韓樹鑫, 白艷菊,*, 張　威,, 高艷玲,, 范國(guó)權(quán),, 張　抒, 申　宇

( 1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 哈爾濱 150086； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 哈爾濱 150030 )

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蚜蟲中攜帶馬鈴薯卷葉病毒檢測(cè)方法的改進(jìn)

韓樹鑫2, 白艷菊1,2*, 張威1,2, 高艷玲1,2, 范國(guó)權(quán)1,2, 張抒1, 申宇1

( 1. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 哈爾濱 150086； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 哈爾濱 150030 )

馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleafrollvirus，PLRV)對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)的危害極大，是一種極為重要的馬鈴薯病毒病。RT-PCR是馬鈴薯卷葉病毒檢測(cè)較為常用的方法，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確率高、成本低、適用范圍廣。但在實(shí)際生產(chǎn)中其檢測(cè)對(duì)象多為染病植株，對(duì)PLRV傳播的主要介體桃蚜(Myzuspersicae)的檢測(cè)，則由于蚜蟲體積小、RNA提取難度大、成本高、且不能復(fù)檢，因而在生產(chǎn)中不能被廣泛使用。該研究以馬鈴薯感病植株和帶毒蚜蟲為材料，利用改進(jìn)的RNA提取方法從它們中提取到PLRV的RNA，并以CP基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：該方法提取的RNA完整性好，可用于蚜蟲中PLRV檢測(cè)，且同樣適用于對(duì)馬鈴薯感病植株的檢測(cè)。另外，通過對(duì)田間有翅蚜和無翅蚜攜帶PLRV情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無翅蚜PLRV檢出率為100%，有翅蚜PLRV檢出率也高達(dá)60%，證明該體系在生產(chǎn)中的實(shí)用性。該研究使用改進(jìn)的RNA提取方法，提取蚜蟲中RNA，并利用RT-PCR進(jìn)行了PLRV檢測(cè)，與以前的方法相比簡(jiǎn)單實(shí)用，可被應(yīng)用于生產(chǎn)檢測(cè)中。該研究結(jié)果為馬鈴薯生產(chǎn)中PLRV的防控提供了一種新的手段。

馬鈴薯卷葉病毒, 蚜蟲, CP基因, 檢測(cè)

在世界各地的馬鈴薯生產(chǎn)中，馬鈴薯卷葉病毒(Potatoleafrollvirus，PLRV)是馬鈴薯生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病毒之一，可以造成馬鈴薯的產(chǎn)量及品質(zhì)嚴(yán)重下降。PLRV是單分子正義ssRNA病毒，屬黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的成員，基因組長(zhǎng)約5.9 kb，具有6個(gè)讀碼框架。病毒粒子為等軸對(duì)稱二十面體，無包膜，直徑為25～30 nm(Van Regenmorte et al，2000；張鶴齡，1996；)。桃蚜(Myzuspersicae)屬于半翅目(Hemipte)蚜科(Aphididae)，其寄主植物在280種以上，是多種植物病毒的主要傳播媒介。PLRV主要靠蚜蟲中的桃蚜以持久、循環(huán)增殖型方式傳播，另外還能通過嫁接傳播，但不能經(jīng)汁液機(jī)械接種傳毒，在寄主植株體內(nèi)的分布主要局限于維管束內(nèi)。受其侵染的植株的癥狀主要為葉片邊緣以主脈為中心向上卷曲，病重時(shí)呈圓筒狀，葉質(zhì)厚而脆，呈皮革狀，植株矮小，枝葉僵化，并因韌皮部被破壞，在莖橫切面可見黑點(diǎn)，莖基部和節(jié)部更為明顯，有的品種塊莖組織表現(xiàn)為導(dǎo)管區(qū)網(wǎng)狀壞死斑紋，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和產(chǎn)量(KOJ，1969)。

