張 艷 ， 李蘇利， 華 川

脲原體屬感染及相關(guān)耐藥基因研究

張 艷 ， 李蘇利， 華 川

目的 探討脲原體的耐藥性及其相關(guān)耐藥基因分布。方法 采用支原體培養(yǎng)、鑒定和藥敏一體化試劑盒對疑似脲原體感染患者的泌尿道分泌物標(biāo)本進(jìn)行檢測；將篩選得到的脲原體株進(jìn)行耐藥相關(guān)基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM PCR擴(kuò)增并測序分析。結(jié)果 ① 117份泌尿道分泌物標(biāo)本檢出54株脲原體。藥敏結(jié)果顯示，脲原體對四環(huán)素類藥物中的米諾環(huán)素敏感率最高（92.6%），耐藥率最低（5.6%）；對喹諾酮類藥物中氧氟沙星敏感率最低（5.6%），耐藥率最高（53.7%）。② 基因測序結(jié)果顯示：耐藥基因tetM在2316、2526二個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為G突變?yōu)锳、T突變?yōu)镃；parC基因于248位點(diǎn)發(fā)生突變，堿基C突變?yōu)門，結(jié)果導(dǎo)致83位絲氨酸被亮氨酸替換（S83L）；gyrA基因未檢測出突變；23SrRNA基因于2149、2181、2230三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為T突變?yōu)镚、T突變?yōu)锳、A突變?yōu)镚。結(jié)論 脲原體對四環(huán)素類藥物敏感率最高，尤其是米諾環(huán)素；對喹諾酮類藥物耐藥最嚴(yán)重，尤其是氧氟沙星，為臨床合理用藥提供一定依據(jù)；parC、23SrRNA、tetM基因相關(guān)突變可能與脲原體耐藥機(jī)制有關(guān)。

脲原體； 耐藥基因； 基因突變

脲原體是泌尿生殖道感染的重要病原體之一。針對脲原體感染的抗菌藥物主要有3大類：四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類，目前在臨床都出現(xiàn)了不同程度的耐藥［1-4］。為了解脲原體對常見抗菌藥物的耐藥率，明確本地區(qū)脲原體的耐藥機(jī)制，現(xiàn)對我院脲原體樣本進(jìn)行核酸提取及gyrA基因、parC基因、23SrRNA基因、tetM基因測序分析。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集2013年6月—2014年6月我院檢驗(yàn)科細(xì)菌室117例患者的泌尿道分泌物標(biāo)本，標(biāo)本主要來自婦科、皮膚科及泌尿外科門診疑似支原體感染患者，其中男15例，女102例，年齡在21～58歲。男性用無菌男性拭子插入尿道2～4 cm處取尿道分泌物；女性用無菌女性拭子在宮頸管內(nèi)1～2 cm處取宮頸分泌物，取好的標(biāo)本無菌密封送檢。

1.2方法

1.2.1支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用珠海麗珠試劑有限公司支原體培養(yǎng)、鑒定、藥敏一體化試劑盒，對分泌物標(biāo)本進(jìn)行支原體培養(yǎng)鑒定及藥敏。藥敏試驗(yàn)受試藥物包括四環(huán)素類（多西環(huán)素、米諾環(huán)素）；大環(huán)內(nèi)酯類（交沙霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素）；喹諾酮類（氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星）三類9種抗菌藥物。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，并將篩選得到的54株脲原體陽性菌液保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2耐藥基因擴(kuò)增及測序分析 從54例脲原體陽性標(biāo)本中選取僅對上述3大類藥物中的一類單獨(dú)耐藥的標(biāo)本6株（樣本號分別為1、21； 19； 3、10、38）及全耐藥標(biāo)本1株（樣本號為5）進(jìn)行耐藥基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM擴(kuò)增并測序分析。

