葛麗麗，楊小昂，樸軍顏，尹艷慧，張　毓

(1.河南省鄭州市兒童醫(yī)院檢驗科　450053;2.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院　450052;3.北京大學免疫學系T細胞室　100083)

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論著·基礎研究

基因芯片篩選穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細胞中腫瘤轉移相關差異表達基因*

葛麗麗1，楊小昂2，樸軍顏2，尹艷慧3，張毓3

(1.河南省鄭州市兒童醫(yī)院檢驗科450053;2.鄭州大學醫(yī)藥科學研究院450052;3.北京大學免疫學系T細胞室100083)

目的篩選穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細胞中腫瘤轉移相關的差異表達基因。方法分別提取穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞(5B4)及轉染空質粒的對照細胞(Mock)總RNA，通過基因芯片技術篩選差異表達基因。結果與Mock細胞比較，5B4細胞共篩選出1 694個差異表達基因，有11個基因表達差異明顯，其中MMP-1、PTGS2、FN、CA9、IL-8、ILK、Areg 7個基因在轉染FATE/BJ-HCC-2基因后表達量明顯上升，差異倍數(shù)分別為81.80、49.86、11.30、16.26，3.48、2.79、2.20。E-cadherin、RhoBTB3、ALPP、HLA-DRB 4個基因表達量明顯下降，差異倍數(shù)分別為-5.42、-2.23、-5.93、-8.03。結論采用基因芯片技術對FATE/BJ-HCC-2參與的肝癌轉移的差異表達基因進行細致的篩選，其最終目的是為研究肝癌轉移機制打下堅實的理論基礎。

肝腫瘤；基因芯片；基因差異表達

肝癌具有隱匿性強、容易轉移的特點，并且很多患者在確診的時候已經處于疾病的晚期，還出現(xiàn)了嚴重的腫瘤遠處轉移現(xiàn)象，所以高度轉移是肝癌的一個非常重要的生物學特征。如果肝癌細胞發(fā)生轉移，就會對后期的預后及患者的生存概率產生非常嚴重的影響，是致死的主要原因[1]。作者前期的研究結果顯示，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2 mRNA在肝癌組織中高表達，與肝癌組織分化程度相關，并且能夠促進肝癌細胞的增殖和轉移[2-3]。經過大量的研究分析發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞發(fā)生侵襲及轉移的機制主要是由很多的分子和信號通路聯(lián)合形成的。這些分子的作用主要是對肝癌細胞在體內的侵襲產生促進作用，并且在惡性循環(huán)中也發(fā)揮著至關重要的作用[4-5]。

基因芯片，又稱DNA芯片、生物芯片，是將大量(通常每平方厘米點陣密度高于400)探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，主要是對所有的探針分子發(fā)出的混雜信號強度進行檢測，然后獲得相應樣品分子的數(shù)量及相關的信息等[6]。本文采用基因芯片技術在人全基因組范圍內檢測穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞(5B4)及轉染空質粒的對照細胞(Mock)之間基因表達譜的差異，尋找與FATE/BJ-HCC-2基因相關的肝癌轉移基因，探索肝癌轉移的分子機制。

1　材料與方法

1．1材料穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞(5B4)及轉染空質粒的對照細胞(Mock)均由北京大學醫(yī)學部T細胞實驗室建立及保存。10% 胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基(Gibco 公司)；Trizol 試劑(Invitrogen 公司)；Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片 (北京博奧生物有限公司)。

1．2方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)將5B4和Mock細胞分別接種于含10%胎牛血清及10 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2細胞總RNA提取取對數(shù)生長期的5B4 和Mock細胞消化后分別加至1 mL Trizol試劑中，待液氮揮發(fā)后裝入EP管中，室溫靜置5 min；加入氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min，4 ℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min，低溫離心15 min；吸取上層水相，加入等量異丙醇，室溫放置10 min，12 000 r/min低溫離心15 min；棄上清液75%乙醇進行漂洗，溫度控制在4 ℃。隨后10 000 r/min離心10 min。等到離心處理結束之后放到室溫環(huán)境中，并加入50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水進行溶解處理，最后放到-20 ℃的環(huán)境中儲存，以備下次使用。

