王　偉，楊俊濤，劉宏鳴，袁　濤，劉孟剛，金世龍

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所肝膽外科，重慶 400042)

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·論著·

亞砷酸鈉抑制肝癌細(xì)胞增殖與PML蛋白表達(dá)*

王偉，楊俊濤，劉宏鳴，袁濤，劉孟剛，金世龍△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所肝膽外科，重慶 400042)

目的研究亞砷酸鈉抑制肝癌(HCC)細(xì)胞增殖是否與早幼粒細(xì)胞白血病(PML)蛋白表達(dá)有關(guān)。方法免疫組織化學(xué)法、免疫熒光、蛋白免疫印跡法(Western blot)和熒光定量PCR檢測HCC組織PML蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果免疫組織化學(xué)分析顯示隨機(jī)選擇15例高分化、中度分化和低分化HCC組織和細(xì)胞均不同程度表達(dá)PML蛋白。Western blot 分析發(fā)現(xiàn)24例HCC組織、HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721和L02細(xì)胞均表達(dá)PML蛋白。免疫熒光提示HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721細(xì)胞核均有PML蛋白顆粒，其中HuH7和Hep3B細(xì)胞表達(dá)PML蛋白較HepG2、SMMC-7721細(xì)胞多。24例HCC組織，Hep3B、HepG2、SMCC-7721和HuH7細(xì)胞都表達(dá)PML基因。亞砷酸鈉不僅可下調(diào)HuH7和原代HCC細(xì)胞表達(dá)PML蛋白，而且亞砷酸鈉抑制HuH7，HepG2，Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞生長，隨著暴露時(shí)間延長亞砷酸鈉對HCC細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)。 結(jié)論HCC組織和細(xì)胞系普遍表達(dá)PML基因和蛋白，PML蛋白可能是砷劑直接靶向作用的分子基礎(chǔ)。

肝腫瘤；白血病,早幼粒細(xì)胞,急性；亞砷酸鹽類

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率居世界惡性腫瘤第5位，幾乎45%的HCC病例源于中國，且與乙型和丙型肝炎病毒感染有關(guān)[1-2]。20世紀(jì)70年代，我國學(xué)者用三氧化二砷(As2O3)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukaemia，APL)取得了世人矚目的突破性進(jìn)展；近年應(yīng)用As2O3治療實(shí)體腫瘤的實(shí)驗(yàn)和臨床研究受到廣泛重視，顯示出其更為廣范的應(yīng)用前景[3-4]。雖然As2O3明顯抑制HCC細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但As2O3對HepG2和SMCC-7721生長抑制分子機(jī)制仍不清楚。前期研究結(jié)果提示As2O3可下調(diào)HuH7細(xì)胞早幼粒細(xì)胞白血病(promyelocytic leukemia，PML)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)HCC干細(xì)胞分化[5]；但是，僅僅知道HuH7細(xì)胞表達(dá)PML蛋白，HCC組織是否普遍表達(dá)PML基因及蛋白缺乏研究數(shù)據(jù)。砷劑治療HCC是否與PML表達(dá)有關(guān)更不清楚，本文重點(diǎn)分析HCC組織和細(xì)胞PML蛋白表達(dá)及亞砷酸鈉對HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，建立砷劑治療HCC與HCC細(xì)胞表達(dá)PML的聯(lián)系。

1　資料與方法

1.1一般資料175例HCC組織于2012年1月至2013年6月取自西南醫(yī)院、新橋醫(yī)院和大坪醫(yī)院HCC切除的患者。

1.2細(xì)胞與試劑HuH7、HepG2、Hep3B、L02、SMMC-7721細(xì)胞系由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院肝膽科和病理科贈送，其中L02為正常肝細(xì)胞，其余4種為HCC細(xì)胞，白血病細(xì)胞株HL60和NB4細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院贈送。DMEM和胎牛血清(FBS)為Hyclone產(chǎn)品，RPMI-1640為IVD產(chǎn)品?？俁NA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為BioFlux產(chǎn)品,Promega GoTaq qPCR Master Mix為Promega產(chǎn)品。PML抗體購自Abcam和Santa Cruz公司。激光共聚焦顯微鏡為LSM780。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)HuH7、HepG2、Hep3B、L02和SMCC-7721細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，0.25%胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。HL60和NB4細(xì)胞在含10% FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育，收集細(xì)胞提取蛋白。