1.2.3脲原體陽性標(biāo)本核酸的提取 ①取300 μL菌液轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min；②小心吸出上清液（盡量吸干上清液，但不要觸及沉淀）并棄去，沉淀加700 μL無菌生理鹽水混勻，13 000 r/min離心10 min；③重復(fù)步驟1次；④向離心管中加入50 μL裂解液，然后用槍頭對準(zhǔn)沉淀所在位置，將其挑離管底，并反復(fù)吹打，用漩渦振蕩器振蕩將沉淀充分打散；⑤100 ℃溫浴10 min，13 000 r/min離心10 min后取上清液待用。

1.2.4引物合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］合成耐藥基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM的引物序列，見表1。

1.2.5PCR擴(kuò)增及測序分析 以提取的脲原體核酸為模板，進(jìn)行上述耐藥基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：模板2 μL，引物1.5 μL （20 μmol/L），PCR反應(yīng)液Mix12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。 gyrA基因、 parC基因、23SrRNA基因的PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。TetM基因PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像。PCR目的基因的純化產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行核苷酸序列測序。耐藥株測序結(jié)果與GenBank中的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比較，查找突變位點(diǎn)。

表1　PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in PCR

2.1支原體培養(yǎng)、鑒定及藥敏結(jié)果

經(jīng)檢測，117份泌尿道分泌物標(biāo)本檢測出54株脲原體，檢出率為46.2%。藥敏結(jié)果顯示：脲原體對四環(huán)素類藥物的敏感率最高，其中米諾環(huán)素、多西環(huán)素的敏感率分別為92.6%、90.7%；脲原體對喹諾酮類藥物中的氧氟沙星耐藥率最高，為53.7%，其次為大環(huán)內(nèi)酯類藥物中的羅紅霉素，為51.8%，見表2。

2　結(jié)果

表2　54株脲原體的藥敏結(jié)果Table 2 Susceptibility of 54 Ureaplasma isolates to antimicrobial agent ［n（ %）］

2.2測序

耐四環(huán)類藥物的1、21號樣本檢測出tetM基因，并在2316、2526二個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為G突變?yōu)锳、T突變?yōu)镃。耐喹諾酮類藥物的19號樣本檢測出parC基因，并于248位點(diǎn)發(fā)生突變，堿基C突變?yōu)門，結(jié)果導(dǎo)致83位絲氨酸被亮氨酸替換（S83L）。gyrA基因未檢測出突變。耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物的3、10、38號樣本均檢測出23SrRNA基因，于2149、2181二個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為T突變?yōu)镚，T突變?yōu)锳。10號標(biāo)本發(fā)生上述二位點(diǎn)突變外，于2230位點(diǎn)也發(fā)生突變，為A突變?yōu)镚。5號樣本為全耐藥標(biāo)本，檢測出2種耐藥基因parC基因、23SrRNA基因，其中parC基因于259、324兩處發(fā)生突變，分別為G突變?yōu)锳、T突變?yōu)镃；23SrRNA基因于2149、2181二個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為T突變?yōu)镚、T突變?yōu)锳。

3　討論

3.1檢出率與耐藥情況

本研究117份標(biāo)本中檢出54例脲原體，陽性率為46.2%，遠(yuǎn)高于宮娜娜等［6］報(bào)道的27.3%，但遠(yuǎn)低于張正國等［7］報(bào)道的78.9%，這可能與地域有關(guān)，也可能與選取病例的人群構(gòu)成、檢測方法的差異有關(guān)。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，脲原體對抗菌藥物的耐藥率不斷增高，且不同地區(qū)報(bào)道的耐藥率也不盡相同［1-8］。本研究發(fā)現(xiàn)脲原體對四環(huán)素類藥物較其他2類藥物的敏感性強(qiáng)，且對米諾環(huán)素的敏感率最高，為92.6%；而對喹諾酮類藥物中的氧氟沙星耐藥率最高，為53.7%。從而提示本地區(qū)臨床用藥時(shí)應(yīng)參照藥敏結(jié)果慎重選擇。