1.2.3探針制備及芯片雜交首先，提取細胞總RNA，以T7Oligo(dT)Primer為引物，合成cDNA。然后，利用cDNA作為模板，選擇T7 Enzyme Mix進行cRNA的合成，加入生物素biotin 100 μL，利用磁珠的純化作用對cRNA進行處理，去掉其中的鹽類及酶類物質。利用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片進行雜交。對cRNA進行片段化處理(100 bp)后，置于預雜交液芯片中雜交，溫度為45 ℃，時間為10 min。將預雜交液取出，并加入相同體積的雜交液，利用生物素對cRNA進行標記處理后再次雜交，溫度為45 ℃，時間為16 h。最后，將芯片從爐中取出，進行洗脫和染色處理。

1.2.4檢測與分析首先，芯片結果采用 Agilent Microarray Scanner 進行細致的掃描，隨后會獲得相關基因表達的熒光信號的強度值，然后利用內參基因信號進行檢測校對。接下來熒光信號的強度可以根據(jù)每個芯片上所檢測到P值，并結合數(shù)據(jù)集合的檢測值進行分析:(1)檢測值(absolute call)不存在P(present)值的數(shù)據(jù)集合；(2)出現(xiàn)A(absent)或臨界值M(marginal)時，表示不表達狀態(tài)；(3)只有檢測值存在P的數(shù)據(jù)集才能夠進行下一步的研究分析。差異基因篩選標準：倍數(shù)變化值大于等于2.0或小于等于0.5。

1.2.5實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術驗證利用RT-PCR技術檢測差異基因在兩組細胞中的表達差異，觀察其檢測結果與基因芯片檢測結果是否一致。利用Primer5.0軟件自行設計引物，分別配置RT-PCR反應體系，反應體系如下：SYBR Green 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL,dNTP 1 μL，Taq酶2 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 30 μL，總體積為50 μL。將每管溶液混勻，6 000 r/min離心2 min。將配置好的反應體系置于RT-PCR儀上進行擴增反應，反應條件為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。

2　結　　果

2．1總 RNA提取結果 提取5B4 和Mock 細胞總 RNA，經甲醛變性凝膠電泳檢測，結果可見，細胞RNA電泳條帶清晰，5B4細胞RNA 的吸光度(A)值A260/A280為1.96；MOCK細胞RNA的A260/A280為1.97，均大于1.80；細胞總量大于或等于8 μg；電泳 28S與18S比值大于2∶1，樣品純度、總量及完整性均符合表達譜芯片實驗要求。

2．2芯片雜交信號散點圖細胞的總RNA主要是利用基因芯片技術對差異表達基因結果進行篩選，見圖1。該圖中的X軸表示的一個樣品的熒光信號強度值，Y軸表示的是另一個樣品的熒光信號強度值。圖中的所有數(shù)據(jù)點都表示芯片上的對應的一個基因點的雜交信號，紅色的標記表示B/A的比率值大于或等于2.0，綠色的標記表示B/A的比率值小于或等于0.5，均為表達存在差異的基因，黑色的標記表示的是B/A的比率值為0.5～2.0，這說明表達幾乎不存在差異。該圖中的熒光信號值在對稱軸直線兩側也有少量的分布，說明存在上調和下調基因。見圖1。

圖1　　基因芯片雜交信號散點圖

2.3基因芯片檢測結果分析與Mock細胞相比，5B4細胞中11條基因表達差異顯著，其中上調基因7條，下調基因4條，見表1。按照基因GO的分類信息進行研究，這些差異表達的基因大多數(shù)都分布在一些具有黏附、凋亡及調節(jié)細胞周期特征的細胞上，有一些還會分布在具有信號轉導功能的細胞中。