在目前的馬鈴薯生產(chǎn)中，為防止馬鈴薯卷葉病毒對(duì)其生產(chǎn)造成危害，常用的檢測(cè)預(yù)防措施的檢測(cè)對(duì)象為植物組織，即首先，通過植株癥狀初步判斷是否感染了PLRV，如疑似感染則通過DAS-ELISA(Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay，DAS-ELISA)或RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定田間植株中是否含有PLRV(李楠楠等，2011；張華鵬等，2011)，但當(dāng)確定植株中含有馬鈴薯卷葉病毒時(shí)，事實(shí)上田間馬鈴薯植株已經(jīng)發(fā)生，受PLRV感染的植株數(shù)量以遠(yuǎn)大于可控制的程度。而針對(duì)傳毒介體蚜蟲中病毒的檢測(cè)方法雖已有報(bào)道，并且也還有一些研究者在繼續(xù)研究。由于單頭蚜蟲體積極小，目前，研究者們遇到最大的問題就是蚜蟲中總RNA提取，因?yàn)?，只有提取出完整的、質(zhì)量合格的RNA，才能進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，合適的提取方法提取的RNA可以被保存于適當(dāng)?shù)臈l件下，以便日后復(fù)檢或進(jìn)行其它的實(shí)驗(yàn)研究。而目前以報(bào)道的對(duì)單頭蚜蟲中RNA的提取并鑒定的方法則主要是根據(jù)Singh et al (1996); Singh(1999)使用微量離型機(jī)和微量離心管，在微量離心管中利用降解液將蚜蟲組織直接降解，并使用保護(hù)液保護(hù)降解液中的RNA，從而直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR檢測(cè)的方法。這類檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)，操作方便，不需專門提取RNA，但同樣存在一些缺點(diǎn)：首先，降解液及保護(hù)液配置復(fù)雜，不能利用簡(jiǎn)單的試劑直接完成；第二，使用降解液進(jìn)行RT-PCR，由于蚜蟲體內(nèi)的其它組織及RNA的干擾，此檢測(cè)方法極易出現(xiàn)漏檢或者錯(cuò)檢；第三，蚜蟲組織的降解液并不能長(zhǎng)期保存，如檢測(cè)出現(xiàn)問題，無法進(jìn)行復(fù)檢，也無法進(jìn)行其它的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。雖然，Nie & Singh (2001)通過加入Dnase I的方式改進(jìn)Singh的方法，并對(duì)蚜蟲中的病毒進(jìn)行了多重RT-PCR檢測(cè)，但這種方法依然存在以上的問題。另外，近年來還有許多針對(duì)蚜蟲攜帶病原檢測(cè)的研究，如劉永清等利用(2010)利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、反轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nested-PCR)以及實(shí)時(shí)RT-PCR(Real-time RT-PCR)對(duì)蚜蟲中的柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)進(jìn)行了定性及定量分析，但使用的提取方法，依然是利用前人對(duì)蚜蟲中病毒RNA的提取方法(Metha，1997)。

隨著我國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)馬鈴薯病毒病的檢測(cè)和預(yù)防逐漸上升為馬鈴薯生產(chǎn)中極為重要的一項(xiàng)工作，所以需要一種既簡(jiǎn)單又實(shí)用的檢測(cè)方法對(duì)馬鈴薯病毒病的傳毒介體進(jìn)行檢測(cè)，以便開展相關(guān)的防治工作。但目前對(duì)PLRV檢測(cè)還停留在針對(duì)已受感染植株的初級(jí)階段，而不多的針對(duì)傳毒介體的檢測(cè)方法則有著各種各樣的缺點(diǎn)和不實(shí)用性，不能作為生產(chǎn)中經(jīng)常使用的檢測(cè)方法。本研究采用常規(guī)的RT-PCR方法對(duì)PLRV的傳播介體-桃蚜進(jìn)行檢測(cè)，并針對(duì)單頭蚜蟲的總RNA提取困難的特點(diǎn)，利用相關(guān)儀器配合改進(jìn)了提取方法，使其可以簡(jiǎn)便的提取出蚜蟲的總RNA，并進(jìn)行檢測(cè)。另外，通過使用本方法，可在馬鈴薯植株未發(fā)現(xiàn)受PLRV侵染前，檢測(cè)地塊周圍的蚜蟲，進(jìn)而提前進(jìn)行PLRV的防控。

