李達(dá)周，王　雯， 許斌斌， 王　蓉， 劉建強(qiáng)， 林克榮， 鄒多武

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二甲雙胍、塞來昔布對化學(xué)誘導(dǎo)異常隱窩病灶預(yù)防機(jī)制的研究

李達(dá)周1，王雯1， 許斌斌1， 王蓉1， 劉建強(qiáng)1， 林克榮1， 鄒多武2

目的探討二甲雙胍、塞來昔布對氧化偶氮甲烷(AOM)誘導(dǎo)的異常隱窩病灶(ACF)的預(yù)防機(jī)制。方法45只7周齡BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為對照組、二甲雙胍組、塞來昔布組3組，分別予腹腔注射AOM；同時對照組、二甲雙胍組、塞來昔布組小鼠分別予生理鹽水、二甲雙胍、塞來昔布灌胃處理。每周監(jiān)測小鼠體質(zhì)量變化。6周后處死小鼠并分離結(jié)直腸組織，應(yīng)用PCNA免疫組織化學(xué)染色及TUNEL染色的方法檢測病變組織的增殖及凋亡的情況；使用ELISA檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素以評估小鼠胰島素的抵抗?fàn)顟B(tài)。結(jié)果二甲雙胍組和塞來昔布組的細(xì)胞增殖指數(shù)分別為(27.30±1.49)和(37.20±2.10)，顯著低于對照組(56.20±1.93)(P<0.05)，二甲雙胍對細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于塞來昔布(P<0.05)；二甲雙胍組和塞來昔布組的細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(7.70±1.25)和(7.00±1.05)，顯著高于對照組(5.10±1.37)(P<0.05)；對照組、二甲雙胍組、塞來昔布組的小鼠空腹血糖及胰島素抵抗指數(shù)比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論二甲雙胍、塞來昔布對大腸癌起到預(yù)防的作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)；二甲雙胍的作用明顯優(yōu)于塞來昔布。

二甲雙胍； 磺胺類； 吡唑類； 結(jié)直腸腫瘤

隨著我國飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變，大腸癌的死亡率升至第2位[1]，并成為發(fā)病率增長最快的腫瘤之一。大腸癌在一般人群中的發(fā)生率約為2%，在西方國家的發(fā)生率更是達(dá)到3%～4%[2]。盡管診斷及治療水平不斷提高，大腸癌的預(yù)后仍然較差。因此，積極預(yù)防和治療癌前病變對提高療效及節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用具有重要意義。

異常隱窩病灶(aberrant crypt foci，ACF)是在1987年由Bird在制作結(jié)腸癌小鼠模型時發(fā)現(xiàn)的[3]，隨后的研究認(rèn)為，ACF是結(jié)直腸腫瘤的最早期癌前病變，因?yàn)槠鋮⑴c了ACF—腺瘤—腺癌序列的演變，所以使用化學(xué)誘導(dǎo)的ACF動物模型可以用來評估藥物對大腸癌預(yù)防的療效及其機(jī)制[4]。

許多研究已經(jīng)證實(shí)一些藥物具有化學(xué)預(yù)防作用，如補(bǔ)充纖維素、阿司匹林、非甾體類抗炎藥和選擇性環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑等[5]。已有研究證實(shí) ，塞來昔布、二甲雙胍可以預(yù)防ACF，且二甲雙胍預(yù)防作用更佳，但是其具體機(jī)制仍不明確。本研究旨在探討二甲雙胍、塞來昔布二者對化學(xué)誘導(dǎo)ACF的預(yù)防機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動物6周齡SPF級的BALB/c雌性小鼠45只[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，SCXK(滬)2012-0002]。飼養(yǎng)于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科動物房，每日光照時間為12 h，保持基礎(chǔ)飲食。

1.2方法

1.2.1ACF小鼠模型的建立小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)(10 mg/kg)，每周1次，連續(xù)2周。