1.4CCK-8法分析HCC生長抑制情況HCC細(xì)胞接種于96孔板，每孔加1.0×103個細(xì)胞，加入100 μL 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(每2天換液)使其貼壁生長。次日細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度亞砷酸鈉(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)每種濃度設(shè)12個孔，設(shè)調(diào)零孔12個(不加細(xì)胞)和細(xì)胞對照孔12個(不加藥物)，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育48、72、96 h后吸出培養(yǎng)液。每孔分別加入90 μL DMEM培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀上測定450 nm吸光度值[A(450)]。

1.5Western blot分析HCC細(xì)胞和組織PML蛋白表達(dá)提取細(xì)胞和組織總蛋白。Western blot檢測PML蛋白表達(dá)：配置10%分離膠和4%積層膠。上樣量為每泳道90 μg蛋白，體積25～30 μL。電泳，積層膠電壓80 V，分離膠電壓100～120 V，電泳2～3 h。切膠后聚偏氟乙烯(PVDF)膜向正極，膠在負(fù)極，將濾紙、PVDF膜及凝膠整齊重疊后放在濕轉(zhuǎn)槽、電流150 mA轉(zhuǎn)移90 min。取下PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫震搖1～2 h。將封閉的膜滴加一抗按(1∶100),4 ℃濕盒內(nèi)過夜，次日PBS漂洗15 min×1次，5 min×4次，二抗按(1∶2 500)，25 ℃振搖1 h，PBS漂洗15 min×1次，5 min×4次?；旌系润w積A液和B液(各500 μL,共1 mL)，將顯色劑滴加到PVDF膜正面，開始顯色記錄圖像。

1.6免疫組織化學(xué)檢測HCC組織PML蛋白表達(dá)取低分化、中分化和高分化HCC組織標(biāo)本各5例。石蠟包埋的肝組織做超薄切片，切片脫蠟至水，PBS 洗5 min×2次；甲醇-H2O2室溫處理切片20 min，PBS洗5 min×3次；枸櫞酸緩沖液微波中火修復(fù)5 min，PBS洗5 min×3次；滴加PML抗體，4 ℃過夜；PBS洗5 min×3次，滴加增敏劑，37 ℃孵育35 min；PBS洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育35 min；PBS洗5 min×3次，DAB顯色10 min，鏡下觀察顯色情況；水洗終止顯色后，蘇木素襯染15～30 s；脫水、封片。鏡下觀察照相。結(jié)果判定：陰性對照不著色，DAB 染色呈棕黃色顆粒為表達(dá)陽性。

1.7免疫熒光分析HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721細(xì)胞PML蛋白表達(dá)HCC細(xì)胞普通培養(yǎng)在10 mm蓋玻片上，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%時(shí)，用37 ℃預(yù)熱PBS清洗5 min×2次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗5 min×2次，0.5% Triton-x 100的PBS室溫下脫色搖床振搖15 min，PBS洗5 min×3次。取出蓋玻片放至載玻片上，10%山羊血清37 ℃封閉30 min，PML抗體濕盒內(nèi)4 ℃孵化過夜。PBS脫色洗5 min×3次，滴加熒光抗體，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗5 min×3次、Hoechst33342染色細(xì)胞核，PBS清洗5 min×2次，取出蓋玻片，封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞PML蛋白表達(dá)。

1.8實(shí)時(shí)定量PCR分析HCC細(xì)胞系和HCC組織PML基因表達(dá)(1)用Trizol 提取HCC組織(自175例HCC切除的樣本中隨機(jī)取24例，用于PML蛋白和基因表達(dá)分析)和細(xì)胞總RNA，檢測RNA含量后立即置-130 ℃保存。(2)按BioKT cDNA Cirst strand cynthesis Kit使用說明設(shè)置20 μL體系，在室溫10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，冰浴5 min的循環(huán)條件進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄后檢測cDNA含量，在-20 ℃保存。(3)GAPDH 引物:正向5′-TGC AAC CGG GAAGGA AAT GA-3′ ，反向5′-GCC CAA TAC GAC CAA ATC AGA-3′；PML引物:正向5′-GGC TCG AGA AGG ATG TGG TC-3′，反向5′-GAA GTG AGG GCT CCC ATA GC-3′。(4)熒光定量PCR：按Promega GoTaq qPCR Master Mix Kit說明，配制20 μL反應(yīng)體系于STRATAGNE mx3000P熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s反應(yīng)40個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。