表 1　馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)引物

1　材料與方法

1.1 材料

攜帶PLRV的帶毒蚜蟲(數(shù)只)、染病馬鈴薯植株及作為陰性對(duì)照的無毒蚜蟲均來自于黑龍江省農(nóng)業(yè)學(xué)院植物脫毒苗木研究所。待測(cè)蚜蟲采集于哈爾濱市民主鄉(xiāng)，在馬鈴薯卷葉病發(fā)病地塊采集有翅蚜15只，馬鈴薯卷葉病發(fā)病植株上采集無翅蚜15只，用于驗(yàn)證檢測(cè)方法的可靠性。

1.2 酶與試劑

試驗(yàn)所用的限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、dNTP、植物RNA提取試劑(Trizol)分別購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、Promega公司和Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)PLRV比較保守的CP基因序列設(shè)計(jì)、引用引物，具體詳情見表1。

1.4 PLRV的檢測(cè)

1.4.1 蚜蟲及馬鈴薯的總RNA提取本文采用經(jīng)過改進(jìn)的Trizol法提取單個(gè)蚜蟲RNA。取1只蚜蟲放入2 mL的離心管中，迅速放入液氮中將蚜蟲冷凍至死，打開管蓋，加入2個(gè)直徑2 mm的玻璃珠(玻璃珠的表面為磨砂面)，蓋上離心管蓋，將離心管放入液氮中充分冷卻, 趁離心管在液氮中冷卻后溫度較低，使用植物樣品研磨機(jī)(MM400 Retsch)利用其高速震蕩使玻璃珠在離心管中對(duì)樣品進(jìn)行研磨，研磨完成后將離心管重新放入液氮中，以防止樣品溫度升高。由于蚜蟲體積較小，研磨粉碎后組織主要集中在管壁和玻璃珠上，所以利用已經(jīng)預(yù)冷的冷凍臺(tái)式離心機(jī)(MIKRO 220R Hettich Zentrifugen)對(duì)研磨后的樣品進(jìn)行12 000g，離心10 s(離心時(shí)間過長(zhǎng)，樣品易降解)，離心后向離心管中立即加入1 mL Trizol后充分混勻(加入Trizol時(shí)使用移液器將Trizol沿離心管壁沖洗管壁)，并將離心管水平放置滾動(dòng)數(shù)次，使可能還附著在管壁上的蚜蟲組織充分地與Trizol接觸，水平靜置于試驗(yàn)臺(tái)10 min，以使樣品充分降解。加入200 μL氯仿, 劇烈振蕩混勻30 s，室溫(15～25 ℃)放置15 min；然后，將樣品放入冷凍臺(tái)式離心機(jī)，12 000g, 4 ℃離心15 min。經(jīng)離心后可見樣品分為3層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。小心吸取上層水相至另一離心管中加入等體積的異丙醇混勻(由于蚜蟲體積小，組織含量少，這時(shí)的中間層雖然肉眼很難分辨，但還是要盡量的多吸取水相層)在室溫(15～25 ℃)下放置10 min。將樣品放入冷凍臺(tái)式離心機(jī)中, 12 000g, 4 ℃離心10 min;由于單個(gè)蚜蟲中RNA含量極少，所以移去上清液的過程需極小心，盡量不要用移液器吸頭接觸到管壁, 以防止RNA 丟失; 用的使用RNase free水配制75%乙醇洗滌2次, 每次500 μL, 12 000g, 室溫(15～25 ℃)離心5 min; 徹底吸去上清液, 室溫干燥5～10 min 使酒精完全揮發(fā); 用25 μL RNase free水溶解RNA 樣品, 分光光度法測(cè)定RNA 濃度及純度同時(shí)使用電泳法檢測(cè)RNA完整性。