1.2.2分組采用完全隨機(jī)方法，分為對照組、二甲雙胍組及塞來昔布組,各15只。干預(yù)措施及劑量：在腹腔注射氧化偶氮甲烷的同時開始藥物干預(yù)，對照組予生理鹽水灌胃處理；二甲雙胍組、塞來昔布組分別予二甲雙胍250 mg·kg-1·d-1、塞來昔布20 mg·kg-1·d-1灌胃處理；干預(yù)期間小鼠保持基礎(chǔ)飲食。

1.2.3觀察指標(biāo)每周定時監(jiān)測體質(zhì)量并記錄。治療6周后，小鼠空腹12 h后予抽血后處死，分離大腸組織，作如下研究：

1.2.3.1細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫組織化學(xué)染色將烘烤后的切片予脫蠟與復(fù)水；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高溫高壓抗原修復(fù)；將上述切片浸泡于PBS液中，采用免疫組織化學(xué)專用油筆在距組織周圍2 mm處劃圈，以PBS液洗滌；室溫條件下將組織切片浸泡于3%H2O2液中，繼續(xù)用PBS液沖洗；切片上直接加入已稀釋的兔抗小鼠PCNA一抗后，放入4 ℃冰箱中過夜；甩去多余液體后滴加二步法試劑盒中Polymer Helper，常溫下隔水式恒溫烤箱孵育20 min；滴加試劑盒中相應(yīng)辣根酶標(biāo)記抗兔二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色；復(fù)染、脫水、透明、封片，切片進(jìn)行鏡檢。

PCNA染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：PCNA以細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)棕黃色為陽性信號。高倍鏡下隨機(jī)選擇10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)：

PI=(陽性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.3.2轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸生物素缺口末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling，TUNEL)方法同PCNA。TUNEL法中凋亡細(xì)胞胞核呈棕色至棕褐色深染，形態(tài)不整，大小不一，正常細(xì)胞為藍(lán)紫色。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野。計算凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)：

AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.3.3酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素分別將標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(每孔10 μL)加入相應(yīng)孔中，快速加入HRP連接抗體工作液(每孔100 μL)；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育120 min；洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干；加入顯色劑TMB每孔100 μL，避光室溫孵育10 min；加入終止液每孔50 μL，混勻后即刻測量OD450值。

嚴(yán)格按照上述操作方法檢測FINS。再應(yīng)用穩(wěn)態(tài)模式評估法(homeostasis model assessment,HOMA)中的HOMA-IR公式評估胰島素抵抗(insulin resistance，IR)水平：

HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5

2　結(jié)　果

2.1大腸上皮細(xì)胞凋亡及增殖情況小鼠病變組織的凋亡與增殖情況分別由TUNEL染色及PCNA染色檢測，二甲雙胍組和塞來昔布組的AI分別為(7.70±1.25)和(7.00±1.05)，高于對照組的(5.10±1.37)(P<0.05)。二甲雙胍組和塞來昔布組的PI分別為(27.30±1.49)和(37.20±2.10)，低于對照組(56.20±1.93)(P<0.05)，且二甲雙胍對細(xì)胞增殖的抑制作用顯著強(qiáng)于塞來昔布(P<0.05)。上述結(jié)果顯示了2種藥物對ACF均有較為明顯的誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的作用(圖1)。

2.2小鼠ACF及AC數(shù)量經(jīng)二甲雙胍和塞來昔布干預(yù)后的小鼠ACF分別為(3.67±0.58)和(5.60±0.89)，其AC數(shù)量分別為(8.33±0.58)和(13.40±1.67)，而未經(jīng)藥物干預(yù)的對照組小鼠ACF及AC數(shù)量分別為(8.80±0.84)和(26.75±2.63)，3組兩兩比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3干預(yù)后小鼠的血糖及IR干預(yù)6周后，對照組、二甲雙胍組和塞來昔布組3組小鼠的空腹血糖比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(H=0.285，P=0.867)；3組的IR比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(H=1.62，P=0.445)，單獨(dú)使用二甲雙胍不會引起低血糖反應(yīng)，且二甲雙胍并不會對正常小鼠的胰島素水平產(chǎn)生影響(圖2)。