1～5：5例低分分化HCC；6～10：5例中分化HCC；11～15：5例高分化HCC。

圖1高、中、低分化HCC組織PML蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)×200)

2　結(jié)　　果

2.1亞砷酸鈉抑制HCC細(xì)胞生長本研究采用CCK-8法檢測0.1～1.0 μg/mL亞砷酸鈉處理HepG2、Hep3B、SMCC-7721和HuH7細(xì)胞48、72、96 h 生長抑制情況。結(jié)果顯示0.2 μg/mL 亞砷酸鈉顯著抑制SMCC-7721細(xì)胞生長(P<0.05)，0.4 μg/mL抑制其增殖能力更強(qiáng)(P<0.01)。0.4 μg/mL 亞砷酸鈉明顯抑制HepG2(P<0.01)和Hep3B(P<0.01)細(xì)胞增殖。0.1 ～0.4 μg/mL 亞砷酸鈉刺激HuH7細(xì)胞增殖，但每兩濃度梯度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.8 μg/mL 亞砷酸鈉抑制HuH7細(xì)胞增殖(P<0.01)，低濃度亞砷酸鈉刺激HuH7細(xì)胞增殖而高濃度抑制HuH7細(xì)胞增殖。亞砷酸鈉抑制4種HCC細(xì)胞生長，隨著暴露時(shí)間延長亞砷酸鈉對HCC細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)，0.4 μg/mL 亞砷酸鈉可明顯抑制HepG2、Hep3B和SMCC-7721細(xì)胞生長，0.8 μg/mL亞砷酸鈉明顯抑制HuH7細(xì)胞增殖，HuH7細(xì)胞耐受能力最強(qiáng)。

A:細(xì)胞；B:組織。

圖2HCC組織和細(xì)胞表達(dá)PML蛋白

A：24例HCC組織PML基因表達(dá)； B：4種HCC細(xì)胞PML基因表達(dá)。

圖3HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721和HCC組織PML基因及蛋白表達(dá)

2.2HCC組織表達(dá)PML蛋白自免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，HCC細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)有不同程度表達(dá)PML，細(xì)胞質(zhì)分布不均勻。低分化、中分化和高分化HCC組織均表達(dá)PML蛋白(圖1)，而且不同分化程度HCC組織PML蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3Western blot分析HCC組織和細(xì)胞系PML蛋白結(jié)果為了確定HCC細(xì)胞是否表達(dá)PML蛋白，排除假陽性結(jié)果，用白血病NB4和HL60細(xì)胞做陽性對照，人正常肝細(xì)胞系L02為正常對照，Western blot分析HCC組織及細(xì)胞PML蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示HuH7，HepG2，Hep3B，SMMC-7721和L02細(xì)胞均表達(dá)PML蛋白，見圖2A。24例HCC組織不同程度表達(dá)PML蛋白，見圖2B。

圖4　　免疫熒光分析4種HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)

A:Western blot；B:免疫熒光圖(×200)。

圖5亞砷酸鈉下調(diào)HuH7和原代HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)

2.4熒光定量PCR分析HCC組織和細(xì)胞均有PML基因表達(dá)24例HCC組織(圖3A)，Hep3B，HepG2，SMCC-7721和HuH7細(xì)胞都表達(dá)PML基因(圖3B)。

2.5免疫熒光分析HCC細(xì)胞系PML蛋白表達(dá)結(jié)果HuH7、HepG2、Hep3B和SMMC-7721細(xì)胞核均有PML蛋白顆粒，其中HuH7和Hep3B細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)于HepG2、SMMC-7721細(xì)胞，見圖4。

