林旭晨， 趙　暢， 曾　春， 王文昊， 柳　鑫， 蔡道章

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小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎細胞因子的表達

林旭晨， 趙暢， 曾春， 王文昊， 柳鑫， 蔡道章

目的初步探討實驗性骨關(guān)節(jié)炎小鼠不同時間不同免疫應(yīng)激情況下細胞因子的表達。方法8周齡健康清潔級C57小鼠隨機分為實驗組和對照組2組。實驗組小鼠激活免疫系統(tǒng)，1周后實驗組和對照組小鼠同時行右側(cè)膝關(guān)節(jié)DMM手術(shù)(即手術(shù)部分切除右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板)。分別于術(shù)后4，8周取膝關(guān)節(jié)病理標(biāo)本，進行關(guān)節(jié)組織切片番紅O快綠染色和mankin評分，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測MMP13表達情況，RT-qPCR檢測滑膜組織IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子以及X型膠原的表達。結(jié)果與對照組比較，手術(shù)后4，8周，實驗組mankin評分、各細胞因子mRNA表達和X型膠原mRNA表達均高于對照組(P<0.05)。結(jié)論免疫應(yīng)激條件下，關(guān)節(jié)組織中膠原及細胞因子呈現(xiàn)差異性表達。

骨關(guān)節(jié)炎； 骨關(guān)節(jié)炎, 膝； 免疫系統(tǒng)； 白細胞介素1； 白細胞介素6； 腫瘤壞死因子α

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是關(guān)節(jié)炎中最為常見的一種，是引起中老年人疼痛和傷殘的主要原因之一，嚴(yán)重地影響了中老年患者的生活質(zhì)量。隨著人類壽命的延長以及人口老齡化的加劇，OA發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高趨勢[1-2]。傳統(tǒng)觀念普遍認為，OA是一種非炎癥性退行性病變，其病因復(fù)雜，創(chuàng)傷、衰老、炎癥、肥胖及遺傳等因素均在發(fā)病中起著一定的作用[3]。近期研究表明，免疫系統(tǒng)和OA的進展存在一定的相關(guān)性[4]。然而，以往研究主要集中于研究不同嚴(yán)重程度OA對患者免疫系統(tǒng)的影響，未能探明免疫系統(tǒng)與OA之間的因果關(guān)系。本研究通過激活小鼠的免疫系統(tǒng)，再經(jīng)過手術(shù)誘發(fā)小鼠的OA，以未激活免疫系統(tǒng)的小鼠為對照組，收集小鼠關(guān)節(jié)樣本，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和RT-qPCR方法，初步探究免疫系統(tǒng)激活在OA的病理過程中所起的作用。

1　材料與方法

1.1材料動物：健康雄性清潔級C57小鼠40只，8周齡，體質(zhì)量22～24 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供(合格證號：No 44007200021628)。試劑：MMP13抗體(英國Abcam公司)；番紅O快綠(美國Sigma公司)；GenStar反轉(zhuǎn)錄試劑盒(A214 starscript Ⅱ first-strand cDNA synthesis Mix，北京康潤生物有限公司)；GenStar實時熒光定量PCR試劑盒[A364 2×realstar power probe mixture(with ROX Ⅱ)，北京康潤生物有限公司]。RT-qPCR儀(7500 fast real-time PCR system，美國Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1抗原制備卵清蛋白(ovalbumin,OVA)粉末(美國Sigma公司)用無菌PBS溶解后配制成10 mg/mL的儲液放入-20 ℃冰箱儲存，少量分裝，避免反復(fù)凍融。再用無菌PBS將上述OVA儲液稀釋成1 mg/mL的工作濃度，每100 μg OVA抗原液加入100 μg鋁鹽佐劑，在冰上充分混勻。

1.2.2分組與建模將40只小鼠分別編號為1～40，利用隨機數(shù)表法隨機抽選出20只為實驗組，余20只為對照組。實驗組小鼠激活免疫系統(tǒng)，對照組不做任何處理。