3　討　論

COX-2抑制劑藥物塞來昔布相較于非選擇性非甾體類抗炎藥，其引起胃腸道不良反應(yīng)較少。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，塞來昔布可減少ACF數(shù)量，進(jìn)而對結(jié)直腸癌起到化學(xué)預(yù)防作用[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，塞來昔布通過抑制細(xì)胞的增殖及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而起到預(yù)防ACF的作用，雖然作用機(jī)制還不明確，但是現(xiàn)有的研究考慮其主要是通過抑制COX-2來發(fā)揮作用。

二甲雙胍的抗癌作用機(jī)制復(fù)雜，可能與其全身性作用(間接)和局部性作用(直接)有關(guān)。有研究顯示，高胰島素血癥與某些腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[7]，二甲雙胍可能通過降低血液中的胰島素水平、改善胰島素抵抗，從而間接地抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。但是本實(shí)驗(yàn)中血清指標(biāo)顯示，對照組和二甲雙胍組二者之間的空腹胰島素以及HOMA-IR差別無統(tǒng)計學(xué)意義，說明在正常小鼠即非糖尿病模型小鼠中，二甲雙胍并不是通過全身性作用發(fā)揮其抗癌療效的。因此，在預(yù)防正常個體結(jié)直腸癌方面，二甲雙胍可能主要通過其局部的直接作用起到抗癌的作用。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來減少ACF的形成，且二甲雙胍在抑制細(xì)胞增殖方面較塞來昔布更強(qiáng)，其預(yù)防作用更佳。一些研究發(fā)現(xiàn)，激活的腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)可能在腫瘤的生長增殖、細(xì)胞周期及凋亡等多過程中發(fā)揮作用[8-9]；而目前普遍認(rèn)為，二甲雙胍可能主要通過激活A(yù)MPK/mTOR通道來直接抑制腫瘤的生長。本實(shí)驗(yàn)中，二甲雙胍可能也是通過激活A(yù)MPK來達(dá)到其抑制ACF的作用。當(dāng)然，其局部性作用除AMPK依賴途徑以外，還存在一些非AMPK依賴的抗腫瘤途徑，如氨基酸可通過Rag GTPases激活mTORC1信號[10]，二甲雙胍能夠通過使Regulator復(fù)合物失活來抑制mTORC1信號，從而模仿氨基酸戒斷的影響[11]。因此，在二甲雙胍抗腫瘤機(jī)制方面仍有待進(jìn)一步的深入研究。

本研究顯示，二甲雙胍、塞來昔布均可抑制病變組織的增殖及促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而影響癌前病變的發(fā)生發(fā)展達(dá)到預(yù)防的目的。雖然二者具體機(jī)制仍有待研究，但是其在抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面作用得到證實(shí)，且二甲雙胍的作用明顯優(yōu)于塞來昔布，進(jìn)一步顯示了其應(yīng)用于結(jié)直腸癌預(yù)防的廣闊的前景。

[1]Yusup A,Wang H J,Rahmutula A,etal. Clinical features and prognosis in colorectal cancer patients with different ethnicities in Northwest China[J].WorldJGastroenterol，2013,19(41):7183-7188.

[2]Ferlay J,Shin H R,Bray F,etal. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J].IntJCancer, 2010,127(12):2893-2917.

[3]Bird R P. Observation and quantification of aberrant crypts in the murine colon treated with a colon carcinogen: preliminary findings[J].CancerLett,1987,37(2):147-151.

[4]Raju J. Azoxymethane-induced rat aberrant crypt foci：Relevance in studying chemoprevention of colon cancer[J].WorldJGastroenterol, 2008,14(43):6632-6635.

[5]Lang M, Gasche C. Chemoprevention of colorectal cancer[J].DigDis, 2015,33(1):58-67.