植物總RNA提取，按Trizol試劑說明書按步驟進(jìn)行。

1.4.2 cDNA第一鏈的合成以上一步中提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反應(yīng)步驟: PCR管中加入模板RNA 4 μL，Random primer 1 μL，用DEPC處理過的無菌水補(bǔ)齊至10 μL。70 ℃加熱5 min。冰上冷卻2 min后向PCR管中加入5 × Buffer 5 μL，dNTP 1.25 μL(10 mmol·L-1)， RNasin 0.5 μL (40 U·μL-1), M-MLV 1 μL(200 U·μL-1)，用DEPC處理過的無菌水補(bǔ)齊至25 μL。按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng): 37 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min (酶失活)后，冰上冷卻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PLRV的RT-PCR檢測(cè)及產(chǎn)物的序列測(cè)定以上一步合成的cDNA第一鏈為模板，使用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)并測(cè)序。檢測(cè)步驟： 在PCR管中加入制備的cDNA 2 μL，dNTP 2 μL(2.5 mmol·L-1)，rTaq 0.25 μL(5 U·μL-1)，10× PCR Buffer 5 μL，上下游引物 (10 mmol·L-1) 各0.5 μL，用DEPC水定容到25 μL的反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增條件: 94 ℃ 2 min預(yù)變性后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性20 s, 55.5 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s), 72 ℃延伸5 min,4 ℃∞。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由華大基因進(jìn)行測(cè)序。

2　結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

本研究中，選取并設(shè)計(jì)了一共3對(duì)引物，并且3對(duì)引物都成功擴(kuò)增出特異性條帶(圖1、圖2、圖3)?？紤]到檢測(cè)的實(shí)用性和檢測(cè)結(jié)果的易分辨性，我們選用引物PLRV-CP。

2.2 RNA的提取

以單頭蚜蟲為材料，使用改進(jìn)的方法對(duì)其的總RNA進(jìn)行了提取，提取完成后取5 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，雖然RNA的電泳后顏色較淡，說明其濃度較低，但RNA的完整性良好，由于RT-PCR檢測(cè)靈敏性高并對(duì)使用RNA要求不高，所以試驗(yàn)提取的RNA可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 蚜蟲攜帶PLRV病毒RT-PCR檢測(cè)

以單頭帶毒蚜蟲的總RNA為模板，并使用帶毒馬鈴薯植株為陽性對(duì)照，采用PLRV特異性引物PLRV-CP，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，帶毒蚜蟲和馬鈴薯病株擴(kuò)增得到特異性條帶沒有差異，說明該體系適用蚜蟲體內(nèi)卷葉病毒的檢測(cè)(圖4)。

圖 1　引物PLRV2627 擴(kuò)增結(jié)果　M. 100 bp分子量標(biāo)記； 1. 陰性對(duì)照； 2. 陽性對(duì)照； 3-6. 帶毒蚜蟲。下同。Fig. 1　Amplification results of PLRV2627 with PLRV M. 100 bp Marker; 1. Negative control; 2. Positive control; 3-6. Viruliferous aphid. The same below.

圖 2　引物PLRVLR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2　Amplification results of PLRVLR with PLRV

2.4 PLRV的序列測(cè)定及序列同源性比較

應(yīng)用引物PLRV-CP對(duì)蚜蟲攜帶PLRV病毒的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(圖5)。利用BLAST工具與GenBank中已公布的PLRV分離物CP基因序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)核苷酸同源性均在 99%以上，證明成功擴(kuò)增得到了PLRV的CP基因，同時(shí)也表明從蚜蟲中提取的總 RNA可以被用于檢測(cè)PLRV。

2.5 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

2.5.1 有翅蚜中的PLRV的檢測(cè)利用商品薯地塊中隨機(jī)采集的有翅蚜進(jìn)行檢測(cè)方法的驗(yàn)證，15只有翅蚜經(jīng)RT-PCR后利用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)檢(圖6)。圖6結(jié)果表明，在15只有翅蚜的試驗(yàn)檢測(cè)驗(yàn)證中，共有9只體內(nèi)被檢測(cè)出含有PLRV，檢出率為60%。由于試驗(yàn)中使用的是有翅蚜，而有翅蚜在自然地塊中是有流動(dòng)性的。在本次試驗(yàn)中，地塊中的有翅蚜為隨機(jī)采集，部分蚜蟲可能未能吸食到含有PLRV的馬鈴薯葉汁，所以本次驗(yàn)證中在部分蚜蟲中未檢測(cè)到PLRV。