3.2耐藥相關(guān)基因分析

3.2.1四環(huán)素類藥物與tetM基因 四環(huán)素類藥物的抗菌作用方式是通過與核糖體30S亞基的A位點(diǎn)結(jié)合抑制氨基酰tRNA與核糖體的結(jié)合，從而阻斷蛋白合成［9］。脲原體對四環(huán)素耐藥機(jī)制與其攜帶tetM基因有關(guān)。tetM基因是5類（M、O、P、Q、S）核糖體保護(hù)基因中的一類，它可編碼一種保護(hù)蛋白，對四環(huán)素耐藥的微生物大多可以產(chǎn)生這此種蛋白，該蛋白能與核糖體結(jié)合使微生物免受四環(huán)素類藥物的作用影響，從而產(chǎn)生耐藥。本研究中，耐四環(huán)類藥物的1、21號樣本均檢測出tetM基因，并在2316、2526二個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為G突變?yōu)锳、T突變?yōu)镃。但是不是所有耐四環(huán)素類藥物的脲原體都能檢測出terM基因？敏感菌株會不會也攜帶tetM基因？之后的學(xué)者們就這2個(gè)問題進(jìn)行了深入研究。程文海等［10］研究耐四環(huán)素類藥物的脲原體發(fā)現(xiàn)2株檢測tetM基因?yàn)殛幮裕@就提示我們對于四環(huán)素類藥物，除tetM基因以外，脲原體還可能有新的耐藥機(jī)制。有學(xué)者在敏感菌株中也發(fā)現(xiàn)了terM基因的存在，但tetM基因與藥敏狀態(tài)有關(guān)聯(lián)［11］，提示該基因可能要與其他機(jī)制共同作用才能產(chǎn)生耐藥。

3.2.2大環(huán)內(nèi)酯類藥物與23SrRNA基因 目前臨床常用于治療泌尿生殖道感染的大環(huán)內(nèi)酯類藥物有克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等，關(guān)于脲原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性，各地區(qū)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果不一。我們研究發(fā)現(xiàn)，我院分離的脲原體對羅紅霉素的耐藥率高達(dá)51.8%。目前與耐大環(huán)內(nèi)酯類藥物機(jī)制相關(guān)的概念有：紅霉素甲基化酶基因、外排泵MF基因表達(dá)［12-13］、23SrRNA基因的突變。孟冬婭等［14］推測脲原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機(jī)制與其核糖體23SrRNA堿基突變或甲基化有關(guān)。也有文獻(xiàn)報(bào)道了與脲原體致病性相似的人型支原體23SrRNA中的突變是其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要機(jī)制［15-16］；本研究選取3株耐大環(huán)內(nèi)酯類的脲原體菌株，進(jìn)行23SrRNA基因擴(kuò)增并測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三個(gè)位點(diǎn)突變：2149、2181、2230，分別為T突變?yōu)镚、T突變?yōu)锳、A突變?yōu)镚。不同的大環(huán)內(nèi)酯類藥物在支原體23SrRNA內(nèi)有不同的結(jié)合位點(diǎn)，突變位點(diǎn)的存在可能是導(dǎo)致不同耐藥表型產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。