1.2.2.1小鼠免疫系統(tǒng)激活利用配制好的抗原溶液，每只小鼠每次腹腔注射100 μL即可。

1.2.2.2OA模型建立實驗組小鼠激活免疫系統(tǒng)1周(9周齡)后，實驗組和對照組小鼠同時行右側(cè)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的內(nèi)側(cè)半月板(destabilization of the medial meniscus, DMM)手術(shù)，即部分切除右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板：用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，剃凈右膝關(guān)節(jié)周圍鼠毛并用碘伏消毒。將小鼠固定于解剖顯微鏡下，在右膝關(guān)節(jié)部位用眼科剪縱向剪開皮膚，長度1 cm左右。用手術(shù)刀沿髕骨內(nèi)側(cè)縱向切開肌肉，將髕骨向外側(cè)翻并固定，從而暴露出關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)，首先離斷其內(nèi)側(cè)半月板-脛骨韌帶，其次摘除部分內(nèi)側(cè)半月板。將外翻的髕骨復(fù)位，并用眼科針縫合切口。整個手術(shù)過程均在實驗室無菌手術(shù)操作間完成。術(shù)后將小鼠置于籠中飼養(yǎng)，自由攝食攝水并自由活動。

1.2.3檢測項目

1.2.3.1組織取材實驗組小鼠在術(shù)后第3天補打抗原1次，術(shù)后第3周第2次補打抗原。術(shù)后第4周，實驗組與對照組各取10只處死，其中5對取小鼠關(guān)節(jié)進行組織切片，5對取關(guān)節(jié)滑膜等軟組織并提取RNA以檢測相應(yīng)的炎癥因子的變化；另10對小鼠中，實驗組小鼠于術(shù)后第5周和第7周分別進行第3及第4次補打抗原，術(shù)后8周對這10對小鼠進行相同處理取材。具體步驟如下：將小鼠斷頸處死，取右膝關(guān)節(jié)并將肌肉除凈。將處理好的關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定過夜，再用4%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣2周。洗凈脫鈣液，脫水并石蠟包埋。

1.2.3.2番紅O快綠染色與mankin評分蠟塊修整后切片，切片厚度5 μm，置于37 ℃過夜干燥。將組織切片置于60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烤片2 h。在二甲苯和梯度乙醇(95%，90%，80%)中進行脫蠟水化。蘇木精染色2 min，水洗，1%固綠水溶液中染色10 s，水洗，0.5%番紅O染液中染色2 min，過夜風(fēng)干并封片。光鏡下觀察切片中關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)改變，參照改良mankin評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分并統(tǒng)計，評分越高，OA情況越嚴(yán)重[5]。

1.2.3.3免疫組織化學(xué)染色切片脫蠟水化，置于37 ℃孵箱中蛋白酶K修復(fù)5 min，去離子水洗5 min×3次，室溫下滴加3%內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑避光孵育10 min，去離子水洗5 min×3次，山羊血清室溫封閉1 h，PBS洗5 min×1次，4 ℃條件下滴加兔多克隆抗體MMP13一抗工作液(1∶200)孵育過夜，PBS洗5 min×3次，室溫下滴加兔抗鼠二抗(1∶200)后孵育1 h，PBS洗5 min×3次，滴加DAB顯色液顯色后脫水并用中性樹膠封片。

1.2.3.4關(guān)節(jié)滑膜等軟組織總RNA提取與RT-qPCR由于小鼠關(guān)節(jié)體積小，單取滑膜難度過高且量不足，所以將其除肌肉及韌帶之外的關(guān)節(jié)囊、滑膜等軟組織一并取下，在研缽中加液氮研磨，然后加TRIZOL 1 mL充分裂解組織，加入氯仿200 μL并混勻，靜置3 min后10 000 r/min離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇并混勻，靜置15 min后12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入75%乙醇混勻，7 500 r/min離心5 min，棄上清液，待乙醇自然風(fēng)干后加入30 μL無菌三蒸水溶解沉淀。

將所得總RNA按照GenStar反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中的操作方法反轉(zhuǎn)為cDNA，并置于-20 ℃長久保存。將所得cDNA按GenStar實時熒光定量PCR試劑盒說明書中的操作過程預(yù)混成相應(yīng)體系，并使用RT-qPCR儀進行熒光定量PCR檢測。所得數(shù)據(jù)利用7500 Software v2.0.5進行分析。RT-qPCR引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2　結(jié)　果