2.6亞砷酸鈉下調(diào)HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)本研究用含0.5 μg/mL亞砷酸鈉處理HuH7和原代HCC細(xì)胞5 d，檢測HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)變化。Western blot分析結(jié)果顯示亞砷酸鈉處理后HuH7和原代HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)下調(diào)(圖5A),免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)HuH7細(xì)胞核PML蛋白熒光顆粒明顯減少(圖5B)，提示亞砷酸鈉直接下調(diào)HuH7和原代HCC細(xì)胞PML蛋白表達(dá)。

3　討　　論

As2O3是劇毒中藥砒霜的主要成分， As2O3對急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的治愈率達(dá)到95%。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)APL 細(xì)胞PML-RAR融合蛋白和PML蛋白RBCC鋅指結(jié)構(gòu)域半胱氨酸殘基與砷結(jié)合，使PML聚合后與SUMO和UBC9結(jié)合，導(dǎo)致SUMO泛素化增強(qiáng)和PML及PML-RAR蛋白降解，闡明了As2O3降解PML-RAR和PML蛋白清除APL細(xì)胞的分子機(jī)制。研究顯示，砷與鄰近半胱氨酸結(jié)合，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，后者使PML分子間形成二硫化合物，再與Arsenic直接結(jié)合，形成與PML核體(PML-nuclear bodys，PML-NBs)有關(guān)的PML多聚體，進(jìn)而多聚體泛素化降解，PML-NBs隨之解體，PML-NBs上的多種核轉(zhuǎn)錄因子失去發(fā)揮功能平臺，誘導(dǎo)HCC干細(xì)胞分化[7-10]。Maroui等[11]研究證實(shí)As2O3誘發(fā)細(xì)胞核PML蛋白降解，參與了細(xì)胞增殖和分化。

前期結(jié)果顯示As2O3具有明顯抑制HCC增殖、細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，然而，其具體分子途徑不清楚，也未將As2O3與PML蛋白表達(dá)聯(lián)系起來，尤其忽略了As2O3治療APL在于砷直接與癌蛋白PML-RAR結(jié)合，使癌蛋白降解后APL細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。過去砷劑治療HCC的臨床和基礎(chǔ)研究存在4個缺陷：(1)認(rèn)定HCC細(xì)胞不表達(dá)PML基因及蛋白；(2)不清楚砷劑抑制HCC細(xì)胞生長的分子機(jī)制;(3)As2O3治療HCC是否也通過PML蛋白，缺乏相應(yīng)研究；(4)甚至有研究者先在HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染PML基因，表達(dá)PML蛋白后，再用As2O3處理HCC細(xì)胞[12]。為探索As2O3治療HCC的分子途徑，在前期研究的基礎(chǔ)上，作者假設(shè)HCC組織及細(xì)胞株可能普遍表達(dá)PML基因及蛋白。本組從175例HCC切除患者標(biāo)本中隨機(jī)選15例HCC組織(高分化5例、中分化5例和低分化5例)進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15例HCC組織不同程度表達(dá)PML蛋白(圖1)。Western blot分析24例HCC組織，結(jié)果24例HCC組織均不同程度表達(dá)PML蛋白，且各例HCC的PML蛋白表達(dá)量不盡相同(圖2B)。為了排除假陽性，用急性白血病細(xì)胞株NB4及HL60細(xì)胞做陽性對照，L02細(xì)胞做正常對照，Western blot分析顯示，HepG2、HuH7、Hep3B、SMMC-7721均表達(dá)PML蛋白(圖2A)。免疫熒光分析顯示HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC-7721細(xì)胞核均有PML蛋白顆粒，其中HuH7和Hep3B細(xì)胞表達(dá)PML蛋白較HepG2、SMMC-7721細(xì)胞多(圖4)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示24例HCC組織，Hep3B、HepG2、SMCC-7721和HuH7細(xì)胞都表達(dá)PML基因，在HCC細(xì)胞中Hep3B細(xì)胞PML基因表達(dá)較高。以上結(jié)果證實(shí)HCC組織及細(xì)胞株可能普遍表達(dá)PML基因及蛋白，否定此前實(shí)體癌細(xì)胞不表達(dá)PML蛋白的觀點(diǎn)。而且，前期用0.25 μg/mL As2O3處理HuH7細(xì)胞和本實(shí)驗(yàn)用0.50 μg/mL亞砷酸鈉處理可直接下調(diào)HuH7和原代HCC細(xì)胞表達(dá)PML蛋白，這些結(jié)果首次證實(shí)HCC組織和細(xì)胞系普遍表達(dá)PML基因和蛋白，建立As2O3或亞砷酸鈉治療HCC與PML蛋白表達(dá)的聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示亞砷酸鈉總體抑制HepG2、HuH7、Hep3B、SMMC-7721等4種HCC細(xì)胞生長，隨著暴露時(shí)間延長亞砷酸鈉對HCC細(xì)胞抑制作用增強(qiáng)；但是，很低濃度亞砷酸鈉就可抑制HepG2、Hep3B、SMMC-7721細(xì)胞增殖，較高濃度亞砷酸鈉才可以抑制HuH7細(xì)胞增殖，HuH7細(xì)胞對亞砷酸鈉雙向反應(yīng)。隨著亞砷酸鈉處理時(shí)間延長，HCC細(xì)胞PML蛋白逐漸減少，直至消失，HCC細(xì)胞表現(xiàn)出生長抑制，本結(jié)果提示亞砷酸鈉對HCC抑制與PML蛋白表達(dá)有關(guān)。前期研究觀察到，As2O3不僅顯著下調(diào)HuH7細(xì)胞PML蛋白表達(dá)，而且還可以增加對化學(xué)治療藥物的敏感性和抑制HuH7細(xì)胞形成腫瘤球能力，As2O3可能誘導(dǎo)CD13+CD133+LCSCs分化，清除LCSCs，達(dá)到治愈HCC的目的[6]。依據(jù)砷劑治療APL的分子機(jī)制和本組觀察結(jié)果，作者認(rèn)為As2O3或亞砷酸鈉抑制HCC細(xì)胞增殖與HCC細(xì)胞表達(dá)PML蛋白有密切關(guān)系。