表1　　穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞中 腫瘤轉移相關分子芯片分析

2.4RT-PCR驗證結果RT-PCR檢測結果顯示，11條基因中有9條基因在兩組細胞中的mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中MPP1、PTGS2、CA9、IL-8、FN、ILK、Areg在5B4細胞中的mRNA表達量與Mock細胞相比明顯上調，其差異倍數(shù)分別為：84.38、46.62、11.83、14.70、3.89、2.25、2.22。E-cadherin、RhoBTB3在5B4細胞中表達明顯下調，在Mock細胞中的mRNA表達量分別是5B4細胞中的15.06倍和5.68倍(P<0.05)。而ALPP和HLA-DRB在兩組細胞中的mRNA表達差異不明顯(P>0.05)。將RT-PCR檢測結果繪制成柱狀圖，結果表明，RT-PCR所測11條基因中有9條基因的表達結果與基因芯片檢測結果基本一致，超過80%以上，具有重要的參考價值，可以用于差異表達基因的篩選。

3　討　　論

惡性腫瘤會向體內的細胞侵犯，還會對周圍正常組織造成破壞，參與血液循環(huán)，這一過程被稱為侵襲。腫瘤的侵襲及轉移過程是互有關系的不同病理過程。侵襲是轉移的前奏和前提，轉移是侵襲的結果。腫瘤的侵襲和轉移指的是癌基因、抑癌基因參與到調節(jié)過程中并起到一定作用的復雜過程，能夠調控整個腫瘤轉移過程，具體途徑有：過度表達與腫瘤轉移有關系的基因以及所有相關基因產物參與其中。Liotta等[7]將癌細胞向細胞外浸潤的步驟分成三大階段：(1)癌細胞與纖維連接蛋白、基質成分板層素等特異性結合，這一步驟的實現(xiàn)必須有癌細胞受體分子參與；(2)癌細胞或其周圍的間質細胞能夠與基質相連接，它們所分泌的物質可以將細胞外基質的蛋白水解酶分解；(3)細胞外基質被分解以后，癌細胞可以在其中進行移動、轉移。經過研究發(fā)現(xiàn)，多種分子及信號通路會促進肝癌細胞產生侵襲及轉移。肝癌細胞在機體內的侵襲過程受到這些分子的促進，這些分子還在肝癌細胞轉移的惡性循環(huán)步驟中起到相當重要的作用。所以說，將與肝癌轉移有關的一些分子篩選出來可以幫助探索肝癌的轉移機制。

基因芯片技術與物理、化學、網絡信息學及生物學這些高新技術聯(lián)系到一起，操作步驟為cDNA或上千個特異性基因探針相雜交之后檢測，然后再綜合分析及判斷所有基因表達的個體、組織、病變、刺激等特異性，這是一種實驗方法。此方法利用綜合、全面、系統(tǒng)的觀點研究了生命這一現(xiàn)象。這一技術能夠避免出現(xiàn)像普通核酸印記技術這樣操作復雜、不能完全自動化的缺點，并且能夠采用大規(guī)模、高通量的方式來同時分析上千上萬個基因[8]。所以說，基因芯片技術比其他尋找細胞或組織間差異表達基因的方法更好，能夠將各種細胞、組織中所有基因的表達規(guī)律、情況作出全面了解，該項技術已經成功地應用于同時成千上萬基因的表達和大規(guī)?；虻陌l(fā)現(xiàn)，以及多態(tài)性篩查和基因組DNA克隆的映射，為全面理解基因功能和基因之間的相互關系及發(fā)病機制提供依據(jù)。本研究通過提取穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞(5B4)及空質粒轉染的對照細胞(MocK)中的總RNA，然后通過基因芯片技術將兩組細胞和肝癌轉移相關的特異表達基因篩選出來。經過篩選的基因一共有11條，其中7條上調基因和4條下調基因。這些基因主要作用是調控細胞的分化、信號轉導、酶活性及細胞因子之間的相互作用等。將11條基因進行相關的RT-PCR反應，以確保基因芯片結果的準確性，最終的結果表明，基因芯片的分析結果和RT-PCR反映實驗的結果基本一致，由此可以說明基因芯片分析結果具有較高的可信度。

