王　棟， 王　旭(綜述), 陳　卓(審校)

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

王棟1,2， 王旭1,2(綜述), 陳卓2,3(審校)

聚合酶鏈反應(yīng)； 微生物學(xué)技術(shù)； 食品

隨著人們生活水平的不斷提高以及世界食品開發(fā)、生產(chǎn)、銷售的迅速發(fā)展，研究和建立食品微生物快速檢測(cè)方法，以加強(qiáng)對(duì)食品衛(wèi)生安全的監(jiān)測(cè)越來越受到各國科學(xué)家們的重視。近日，國家質(zhì)檢總局發(fā)布的《2015年上半年中國進(jìn)口食品質(zhì)量安全狀況》中顯示：2015年上半年，我國從57個(gè)國家或地區(qū)的進(jìn)口食品中退運(yùn)或銷毀不合格進(jìn)口食品共計(jì)4 960噸。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，微生物污染是進(jìn)口食品不合格的主要原因之一。如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品病原微生物含量是保障食品安全的關(guān)鍵，也對(duì)促進(jìn)食品行業(yè)健康發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

目前對(duì)食源性致病菌檢測(cè)主要采用傳統(tǒng)方法，包括培養(yǎng)法、血清學(xué)分析法等，這些檢測(cè)方法存在步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、特異性差和不易分辨結(jié)果等缺點(diǎn)。近年來，隨著微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物化學(xué)、微生物快速檢測(cè)和自動(dòng)化研究的迅速發(fā)展，對(duì)微生物的鑒定已不再局限于對(duì)它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗(yàn)上，而在分子生物學(xué)水平基礎(chǔ)上建立的眾多檢測(cè)技術(shù)中，除了核酸探針及基因芯片技術(shù)外，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)以其具有特異強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地被用于食品微生物的檢測(cè)[1-2]。筆者就近年來利用PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面的研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1　PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。Khorana等在1971年提出，在體外經(jīng)DNA變性，與適當(dāng)引物雜交，再利用DNA聚合酶延伸、克隆DNA的設(shè)想。1983年，美國科學(xué)家Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)，使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)[3]。1988年，Saiki等將耐熱DNA聚合酶引入了PCR技術(shù)。1989年，《Science》雜志將PCR技術(shù)列為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首，并將1989年喻為PCR爆炸年，而Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技術(shù)的原理是：在微量離心管中，加入適量緩沖液、微量的模板DNA、4種脫氧核苷酸、1對(duì)合成DNA的引物、耐熱DNA聚合酶，通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個(gè)階段為1個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大1倍。一般樣品經(jīng)過30次循環(huán)，最終使特異區(qū)段的DNA片段得以擴(kuò)增數(shù)百萬倍。最早利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出的DNA序列是人的β-球蛋白基因，并于1987年6月首次進(jìn)入臨床應(yīng)用。但是，PCR技術(shù)作為一個(gè)單純的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其反應(yīng)及其產(chǎn)物受到很多因素影響，隨著有關(guān)DNA提取、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)等研究成果逐漸增多，國內(nèi)外許多學(xué)者根據(jù)不同需要，對(duì)常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)出許多新類型的PCR技術(shù)，使之成為一個(gè)較為完善的技術(shù)體系。

PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面研究的重點(diǎn)在于及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的病原微生物含量，尤其是近年來引起人們廣泛關(guān)注的導(dǎo)致食品污染的主要病原菌。利用PCR技術(shù)對(duì)已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均能準(zhǔn)確檢測(cè)，具有特異性高且靈敏、快速等特點(diǎn)。利用該技術(shù)建立快速檢測(cè)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌(LM)方法，并檢測(cè)模擬污染生豬肉、水和牛奶，其檢測(cè)限可達(dá)10 CFU/25 g(mL)。近年來，隨著PCR技術(shù)的改進(jìn)以及與其他技術(shù)的結(jié)合，衍生的新技術(shù)也為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了新的選擇。這些衍生的新技術(shù)除具有PCR技術(shù)的共性以外，均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)及試用的PCR方式(表1)。