圖 3　引物PLRV-CP擴(kuò)增結(jié)果 Fig. 3　Amplification results of PLRV-CP with PLRV

圖 4　RNA提取結(jié)果　M. 分子量標(biāo)記； 1-2. 帶毒蚜蟲； 3-4. 帶毒馬鈴薯植株； 5. 陽性對(duì)照； 6. 陰性對(duì)照。Fig. 4　Results of RNA extraction　M. Marker; 1-2. Viruliferous aphid; 3-4. Infected plant; 5. Negative control; 6. Positive control.

圖 5　使用PLRV-CP對(duì)PLRV的檢測(cè)M. 100 bp 分子量標(biāo)記； 1. 陰性對(duì)照; 2. 陽性對(duì)照； 3-4. 帶毒蚜蟲； 5. 帶毒馬鈴薯植株。Fig. 5　Amplification and detection of PLRV with PLRV-CP M. 100 bp Marker; 1. Negative control； 2. Positive control; 3-4. Viruliferous aphid; 5. Infected plants.

圖 6　有翅蚜樣品中的PLRV的檢測(cè)　M. 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1-2. 帶毒蚜蟲陽性對(duì)照； 3. 蚜蟲陰性對(duì)照； 4-16. 田間有翅蚜。Fig. 6　Detection of PLRV in samples of alatae　M. Marker; 1-2. Negative control; 3. Positive control; 4-16. Alatae.

圖 7　無翅蚜樣品中的PLRV的檢測(cè)　M. 分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1、2. 帶毒蚜蟲陽性對(duì)照； 3. 蚜蟲陰性對(duì)照； 4-13. 田間無翅蚜。Fig. 7　Detection of PLRV in samples of wingless aphid M. Marker； 1-2. Negative control; 3. Positive control; 4-13. Wingless aphid.

2.5.2 無翅蚜的PLRV檢測(cè)與有翅蚜的驗(yàn)證方式相同，利用在商品薯地塊卷葉病毒株上的無翅蚜進(jìn)行檢測(cè)方法的驗(yàn)證，試驗(yàn)使用無翅蚜15只，經(jīng)RT-PCR后電泳檢測(cè)(圖7)。由圖7可知，在無翅蚜的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)所有被檢測(cè)的無翅蚜中，PLRV檢測(cè)均呈陽性。由于無翅蚜不能飛行，所以在地塊中無翅蚜的流動(dòng)性與有翅蚜相比較差，試驗(yàn)采集的無翅蚜來源于地塊中疑似含有PLRV的植株，試驗(yàn)結(jié)果也證明在含有PLRV的葉片上采集的無翅蚜，其體內(nèi)已吸食的植物葉汁中含有PLRV病毒的比例極高，并可以被RT-PCR方法所檢測(cè)。

