入100 μL 生物素標(biāo)記的抗大鼠TNF-α抗體，37 ℃反應(yīng)120 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次；每孔加入親和素-過氧化物酶工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次；每孔加入90 μL TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)30 min；每孔加入100 μL TMB終止液，此時溶液為黃色，在酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度(A)值。IL-1β及IL-6也是按照此方法嚴(yán)格進行操作。

1.7RT-PCR檢測總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說明書，引物設(shè)計見表1，通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進行PCR擴增，獲取5 μL擴增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖凝膠進行檢測。紫外分光光度計檢測電泳條帶并拍照。反應(yīng)條件為：94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)。

表1　　RT-PCR引物

1.8Western blot各組取適量肺組織，按比例加入RIPA(10 μg/mL)裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎制成組織勻漿，將破碎后的組織勻漿放置于冰中30 min，使組織徹底裂解，每隔10 min置于渦旋儀中振蕩30 s，40 min后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。采用BCA法對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2～3 h，濕法轉(zhuǎn)膜。一抗4 ℃孵育過夜，PBS漂洗2次，5 min/次；二抗室溫孵育1～2 h，PBS漂洗2次，5 min/次；滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

2　結(jié)　　果

2.1各組肺組織病理形態(tài)健康對照組中，肺泡腔充氣良好，肺泡間隔正常，無炎癥細胞浸潤；模型組中肺組織炎癥細胞因子浸潤，肺泡壁變薄，管腔變窄，肺泡腔變大，說明大鼠COPD模型構(gòu)建成功；阿奇霉素組中肺組織炎性細胞浸潤程度較模型組輕，肺氣腫程度較輕。

2.2各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細胞數(shù)與健康對照組比較，模型組中白細胞總數(shù)、中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)目都顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，阿奇霉素組中白細胞總數(shù)、中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)目都顯著下降(P<0.01)，見表2。

表2　　各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細胞數(shù)±s)

a：P<0.01，與：健康對照組比較；b：P<0.01，與模型組比較。

2.3各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及IL-6水平與健康對照組比較，模型組中TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著提高(P<0.01)。與模型組比較，阿奇霉素中TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著下降(P<0.05)，見表3。

2.4各組大鼠肺組織中MMP-2及MMP-9的表達與健康對照組比較，模型組中MMP-2及MMP-9表達水平顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，阿奇霉素組中MMP-2及MMP-9表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖1。

表3　　各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β及 IL-6水平

a：P<0.01，與健康對照組比較；b：P<0.01，與模型組比較。

a：P<0.01，與健康對照組比較；b:P<0.01，與模型組比較。

圖1各組大鼠肺組織中MMP-2及MMP-9的表達

2.5各組大鼠肺組織中TLR4、pp65、mRNA的表達與健康對照組比較，模型組中TLR4及pp65 mRNA表達量提高(P<0.01)；與模型組比較，阿奇霉素組中TLR4及pp65 mRNA表達量降低(P<0.01)，見圖2。

a：P<0.01，與健康對照組比較；b:P<0.01，與模型組比較。

圖2各組大鼠血清中TLR4、pp65 mRNA的表達

2.6各組大鼠肺組織中TLR4、pp65蛋白的表達與健康對照組比較，模型組中TLR4及pp65 蛋白表達提高(P<0.01)；與模型組比較，阿奇霉素組中TLR4及pp65表達量降低(P<0.01)，見圖3。

a：P<0.01，與健康對照組比較；b:P<0.01，與模型組比較。

圖3各組大鼠血清中NF-κB 信號通路蛋白的表達

3　討　　論

COPD是一種高病發(fā)率及高病死率的全球性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特征，但至今未闡明其發(fā)病機制，目前認為COPD是肺部對香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎性反應(yīng)。因此，建立動物模型進行相關(guān)實驗研究具有重要意義，香煙+LPS是公認的建立COPD動物模型的最佳方法，可以用此法在較短時間內(nèi)成功復(fù)制大鼠COPD模型。因此本研究通過此方法造模，也發(fā)現(xiàn)模型組中支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞等炎癥細胞數(shù)目顯著增加，TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子分泌也顯著增加，肺組織炎癥因子浸潤程度深，與已報道文獻結(jié)果是一致的，說明造模成功。而阿奇霉素是新型抗菌藥物，能顯著抑制COPD炎癥，本實驗也證實了阿奇霉素能改善COPD大鼠肺部病理形態(tài)，并抑制炎癥細胞分泌，與阿奇霉素能抑制吸煙引起的大鼠COPD炎癥，能部分逆轉(zhuǎn)中性粒細胞、單核巨噬細胞數(shù)目觀點一致[13]。