[6]李軍,呂愈敏,金珠,等. 塞來昔布對二甲基肼誘導(dǎo)的大鼠畸變隱窩灶的預(yù)防作用[J]. 中華消化雜志,2004,24(3):151-153.

[7]Pollak M N. Investigating metformin for cancer prevention and treatment:the end of the beginning[J].CancerDiscov, 2012,2(9):778-790.

[8]Kuhajda F P. AMP-activated protein kinase and human cancer:cancer metabolism revisited[J].IntJObes(Lend), 2008,32(4):36-41.

[9]Jansen M,Ten Klooster J P,Offerhaus G J,etal. LKB1 and AMPK family signaling:the intimate link between cell polarity and energy metabolism[J].PhysiolRev, 2009,89(3):777-798.

[10]Efeyan A,Zoncu R,Chang S,etal. Regulation of mTORC1 by the Rag GTPases is necessary for neonatal autophagy and survival[J].Nature, 2013,493(7434):679-683.

[11]Pierotti M A,Berrino F,Garibolhi M,etal. Targeting metabolism for cancer treatment and prevention: metformin, an old drug with multi-faceted effects[J].Oncogene, 2013,32(12):1475-1487.

(編輯:張慧茹)

Chemopreventive Mechanism of Metformin or Celecoxib on Chemically Induced Colorectal Aberrant Crypt Foci in Mice

LI Dazhou1, WANG Wen1, XU Binbin1, WANG Rong1, LIU Jianqiang1, LIN Kerong1, ZOU Duowu2

1.Department of Gastroenterology, Fuzhou Genera Hospital of Nanjing Military Command,Fuzhou Clinical Medical College of Second Military Medical University,Fuzhou 350025,China;2.Department of Gastroenterology,Changhai Hospital, Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

ObjectiveTo investigate chemopreventive mechanism of metformin or celecoxib on chemically induced colorectal aberrant crypt foci in mice.MethodsForty five 6-week-old BALB/c female mice were randomly divided into 3 groups: control group, metformin group and celecoxib group.After one week adaptation, the mice were injected intraperitoneally with 10 mg/kg of AOM, once a week for two weeks.The mice in control group, metformin group and celecoxib group were treated with saline, metformin and celecoxib by gavage, respectively.The changes in body weight were monitored weekly in mice.After 6 weeks, mice were sacrificed and the colorectal tissues were separated.Proliferation of lesions tissue was detected by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) labeling indices, and apoptosis was detected by transferase deoxynucleotidyl uridine end labeling (TUNEL) staining.Moreover, to assess the state of mice insulin resistance, the fasting plasma glucose and insulin in mice were detected.ResultsThe proliferation index (PI) of metformin group and celecoxib group were respectively (27.30±1.49) and (37.20±2.10)，which was lower than that of the control group (56.20±1.93), (P<0.05).Metformin had stronger inhibitory effect than celecoxib on cell proliferation (P<0.05).The apoptosis index (AI) in metformin group and celecoxib group were (7.70±1.25) and (7.00±1.05) respectively, which was higher than that in the control group (5.10±1.37), (P<0.05).No significant difference in fasting plasma glucose and insulin resistance index of mice was found between control group, metformin group and celecoxib group (P>0.05).ConclusionWe confirm that metformin and celecoxib may play a preventive role for colorectal cancer.The mechanism may be related to the inhibition of cell proliferation and promoting of apoptosis.Moreover, the effect of metformin is better than celecoxib.

metformin; sulfonamides; pyrazoles; colorectal neoplasms

2016-01-08

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2014Y0038)

李達(dá)周(1973-),男,副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

1.第二軍醫(yī)大學(xué) 福州臨床醫(yī)學(xué)院，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 消化科，福州350025；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 附屬長海醫(yī)院消化科,上海200433

鄒多武. Email: duowuzou@hotmail.com

R-332； R730.231； R735.34； R735.35； R735.37； R977.3； R979.3

A

1672-4194(2016)03-0163-04