3　討論

近年來，馬鈴薯在我國(guó)農(nóng)業(yè)中的地位在不斷地提高。出于對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)的保障，馬鈴薯病毒病的檢測(cè)越來越受到重視。由于馬鈴薯病毒病發(fā)病區(qū)域廣、面積大，且發(fā)病后造成的經(jīng)濟(jì)損失及生態(tài)環(huán)境損失極大，這使馬鈴薯病毒檢測(cè)受到重視的程度不斷升高。目前馬鈴薯生產(chǎn)中，大多數(shù)種子均為經(jīng)過脫毒的馬鈴薯種薯，使用這種種子的好處在于，經(jīng)過脫毒后，種子中并不攜帶馬鈴薯病毒，這樣可以避免由于種子帶毒而造成馬鈴薯病毒病的發(fā)生。目前生產(chǎn)中馬鈴薯病毒病的發(fā)生，多數(shù)是在出芽后，經(jīng)由蚜蟲等傳毒介體傳播而來，所以在蚜蟲還未在地塊中大規(guī)模出現(xiàn)的時(shí)候，對(duì)馬鈴薯病毒病傳毒介體的檢測(cè)是預(yù)防馬鈴薯病毒病的一種非常實(shí)用的方法。現(xiàn)今馬鈴薯病毒檢測(cè)較為常用的方法為血清學(xué)檢測(cè)，當(dāng)血清學(xué)鑒定不能準(zhǔn)確提供檢測(cè)結(jié)果時(shí)，則使用RT-PCR進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。RT-PCR可以在樣品中病毒含量極少的情況下就可以檢測(cè)到是否有病毒存在，且RT-PCR方法成本較低，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。國(guó)際上，很早就開始了對(duì)馬鈴薯病毒的檢測(cè)，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)了許多新方法?？墒沁@些方法僅有極少的能被應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，主要原因就是因?yàn)檫@些技術(shù)檢測(cè)對(duì)象主要為馬鈴薯植株，僅有少部分檢測(cè)方法能被應(yīng)用于傳毒介體，且由于這些方法需要的條件較高或檢測(cè)預(yù)報(bào)的前瞻性較差導(dǎo)致在實(shí)際生產(chǎn)檢測(cè)中并不實(shí)用(Du et al，2006)。Metha et al(1997)利用的多種方法提取了不同數(shù)量的蚜蟲的RNA,并進(jìn)行了檢測(cè)。Coffin et al(1997)利用從植物樣本中提取的總RNA對(duì)PLRV和馬鈴薯Y病毒進(jìn)行了檢測(cè)。Russo et al(1999)則利用相似的方法對(duì)佛羅里達(dá)州的PLRV的發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查。同樣,我國(guó)對(duì)PLRV的研究、檢測(cè)、鑒定也是如此。吳興全等(2006)對(duì)PLRV福建分離物的CP序列進(jìn)行了克隆及序列分析。周云和楊永智(2008)利用PLRV基因組保守序列片段，使用RT-PCR方法對(duì)PLRV進(jìn)行了檢測(cè)及研究。張威等(2014)利用了多重RT-PCR檢測(cè)了馬鈴薯材料中的三種病毒。本研究利用改進(jìn)的RNA提取方法，成功地提取了單頭蚜蟲中的RNA，經(jīng)電泳檢測(cè)RNA的完整性良好，可以被用于RT-PCR檢測(cè)中。同時(shí)，從三組不同的引物中篩選出了最適合的引物對(duì)帶毒蚜蟲進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，此方法與其它的方法相比(Singh,1999；Nie & Singh,2001)具有試驗(yàn)普適性強(qiáng)，試劑配制方便，復(fù)檢方便的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在有翅蚜和無翅蚜的檢測(cè)中，PLRV的檢出率遠(yuǎn)高于使用傳統(tǒng)提取方法進(jìn)行檢測(cè)的檢出率(Metha et al，1997)。

馬鈴薯生產(chǎn)中使用RT-PCR對(duì)蚜蟲中的病毒進(jìn)行檢測(cè)，可以對(duì)蚜蟲攜帶病毒情況的掌握，能及時(shí)對(duì)PLRV的發(fā)生流行起到預(yù)警的作用，有利于防控。通常，馬鈴薯植株的檢測(cè)用于對(duì)病害發(fā)生的客觀評(píng)價(jià)，而當(dāng)植株被檢測(cè)出病毒，或發(fā)病癥狀較重時(shí)，馬鈴薯已受到病毒侵害，且不可逆轉(zhuǎn)。利用植物中的總RNA檢測(cè)PLRV需要以新鮮植物組織進(jìn)行RNA提取，而馬鈴薯由播種到生長(zhǎng)為可采摘新鮮葉片的個(gè)體需要一定的時(shí)間，同時(shí)PLRV從侵染到發(fā)病也需要一定時(shí)間，這樣就導(dǎo)致使用馬鈴薯葉片進(jìn)行PLRV的鑒定在生產(chǎn)使用中存在一定時(shí)間的滯后性，進(jìn)而導(dǎo)致PLRV對(duì)馬鈴薯的生產(chǎn)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。PLRV的傳播主要是由蚜蟲引起，有翅蚜一方面是其它地塊遷飛而來，另一方面則是在本地塊產(chǎn)生，對(duì)于遷飛來的蚜蟲帶毒情況的檢測(cè)結(jié)果，可作為預(yù)警依據(jù)，指導(dǎo)及早防病，甚至在馬鈴薯田間沒有出苗的時(shí)候，就可以通過檢測(cè)周圍雜草等指示植物、有翅蚜掌握帶毒情況。無翅蚜棲息在馬鈴薯植株上，活動(dòng)范圍有限，無翅蚜攜帶病毒與馬鈴薯田間病毒的發(fā)生有密切相關(guān)性，通過田間蚜蟲數(shù)量與帶毒率就可以預(yù)測(cè)該地塊卷葉病毒的發(fā)生、流行情況，結(jié)合蚜蟲防治數(shù)據(jù)，進(jìn)而可以推斷出馬鈴薯感染卷葉病毒的狀況。所以，通過蚜蟲中PLRV的檢測(cè)，可以為馬鈴薯生產(chǎn)中病毒病的防控提供一種新的方法。