2.1小鼠一般情況實驗過程中，各組小鼠體質(zhì)量無降低，一般狀態(tài)良好，飲食飲水正常，精神狀態(tài)佳，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏(表2)。

表2　對照組和實驗組小鼠體質(zhì)量變化情況

2.2小鼠關(guān)節(jié)的組織學(xué)評估對小鼠膝關(guān)節(jié)切片進行番紅O快綠染色(圖1)，并依據(jù)染色結(jié)果進行mankin病理評分(圖2)。與對照組比較，4周與8周時實驗組評分均高于對照組(P<0.01)。

2.3小鼠關(guān)節(jié)MMP13及X型膠原表達MMP13免疫組織化學(xué)染色(圖3)和X型膠原mRNA RT-qPCR(圖4)結(jié)果顯示，4周和8周時，實驗組MMP13免疫組織化學(xué)表達強度均高于對照組(P<0.01)；X型膠原mRNA的表達，實驗組也顯著高于對照組(P<0.01或P<0.05)。

2.4小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中細胞因子RT-qPCR對IL-1β、IL-6、TNF-α等相關(guān)細胞因子進行RT-qPCR檢測顯示，DMM手術(shù)后4周與8周時，IL-1β、IL-6、TNF-α等相關(guān)細胞因子表達量實驗組均明顯高于對照組(P<0.01，圖5)。

3　討　論

OA是常見于老年人的關(guān)節(jié)退行性疾病，研究的發(fā)病機制中有眾多的病原學(xué)因素，遺傳、年齡以及損傷是公認的危險因素[6]。新近研究表明，先天免疫系統(tǒng)可能參與OA這種炎癥反應(yīng)，然而，它們是如何引起OA關(guān)節(jié)損傷，至今仍不清楚[7]。研究表明，滑膜中的含鈣晶體可能會與先天免疫系統(tǒng)的組成部分直接相互作用，以及通過誘導(dǎo)或放大其他炎癥信號，使OA組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，含鈣晶體可以促進滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生促炎物質(zhì)。然而，含鈣晶體、炎癥和OA之間的關(guān)系是復(fù)雜的[8]。本研究旨在通過對實驗小鼠免疫系統(tǒng)進行活化，初步探討OA與免疫系統(tǒng)的關(guān)系。

小鼠關(guān)節(jié)番紅O快綠染色后mankin評分結(jié)果反應(yīng)的是OA的嚴(yán)重程度趨勢，與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果及各細胞因子表達的趨勢相一致?；A(chǔ)病理研究發(fā)現(xiàn)，患者膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)大量的軟骨基質(zhì)礦化結(jié)晶均存在軟骨表面及滑膜組織，產(chǎn)生骨贅及滑膜腫脹癥狀[9]。膠原是細胞外基質(zhì)成分之一，屬纖維蛋白質(zhì)[10]。不同類型膠原在分布、結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能上各不相同，膠原蛋白具有獨特的氨基酸組成，基本結(jié)構(gòu)單位是膠原分子，每個分子由3條多肽鏈(α鏈) 互相纏繞成三螺旋結(jié)構(gòu)[11]。Ⅱ型膠原蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，被認為是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)，軟骨的這種框架結(jié)構(gòu)被破壞后會引發(fā)軟骨生物力學(xué)、生物化學(xué)等一系列變化[12]，MMP13作為反應(yīng)軟骨退化的主要酶類之一，除了能夠反應(yīng)關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原的退化情況，還能夠反應(yīng)出關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖等成分的退化情況；有研究表明，發(fā)生關(guān)節(jié)軟骨破壞的患者的軟骨中MMP13呈現(xiàn)高表達，提示MMP13表達的增加與軟骨退化相關(guān)。通過利用MMP13過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出類似于OA的自發(fā)性關(guān)節(jié)軟骨破壞，因而更進一步說明了軟骨的破壞與退化和MMP13的高表達是相關(guān)的[13]。研究證明，在正常情況下X型膠原存在于關(guān)節(jié)軟骨與骨交界處的鈣化軟骨層，是關(guān)節(jié)軟骨與骨的分界面，小鼠免疫系統(tǒng)被活化，說明X型膠原在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中也起一定作用[14]。X型膠原散在于骨性關(guān)節(jié)炎的基質(zhì)中，在OA的進展中起到一定的作用[5]。筆者的實驗對小鼠MMP13進行免疫組織化學(xué)，反應(yīng)其Ⅱ型膠原蛋白的表達，并采用RT-qPCR檢測X型膠原的表達，結(jié)果顯示，實驗組MMP13和X型膠原mRNA均明顯高于對照組。