3.2.3喹諾酮類藥物與gyrA和gyrB基因 本文藥敏結(jié)果顯示脲原體對喹諾酮類藥物中的氧氟沙星耐藥率最高（53.7%）。喹諾酮類藥物的作用靶位為細(xì)菌的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶，包括旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。旋轉(zhuǎn)酶是由gyrA和gyrB組成的A2B2四聚體，分別由gyrA和gyrB基因編碼。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是parC和parE組成的C2E2四聚體，分別由parC和parE基因編碼［17-18］。趙縝等［19］研究發(fā)現(xiàn)脲原體對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要是菌株DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ序列發(fā)生堿基突變，導(dǎo)致喹喏酮類藥物不能與酶蛋白-DNA復(fù)合體結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥。MAZAARIOL等［20］報(bào)道gyrA、gyrB、ParC、ParE等區(qū)域的基因突變會導(dǎo)致大腸埃希菌對喹諾酮類的耐藥，這些區(qū)域稱為喹諾酮耐藥決定區(qū)域（QRDA）。本研究發(fā)現(xiàn)，耐喹諾酮類藥物的脲原體第19號樣本檢測出parC基因變異，該基因于248位點(diǎn)發(fā)生突變，堿基C突變?yōu)門，結(jié)果導(dǎo)致83位絲氨酸被亮氨酸替換（S83L）。最近KAWAI等［21］研究的158例日本人群樣本中發(fā)現(xiàn)37株parC S83L突變，突變率達(dá)23.4%，他們還發(fā)現(xiàn)1株P(guān)arC S83L-GyrB P462S雙突變。BEETON等［22］研究發(fā)現(xiàn)除S83L突變外，還存在D112E突變和ParC蛋白125位或136位氨基酸突變。這提示脲原體對喹諾酮類耐藥基因gyrA和parC的突變類型可能存在地域性差異。因此有必要針對性地檢測本地區(qū)脲原體耐藥基因的突變特點(diǎn)，對于明確本地區(qū)的耐藥機(jī)制有著重要意義。

綜上所述，我們對本地區(qū)脲原體對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類藥物耐藥情況及耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)脲原體對四環(huán)素類藥物敏感率最高，對喹諾酮類藥物耐藥最嚴(yán)重，且parC、23SrRNA、tetM基因相關(guān)突變可能與本地區(qū)脲原體耐藥機(jī)制有關(guān)。一方面提示臨床醫(yī)師治療此類感染時(shí)應(yīng)參考藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物。另一方面也提醒我們要加強(qiáng)對脲原體的耐藥監(jiān)測并及時(shí)與臨床溝通，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

［1］SOBOUTI B， FALLAH S， MOBAYEN M，et a1. Colonization of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in pregnant women and their transmission to offspring［J］.Iran J Microbiol，2014，6（4）：219-224.

［2］KOTROTSIOU T， EXINDARI M， DIZA E，et a1. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticum in asymptomatic women in Northern Greece［J］.Hippokratia，2013，17（4）：319-321.

［3］REDELINGHUYS MJ， EHLERS MM， DREYER AW， et a1. Antimicrobial susceptibility patterns of Ureaplasma species and Mycoplasma hominis in pregnant women［J］.BMC Infect Dis，2014，28， 171.

［4］ VARGOVI? M， PASINI M， PAPI? N，et a1. Antimicrobial susceptibility of Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis［J］.Sex Transm Infect，2014，90（1）：69.

［5］葉向群，蔡應(yīng)木，焦曉陽，等. 泌尿生殖道解脲脲支原體感染的分子流行病學(xué)研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2007，17 （6）：647-650.

［6］宮娜娜，方小敏，徐金花. 1220例泌尿生殖道支原體培養(yǎng)及藥敏分析［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥， 2013，8（33）：32-33.

［7］張正國，賀慶偉，胡玥.泌尿生殖道支原體屬感染特點(diǎn)及耐藥性分析［J］.中國感染與化療雜志 ，2014，14（1）： 18-21.

［8］林飛燕， 陸春， 馮佩英.解脲脲原體藥敏檢測的研究進(jìn)展［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志， 2012，26（12）： 1136-1138.

［9］黃亞，郭曉奎，李擎天.脲原體耐藥機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國際生物制品學(xué)雜志， 2010，33（4）： 201-204.

［10］程文海，黃澎杰，譚中楷，等.江門地區(qū)脲原體和人型支原體對8種抗生素的敏感性測定及其與tetM基因檢測的評價(jià)［J］.中國艾滋病性病，2004，10（5）：371.