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Improved method detectionPotatoleafrollvirusin aphids

HAN Shu-Xin2, BAI Yan-Ju1，2*, ZHANG Wei1,2, GAO Yan-Ling1，2,FAN Guo-Quan1，2, ZHANG Shu1, SHEN Yu1

( 1.HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences, Harbin 150086, China; 2.NortheastAgriculturalUniversity, Harbin 150030, China )

In the potato production,Potatoleafrollvirus(PLRV) can be caused enormous harm，so that the PLRV is a very important disease in potato production. RT-PCR is a commonly used method for detection of the PLRV, and the detection method is high accuracy, low cost and widely used for detection of the PLRV in potato production. But in the actual production, the samples of detection often are the infected plants, and theMyzuspersicaethat is the main mediator of PLRV is not detected, because of the aphid’s small volume, RNA extraction of high difficulty, high cost, and that can not be rechecked extraction. For these reasons, the detection method of RT-PCR can not often be used in the potato production. In this paper, we used potato susceptible plants and viruliferous aphids as experimental materials, and used the improved method of RNA extraction from which they were extracted by PLRV RNA. Then, we made detection with PCR, and the specific primers were designed that refer of CP gene. The experimental results showed that the RNA extraction of potato susceptible plants and viruliferous aphids was integral that could be used to detect the PLRV in aphids, and it also can be used to detect the PLRV in potato susceptible plants. In addition, we used this method to detect the field of aphids and wingless aphids carrying PLRV. Wingless aphids PLRV positive rate was 100%, the positive rate of PLRV of aphids was as high as 60%, which proved that there was a good pragmatism of the practicability of the system in potato production. In this study, we used the improved efficacious method to extract RNA, and used RT-PCR to detect the PLRV in aphids. Compared with the detection of method, the new method is simple and practical, it can be used in potato production test, and it is a new means for the prevention and control of the PLRV in the potato production.

Potatoleafrollvirus, aphid, CP gene, detection

10.11931/guihaia.gxzw201411004韓樹鑫, 白艷菊, 張威， 等. 蚜蟲中攜帶馬鈴薯卷葉病毒檢測(cè)方法的改進(jìn) [J]. 廣西植物， 2016， 36(8):986-992

HAN SX, BAI YJ, ZHANG W， et al. Improved method detectionPotatoleafrollvirusin aphids [J]. Guihaia， 2016， 36(8):986-992

2014-11-03

2015-03-28

國(guó)家農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng) (CARS-10-P14) [Supported by Special Fund for Technology System of Modern Agricultural Industry from Ministry of Agriculture (CARS-10-P14)]。

韓樹鑫(1984-)，男，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锓肿硬±韺W(xué)，(E-mail)pluto789@163.com。

白艷菊，碩士，研究員，研究方向?yàn)橹参锓肿硬±韺W(xué)，(E-mail)yanjubai@163.com。

Q945.8

A

1000-3142(2016)08-0986-07