1.1多重PCR技術(shù)該技術(shù)的原理與常規(guī)PCR相同，不同之處在于多重PCR技術(shù)在同一反應(yīng)體系中加入了2對(duì)以上的特異性寡核苷酸引物，可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因或DNA序列。因此，多重PCR技術(shù)可用于同時(shí)檢測(cè)或鑒定多種病原微生物。2010年，?adlrcl等利用免疫磁分離技術(shù)和多重PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，開展了對(duì)碎牛肉和生肉丸中大腸桿菌O157∶H7流行因子的檢測(cè)[4]。同年，Camila等也報(bào)道了利用多重PCR技術(shù)可特異性擴(kuò)增沙門氏菌屬特異性基因ompC、腸炎沙門氏菌SdfI基因、傷寒沙門氏菌ViaB基因以及鼠傷寒沙門氏菌Spy基因的目的片段[5]。利用該技術(shù)對(duì)沙門氏菌的檢出率明顯高于常規(guī)的微生物培養(yǎng)法，并成功檢測(cè)巴西境內(nèi)冷凍家禽肉的沙門氏菌污染情況及其常見血清型的流行情況。

表1　不同PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

然而，多重PCR技術(shù)存在擴(kuò)增效率不高、擴(kuò)增條件需要摸索及兼顧協(xié)調(diào)等不足之處，易出現(xiàn)多對(duì)引物間相互干擾以及交叉抑制等現(xiàn)象。其中，擴(kuò)增敏感性偏低是其在微生物檢測(cè)應(yīng)用中受限制的關(guān)鍵因素。美國貝克曼庫爾特公司為此將該技術(shù)與毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合，推出了用于同時(shí)檢測(cè)多種微生物的GenomeLabTMGeXP多功能遺傳分析系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱GeXP)[6]。

1.2qPCR技術(shù)該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程[7]，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。它不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)[8]。

qPCR技術(shù)中涉及到的熒光有2種：一種是熒光探針，如TaqMan熒光探針；另外一種是熒光染料，如SYBR熒光染料。曹東林等通過探針qPCR技術(shù)對(duì)血清型肺炎鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)qPCR技術(shù)不僅增強(qiáng)檢測(cè)的特異性，而且提高了檢測(cè)的靈敏度[9]。沈飚等比較了TaqMan探針qPCR、RT-PCR和常規(guī)PCR 3種方法在檢測(cè)白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、桃拉綜合征病毒及黃頭病毒4種對(duì)蝦病毒的不同，發(fā)現(xiàn)利用TaqMan探針進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR的檢測(cè)，靈敏度可提高10～100倍[10]。然而，定量PCR技術(shù)檢測(cè)核酸分子往往依賴于基于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且定量檢測(cè)的準(zhǔn)確與否，很大程度上依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)確定標(biāo)[11]。

1.3巢式PCR技術(shù)該技術(shù)是隨著系統(tǒng)發(fā)生學(xué)與基因組學(xué)的發(fā)展而出現(xiàn)的一種變異的PCR。該技術(shù)使用2對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段，第1對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似；第2對(duì)引物是在第1次PCR擴(kuò)增片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的，稱為巢式引物。巢式PCR首先通過外引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物后，再由內(nèi)引物進(jìn)行擴(kuò)增。這種巢式PCR技術(shù)可得到大量的特異性目標(biāo)序列，顯著增加了檢測(cè)的靈敏度[12]。如在運(yùn)用巢式PCR技術(shù)聯(lián)合焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)乙型肝炎病毒的耐藥基因中，發(fā)現(xiàn)巢式PCR在低拷貝數(shù)條件下較常規(guī)PCR更具敏感性，盡管其對(duì)最低基因拷貝數(shù)有一定要求。此外，巢式PCR技術(shù)還可防止反應(yīng)結(jié)束時(shí)的非特異性擴(kuò)增[13]。

1.4PCR-SSCP技術(shù)該技術(shù)是利用DNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性、在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移速率不同，通過顯色或顯影可以檢驗(yàn)出小至單個(gè)堿基的差異。該技術(shù)快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)便、精確，適用于對(duì)大樣本基因突變的篩選。目前，PCR-SSCP技術(shù)在致病微生物的快速檢測(cè)、種屬鑒定、微生物分型和微生物群落組成及多態(tài)性分析等工作中發(fā)揮著越來越重要的作用。據(jù)報(bào)道，胡秀彩等運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征實(shí)驗(yàn)，鑒別了從草魚腸道中分離的屬于同一分支類群的3株細(xì)菌，通過PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)它們的16S rDNA V3區(qū)帶型明顯不同，具有基因的多態(tài)性[14]。研究表明，PCR-SSCP技術(shù)具有很好的菌株鑒別效果，在微生物病原菌診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