［11］管琳， 葉信予，張賢華. 脲原體對四環(huán)素的耐藥性分析及其耐藥機(jī)制研究［J］.中國感染與化療雜志，2011，11（3）：188-190.

［12］ROBERTS MC.Update on macrolide-lincosamidestreptogramin，ketolide，and oxazolidinone resistance genes［J］. FEMS Microbiol Lett，2008，282（2）：147-159.

［13］LI XZ，NIKAIDO H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria：an update［J］.Drugs，2009，69（12）：1555-1623.

［14］孟冬婭，馬曉博，何莉，等.解脲脲原體23SrRNA位點(diǎn)突變與大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的關(guān)系［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31（6）：653-656.

［15］劉排，蔣娟，張津萍，等. 生殖支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥突變位點(diǎn)研究［J］.中華皮膚科雜志， 2014，47（8）：551-554.

［16］盧榮標(biāo)， 陸春，馬寒，等.不同生物群解脲脲原體對紅霉素耐藥基因的分布差異［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志， 2010，24（8）：699-701，711.

［17］ 王春艷，杜江，吳森林，等.gyrA和parC基因突變與脲原體喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)性研究［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（10）：63-66.

［18］FENG C， HUANG Y， YU Y， et a1.Effects on quinolone resistance due to the biofilm formation activity in Ureaplasma urealyticum［J］. Turk J Med Sci，2015， 45（1）：55-59.

［19］趙縝，趙芳，黃婭，等.拓?fù)洚悩?gòu)酶基因突變在脲原體對喹諾酮耐藥中的作用［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（4）：424-425.

［20］MAZZARIOL A，TOKUE Y，KANEGAWAW TM，et al. Hilevel fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coli overproduce multidrug efflux protein AcrA［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44（1）：344l-3443.

［21］KAWAI Y， NAKURA Y， WAKIMOTO T，et al.In vitro activity of five quinolones and analysis of the quinolone resistance-determining regions of gyrA， gyrB， parC， and parE in Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum clinical isolates from perinatal patients in Japan［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2015，59（4）：2358-2364.

［22］BEETON ML，CHALKER VJ，KOTECHA S，et a1. Comparison of full gyrA，gyrB，parC and parE gene sequences between all Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum scrovars to separate true fluoroquinolone antibiotic resistance mutations from non-resistance polymorphism［J］.J Antimicrob Chemother，2009，64（3）：529-538.

Study on resistance genes in Ureaplasma isolates

ZHANG Yan， LI Suli， HUA Chuan. （Laboratory Department， the NO.252 Hospital of PLA， Baoding Hebei 071000， China）

Objective To examine the relationship between resistance genes and antibiotic resistance in Ureaplasma isolates. Methods Mycoplasma assay kits were used to culture and identify Ureaplasma isolates and perform antimicrobial susceptibility testing. PCR and DNA sequencing analysis were conducted to analyze relevant genes， including gyrA， parC， 23SrRNA， tetM. Results The results of susceptibility testing showed that more than 92.6% of Ureaplasma isolates were susceptible to minocycline and doxycycline. More than half （53.7%） of Ureaplasma isolates were resistant ofloxacin. One isolate was resistant to all the drugs tested. Sequencing analysis of resistance genes revealed two mutations in tetM gene， one mutation in parC gene， and three mutations in 23SrRNA gene， but no mutation in gyrA. Conclusions Ureaplasma isolates were relatively sensitive to tetracyclines， but more resistant to quinolones. The resistant genes like parC， 23SrRNA and tetM play an important role in development of resistance in Ureaplasma.

Ureaplasma； resistant gene； gene mutation

·論著·

R375

A

1009-7708（2016）01-0067-05

10.16718/j.1009-7708.2016.01.015

解放軍252醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北保定 071000。

張艷（1982—），女，碩士研究生，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

張艷，E-mail： breeze0827@sina.com。

2015-03-16

2015-05-18