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Sodium arsenite inhibiting proliferation of hepatoceullar carcinoma cells and expression of promyelocytic leukemia protein*

WangWei,YangJuntao,LiuHongming,YuanTao,LiuMenggang,JinShilong△

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,FieldSurgeryResearchInstituteofDapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

ObjectiveTo investigate whether the sodium arsenite inhibiting proliferation of hepatocellar carcinoma(HCC) cells and having a relation with the expression of promyelocytic leukemia (PML) protein.MethodsThe immunohistochemistry,Western blot analysis,immunofluorescence assay and quantitative PCR were used to examine the PML gene and protein expression in HCC tissue and cells.ResultsThe immunohis to chemical staining showed that the PML protein was expressed in nucleus of well-differentiated,moderately differentiated and poorly differentiated HCC tissues randomly selected from 15 cases of HCC undergoing hepatic resection.Western blot analysis showed that PML protein was expressed at varying levels in all 24 HCC tissue samples,HuH7,HepG2,Hep3B,SMMC-7721 and L02 cells.The immunofluorescence assay demonstrated that PML protein grains were found in the nucleis of the HuH7,HepG2,Hep3B and SMCC-7721 cells,in which HuH7 and Hep3B expressed more PML proteins than HepG2 and SMMC-7721 cells.24 HCC tissue samples,Hep3B,HepG2,SMCC-7721 and HuH7 cells all expressed PML gene.Sodium arsenite not only down-regulated the PML protein expressed in HuH7 and primary HCC cells,but also inhibited the HCC cell growth of HepG2,Hep3B,HuH7 and SMMC-7721,with the exposure time extension,the inhibiting effect of sodium arsenite on HCC cells was enhanced.ConclusionBoth HCC cell lines and tissues generally express ther PML protein and gene,PML protein may serve as the molecular basis for the direct targeting effects of arsenical agents.

liver neoplasms;leukemia,promyelocytic,acute;arsenites

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.003

重慶市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會局會中醫(yī)藥科技項(xiàng)目資助(ZY20132047)。作者簡介：王偉(1981-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事肝膽外科疾病臨床研究?！?/p>

，E-mail:Shilongjin828@sina.com。

R735.7

A

1671-8348(2016)12-1591-04

2015-12-28

2016-01-26)