1.5ddPCR技術(shù)該技術(shù)的出現(xiàn)使病原微生物的分子檢測(cè)技術(shù)獲得巨大的飛躍，該技術(shù)通過在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，每個(gè)微滴都相當(dāng)于一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)室。在每個(gè)微滴中，可以單獨(dú)完成核酸的擴(kuò)增，然后通過微滴分析系統(tǒng)逐個(gè)對(duì)微滴進(jìn)行檢測(cè)，最終根據(jù)陽性微滴的比例以及泊松分布原理，可計(jì)算出待測(cè)DNA分子的濃度或拷貝數(shù)[15]。

繼2013年歐洲馬肉風(fēng)波之后，公眾對(duì)于食品具體成分及含量愈發(fā)關(guān)注。德國科學(xué)家Floren采用ddPCR方法檢測(cè)肉類制品成分，結(jié)果顯示：ddPCR技術(shù)對(duì)不同肉類制品成分進(jìn)行的定量分析中，檢測(cè)限和定量限可分別達(dá)0.01%和0.001%水平，優(yōu)于qPCR的表現(xiàn)[16]。Michael在運(yùn)用ddPCR對(duì)葡萄金黃病致病菌類菌原體進(jìn)行檢測(cè)中，通過對(duì)葡萄藤的3種不同組織進(jìn)行實(shí)測(cè)，發(fā)現(xiàn)qPCR與ddPCR的檢測(cè)靈敏度都能達(dá)到10-5的水平，但ddPCR具有更好的重復(fù)性[17]。相對(duì)于qPCR，ddPCR這種本質(zhì)上基于單分子計(jì)數(shù)的核酸定量方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物特定核酸分子的絕對(duì)定量，從而徹底擺脫qPCR對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的依賴，在檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、重復(fù)性等方面有更好的表現(xiàn)，并且抑制劑對(duì)ddPCR的影響也較小[18]。ddPCR有望取代qPCR作為未來定量檢測(cè)的發(fā)展方向[19]。

2　PCR技術(shù)在檢測(cè)食品微生物中的優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用展望

用傳統(tǒng)的方法檢測(cè)食品中的微生物需要分離出所有的微生物，而食品中污染微生物的種類繁多，即使是同一種食品中微生物的種類也相當(dāng)多，毋庸置疑，快速、準(zhǔn)確和靈敏的PCR技術(shù)，尤其是通過對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的改進(jìn)以及與其他分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合使用[20-21]，在對(duì)環(huán)境、食品中微生物(尤其針對(duì)病原性微生物)的檢測(cè)中已成為一種重要科學(xué)手段。此外，一般的腐敗菌檢測(cè)需要2～5 d，甚至7 d以上，待檢驗(yàn)結(jié)果出來時(shí)通常產(chǎn)品已經(jīng)流向市場(chǎng)，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有嚴(yán)重的滯后性。相比之下，PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物可以在1 d內(nèi)，甚至在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以得到檢測(cè)結(jié)果，對(duì)食品工業(yè)生產(chǎn)具有很好的指導(dǎo)作用。

同時(shí)，我們應(yīng)該看到，PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)中存在的一些問題，包括由于食品成分復(fù)雜，如果不能有效排除各因素的干擾(如蛋白質(zhì)等PCR抑制劑對(duì)PCR反應(yīng)造成污染)可能出現(xiàn)假陰性；PCR技術(shù)無法區(qū)分微生物細(xì)胞是死細(xì)胞還是活細(xì)胞；PCR反應(yīng)靈敏度高，操作時(shí)要求嚴(yán)格，稍不注意有外界DNA介入就會(huì)造成假陰性等。此外，對(duì)于特定的PCR系統(tǒng)，不同實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，PCR技術(shù)的“標(biāo)準(zhǔn)化”任務(wù)依然任重道遠(yuǎn)。近年來，隨著新興的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些用于微生物分析的PCR檢測(cè)商品試劑盒。筆者相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)在微生物檢測(cè)上的應(yīng)用將朝著簡(jiǎn)便、高效、特異性強(qiáng)的方向發(fā)展。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，并結(jié)合傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)鑒定技術(shù)，勢(shì)必在微生物檢測(cè)中擁有廣闊的發(fā)展空間。

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(編輯：常志衛(wèi))

2015-10-26

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81171634)；福建省自然科學(xué)基金(2013J01387)

1.福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州350117；2.中國科學(xué)院 福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所，福州350002；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049

R155.5； R446.5； R446.9； R595.7

A

1672-4194(2016)03-0213-04