根據(jù)相關的文獻報道可知，基因芯片篩查出來的11條基因均參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤的起始過程密不可分，并在腫瘤的遷移和侵襲中起著重要作用[9]。據(jù)報道，MMP1在甲狀腺癌、口腔鱗狀癌等腫瘤中高表達，并與腫瘤的發(fā)展過程高度相關[10-11]。余海浪等[12]通過研究乳腺癌轉移相關的基因表達譜，并對差異基因的相互關系進行分析，發(fā)現(xiàn)差異基因編碼蛋白間的相互作用主要表現(xiàn)在14個蛋白，而MMP1、MMP2、PTGS2在重要的節(jié)點位置，這些差異基因主要涉及細胞周期與增殖、細胞黏附、細胞遷移、血管形成及信號轉導等生物通路和生物過程[12]。有學者認為，MMP與ILK可以相互影響共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[13]。IL-8水平的高低與胃癌等多種腫瘤具有正相關性[14]。有文獻報道，HLA-DRB1的基因多態(tài)性也與乳腺癌的進展過程具有密切關聯(lián)[15]。

本研究通過基因芯片技術成功篩選出了與FATE/BJ-HCC-2相關的肝癌轉移表達基因。與轉染空質粒的對照細胞相比，這些與腫瘤轉移相關的基因在穩(wěn)定轉染FATE/BJ-HCC-2的肝癌細胞中明顯高表達或低表達，說明它們在肝癌轉移癌變過程中與FATE/BJ-HCC-2引起的肝癌轉移有著一定的聯(lián)系，其具體作用機制尚需進一步研究。下一步研究將從基因組、蛋白質組水平上對重點基因進行檢測，以確定肝癌轉移發(fā)生發(fā)展的關鍵性分子和治療靶點。

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Screening of tumor metastasis related differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma cells with FATE/BJ-HCC-2 gene stable transfection by gene chip*

GeLili1,YangXiaoang2,PiaoJunyan2,YinYanhui3,ZhangYu3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ZhengzhouMunicipalChildren′sHospital,Zhengzhou,Henan450053,China;2.AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;3.TCellRoom,DepartmentofImmunology,PekingUniversity，Beijing100083,China)

ObjectiveTo screen the tumor metastasis related differentially expressed genes in hepatocelluar carcinoma(HCC)cells 7402 after stable transfection with FATE/BJ-HCC-2 gene．MethodsTotal RNA was extracted from FATE/BJ-HCC-2-transfected HCC(5B4)cells and empty vector control (Mock)cells respectively．Differentially expressed genes were obtained using cDNA microarray．ResultsCompared with Mock cells,a total of 1 694 differentially expressed genes were screened out in 5B4 cells，the 11 gene expressions had obvious differences,among which the expression amounts in 7 genes were significantly increased,including MMP-1，PTGS2，F(xiàn)N，CA9，IL-8，ILK and Areg.The fold changes were 81.80,49.86,11.30,16.26，3.48,2.79 and 2.20，respectively.The expression amounts in 4 genes were significantly decreased,including E-cadherin，E-cadherin，RHOBTB3，ALPP and HLA-DRB4．The fold changes were -5.42,-2.23,-5.93 and -8.03，respectively.ConclusionAdopting gene microarray technology can carefully screen the differentially expressed genes of FATE/BJ-HCC-2 involved HCC metastasis，its final goal is to lay a solid theoretical foundation for studying the HCC metastasis mechanism．

hepatocelluar neoplasms；gene chip；differential gene expression

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.004

國家自然科學基金資助項目(81071724)；河南省基礎與前沿基金資助項目(142300413224)。作者簡介：葛麗麗(1981-)，檢驗技師，碩士，主要從事免疫學檢驗及研究工作。

R735.7

A

1671-8348(2016)12-1595-03

2015-11-08

2015-12-20)