COPD的核心是炎性反應(yīng)，由炎癥細胞產(chǎn)生大量的炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、MMPs等。其中TNF-α主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，可促進炎癥部位白細胞的聚集和活化，加重炎癥。IL-6、IL-1β在傳遞信息，激活免疫細胞，介導(dǎo)T、B細胞活化、增殖與分化及在炎性反應(yīng)中起重要作用。炎癥細胞大量分泌MMPs，促進基底膜降解，進而介導(dǎo)中性粒細胞等炎癥細胞穿過血管，向靶器官浸潤，促進炎性反應(yīng)及組織損傷，并促進肺泡基底膜降解及肺氣腫形成，最終導(dǎo)致COPD形成。COPD模型大鼠氣道炎性反應(yīng)，可能與中性粒細胞聚集、活化和炎癥細胞分泌IL-6、IL-8及TNF-α等炎性介質(zhì)分泌增加有關(guān)[12]。COPD模型大鼠中MMP-9活性較高，金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)活性較低，炎性反應(yīng)明顯，最終導(dǎo)致肺功能降低[14]。Xie等[15]通過ELISA法檢測52例COPD患者及48例健康對照者血清、肺組織及支氣管肺泡灌洗中MMP-9活性，發(fā)現(xiàn)COPD中MMP-9活性顯著高于健康對照。充分說明COPD能促使大量炎性因子分泌，通過抑制COPD炎性反應(yīng)能一定程度上緩解COPD病情。本研究中，阿奇霉素通過抑制中性粒細胞聚集與活化和減少炎癥細胞分泌IL-6、IL-8及TNF-α來減輕COPD模型大鼠氣道炎性反應(yīng)。這與阿奇霉素抑制穩(wěn)定期 COPD患者氣道中炎癥促進因子TNF-α，降低氣道炎性反應(yīng)觀點一致[16]。同時本研究也發(fā)現(xiàn)阿奇霉素能降低MMP-2及MMP-9的表達量。與Cory等[17]、Fernandez-Robredo等[18]結(jié)論一致。從而說明阿奇霉素通過降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-2及MMP-9等炎癥因子分泌，來減輕香煙+LPS引起的COPD大鼠炎癥。而TNF-α、IL-1β、IL-6、MMPs等含有NF-κB的特異性結(jié)合位點，其表達受NF-κB的調(diào)控。推測阿奇霉素有可能通過NF-κB信號通路來干預(yù)COPD炎性反應(yīng)，因此，本研究進一步探討了阿奇霉素在此通路中的作用。

NF-κB信號通路受多種上游信號分子刺激而激活，TLR是其中之一。TLR為跨膜蛋白，在肺部主要分布于肺泡巨噬細胞、氣道上皮細胞等。其中TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的TLR，能識別革蘭陰性菌外膜的LPS。TLR4信號通路可通過髓樣分化因子88(MyD88)來控制TLR介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)基因的表達。LPS激活TLR4后，從而激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶家族成員，再通過一系列磷酸化作用后激活轉(zhuǎn)化生長因子-β活化酶，從而激活NF-κB上游抑制蛋白IKK及IκB，使得IκB磷酸化降解，并促使NF-κB p65轉(zhuǎn)入細胞核，從而誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-1β及MMPs等炎癥介質(zhì)的表達。已有研究證實COPD患者支氣管肺泡灌洗液及外周血中TLR4陽性表達較健康人群顯著提高[4,6]。NF-κB信號通路與吸煙導(dǎo)致的氣道炎癥、COPD密切相關(guān)[5]，說明TLR4及NF-κB在COPD中過度活化，通過抑制TLR4/NF-κB在一定程度能緩解COPD炎癥。而阿奇霉素的干預(yù)恰好抑制了TLR4表達及pp65磷酸化水平，說明阿奇霉素能通過TLR4/NF-κB信號通路來干預(yù)COPD炎性反應(yīng)，并下調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達。

綜上所述，香煙+LPS能成功復(fù)制COPD大鼠模型，促使模型大鼠產(chǎn)生炎性反應(yīng)，而阿奇霉素的干預(yù)，能降低支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞等炎癥細胞的分泌，也能減少TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-2及MMP-9水平，并進一步抑制TLR4/NF-κB信號通路，說明阿奇霉素能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來干預(yù)COPD大鼠炎癥。

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Azithromycin for intervening with inflammation in rat with chronic obstructive pulmonary disease via TLR-4/NF-κB signal pathway

GuoCaixia

(DepartmentofRespiration,HenanProvincialChestHospital,Zhengzhou,Henan450000,China)

ObjectiveTo explore the mechanism of azithromycin for intervening with inflammation of rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) via TLR-4/NF-κB signal pathway.MethodsThirty-six SD rats were divided into health control group,model group and azithromycin group.The rat COPD model in the model group and the azithromycin group was established by smoking and intratracheal administration of lipopolysaccharide for 1 month.At 30 min before smoking,the azithromycin group was given azithromycin 50 mg/kg by gavage,while the health control group and model group were given the equal amount of normal saline.One month later,rats were sacrificed and lung tissue was obtained.The pathological morphology of the lung was observed by the HE staining.The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to detect the level of TNF-α,IL-1β and IL-6 from lung tissue homogenate.The expression of TLR4,NF-κB and pp65 mRNA was detected by RT-PCR.The expression of TLR4,NF-κB,pp65,MMP-2 and MMP-9 protein was detected by Western blot.The cytological classification and count in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were performed.ResultsCompared with the model group,the azithromycin group could improve the lung tissue morphology,decreased the neutrophil granulocyte count(P<0.01),reduced the secretion of TNF-α,IL-1β,IL-6,MMP-2 and MMP-9 in lung tissue homogenates(P<0.01),and suppressed the expression of TLR4 and pp65 phosphorylation level (P<0.01).ConclusionAzithromycin can intervene with inflammation of rats with COPD.

pulmonary disease,chronic obstructive;azithromycin;inflammation;TLR-4/NF-κB signal pathway

郭彩霞(1975-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事肺部感染研究。

論著·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.009

R563.9;R-332

A

1671-8348(2016)12-1612-04

2015-11-18

2015-12-16)