OA的發(fā)生發(fā)展與分子水平的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致軟骨的損傷關(guān)系密切，OA患者的軟骨損傷可能是軟骨細胞對局部組織損傷的過度反應(yīng)，目的在于去除受損的軟骨組織，生成新生組織并起到替代的作用[15]。機械應(yīng)力異常會活化處于低代謝狀態(tài)的關(guān)節(jié)軟骨細胞，并刺激細胞產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，這些介質(zhì)通常是機體處于炎癥或損傷的情況下由巨噬細胞釋放，可促進軟骨細胞的分解代謝，引起軟骨細胞釋放的蛋白聚糖酶和基質(zhì)金屬蛋白酶等水解酶增加，導(dǎo)致軟骨組織損傷，在軟骨基質(zhì)降解過程中發(fā)揮作用[16-18]。白細胞介素、腫瘤壞死因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、氧自由基等這些炎性介質(zhì)的持續(xù)存在可能破壞其余正常軟骨，甚至引起新的損傷[19]。白細胞介素及腫瘤壞死因子被認為是重要的前炎性細胞因子，它們主要調(diào)節(jié)炎癥中多種相關(guān)細胞的相互反應(yīng)并參與損傷后的修復(fù)過程[20]。然而，這些細胞因子并非獨立行使功能，它們有相互重疊的生物學(xué)活性，而且彼此間形成信號網(wǎng)絡(luò)[21]，這體現(xiàn)了OA作用機制上的復(fù)雜性，有待進一步的研究。

筆者認為，不同免疫應(yīng)激條件下，關(guān)節(jié)中膠原及細胞因子呈現(xiàn)差異性表達，提示在OA的進展過程中，免疫系統(tǒng)通過某種方式影響了其疾病的嚴(yán)重程度。

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(編輯:常志衛(wèi))

Expression of Cytokines in Mice Knee Osteoarthritis

LIN Xuchen， ZHAO Chang， ZENG Chun， WANG Wenhao， LIU Xin， CAI Daozhang

Department of Joint Surgery and Sport Medicine, The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University，Academy of Orthopedics of Guangdong Province, Guangzhou 510630, China

ObjectiveTo investigate the expression of cytokines in experimental osteoarthritis in mice at different time and different immune stress.MethodsC57 mice aged 8 weeks were randomly divided into 2 groups, the experimental group and control group.One week after the mice in experimental group undergoing activation of the immune system, and after one week, the mice in experimental group and control group underwent DMM surgery on the right side of the knee joint at the same time (the medial meniscus of the right knee was removed and the medial collateral ligament was broken).In 4 weeks and 8 weeks post-surgery, the pathological specimens of knee joint were obtained and the knee joint tissue section was used for red fast green dyeing, and for MMP13 expression by immunohistochemical detection, and the synovial tissue was used to detect cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α expression by RT-qPCR.ResultsIn 4 and 8 weeks after the surgery, the mankin score in experimental group was significantly higher than that in the control group, and the difference was statistically significant,P<0.05; and in 4 and 8 weeks, the expression of type ten collagen mRNA in the experimental group was significantly higher than that of control group; and IL-1β, IL-6, TNFα mRNA expression in the experimental group were also higher than that of the control group,P<0.05.ConclusionIn different immunological stress states, the expression of cytokines and collagen has differential expression, suggesting that in the process of osteoarthritis, the immune system may affect the severity of this disease somehow.

osteoarthritis; osteoarthritis, knee; immune system; interleukin-1; interleukin-6; tumor necrosis factor-alpha

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金(81371990)

南方醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院，廣東省骨科研究院，廣州510630

林旭晨(1989-)，男，南方醫(yī)科大學(xué)2013級碩士研究生

蔡道章.Email:daozhang@medmail.com.cn

R-332；R392.12；R684.3；R977.6

A

1672-4194(2016)03-0143-05