李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100 )

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兩個(gè)蘇丹草品系成熟種子的組織培養(yǎng)和植株再生研究

李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 胡能兵， 王世建

( 安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 安徽 鳳陽 233100 )

該研究以蘇丹草品系S722和Sa的成熟種子為外植體、MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2，4-D和NAA各3個(gè)濃度共6個(gè)處理對這兩個(gè)蘇丹草品系成熟種子進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，探討不同品系在不同植物生長物質(zhì)濃度及植物生長物質(zhì)組合中誘導(dǎo)愈傷組織和繼代培養(yǎng)以及分化的能力。結(jié)果表明：蘇丹草S722和Sa成熟種子的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著，平均誘導(dǎo)率為17.19%。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D濃度為0.5或1 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳，而添加NAA不能提高愈傷誘導(dǎo)率。在繼代培養(yǎng)中，設(shè)定2，4-D和6-BA各兩個(gè)濃度共4個(gè)處理組合，處理1(2，4-D 1 mg·L-1+6-BA 0 mg·L-1)的繼代培養(yǎng)效果最佳。為了解不同植物生長物質(zhì)對愈傷分化的影響，設(shè)定6-BA、NAA 各兩個(gè)不同濃度、KT 3個(gè)不同濃度共5個(gè)處理組合對繼代培養(yǎng)的愈傷進(jìn)行分化培養(yǎng)。在5個(gè)處理中，處理1(6-BA 2 mg·L-1+NAA 0 mg·L-1+KT 0 mg·L-1)對S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷分化率最高，達(dá)33.3%。在這兩個(gè)蘇丹草品系中，S722更容易分化培養(yǎng)。綜上結(jié)果表明，2，4-D濃度為1 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)愈傷和繼代培養(yǎng)效果較好，6-BA濃度為2 mg·L-1時(shí)分化效果較好。另外，針對不同蘇丹草品系進(jìn)行組織培養(yǎng)和植株再生時(shí)，適當(dāng)調(diào)整植物生長物質(zhì)濃度能提高植株再生的成功率。

蘇丹草， 種子， 組織培養(yǎng)， 植株再生， 植物生長物質(zhì)

蘇丹草(Sorghumsudanese)為禾本科高粱屬一年生草本植物，原產(chǎn)于非洲的蘇丹，因其飼草產(chǎn)量高，再生能力強(qiáng)，營養(yǎng)價(jià)值豐富，適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在我國大部分地區(qū)都有栽種(詹秋文等，2001)。蘇丹草是長江中下游地區(qū)最主要的夏季牧草，占該區(qū)域暖季型牧草種植面積在70%以上(徐玉鵬等，2003)。由于受夏季高溫高濕影響，蘇丹草在該地區(qū)種植時(shí)病害較重，影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為育種的一種重要手段，而組織培養(yǎng)技術(shù)則是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ)。因此，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高蘇丹草的抗病性，將成為蘇丹草抗病育種的一種新途徑。目前，以組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在水稻、玉米和棉花上得到了廣泛應(yīng)用(賈士榮等，2014；李娜等，2012；趙丹等，2013)。但與這些作物相比，通過組織培養(yǎng)獲得高粱和蘇丹草的再生植株則更難一些(Gurel et al, 2009；Liu & Godwin, 2012)。另外，組織培養(yǎng)技術(shù)在作物的種質(zhì)保存方面也有重要應(yīng)用(姚紹嫦等，2014；張衛(wèi)華等，2014)。但蘇丹草組織培養(yǎng)和植株再生的研究報(bào)道還較少。鐘小仙等(2005)以蘇丹草品系2098的幼穗為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，并獲得了再生植株。王立艷等(2006)以蘇丹草品系185成熟種子為外植體，研究了不同植物生長物質(zhì)配比對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，但未獲得再生植株。利用種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)具有不受季節(jié)限制、取材方便的優(yōu)點(diǎn)。但目前還未見以不同的蘇丹草品系成熟種子為外植體，并獲得再生植株的相關(guān)報(bào)道。本研究以本課題組培育的優(yōu)質(zhì)蘇丹草品系Sa和S722種子為外植體，試圖探明不同植物生長物質(zhì)的組合對種子愈傷組織的誘導(dǎo)和分化以及植株再生能力的影響，為蘇丹草的轉(zhuǎn)基因育種和功能基因組學(xué)的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料與藥劑

1.1.1 材料 本研究的材料為本課題組選育的蘇丹草品系Sa和S722的成熟種子。1.1.2 藥劑藥劑NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MaSO4·2H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4· 5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、EDTA-Na2·2H2O、HgCl2、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇、2,4-D、6-BA、NAA、KT等為分析純。所配MS培養(yǎng)基pH值為5.6～6.0，蔗糖30 g·L-1，瓊脂5 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子的滅菌處理分別取蘇丹草品系Sa和S722成熟種子192粒，放在自來水下沖洗5～10 min。在超凈工作臺(tái)面上，先用70%酒精處理30 s(輕輕搖動(dòng))后倒掉酒精；再用0.1%升汞處理15 min，無菌水沖洗4～5次。將處理過的種子放入滅菌的小三角瓶中，加入1/3無菌水，放在振蕩器上振蕩12 h左右。

1.2.2 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子愈傷組織的誘導(dǎo)每個(gè)處理組合每品系接8瓶，每瓶2粒種子，接種時(shí)將種子橫切為兩半，即每瓶接4個(gè)半粒的種子進(jìn)行成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，用于愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長物質(zhì)處理組合見表1。接種2周后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)結(jié)果和污染情況。培養(yǎng)的溫度為25 ℃，光照10 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 lx，黑暗14 h·d-1。

愈傷誘導(dǎo)率 = 出愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種的全部外植體個(gè)數(shù) × 100%。

表 1　蘇丹草愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長物質(zhì)處理組合

1.2.3 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)接種2周后，對愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，愈傷組織繼代培養(yǎng)的植物生長物質(zhì)處理組合見表2，每個(gè)品系接種8瓶。繼代培養(yǎng)2周后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，培養(yǎng)條件和愈傷組織誘導(dǎo)的條件相同。

表 2　蘇丹草愈傷組織繼代培養(yǎng)的植物生長物質(zhì)處理組合

1.2.4 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)繼代培養(yǎng)3周后，對繼代培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)，每品系每個(gè)處理組合接5瓶?；A(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，用于分化培養(yǎng)的植物生長物質(zhì)處理組合見表3。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500 lx，黑暗10 h·d-1。

分化率=成苗數(shù)/接種數(shù) × 100%

1.2.5 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722分化苗的移栽當(dāng)分化苗長到10 cm左右時(shí)，將其移栽到小營養(yǎng)缽中(根上的小塊培養(yǎng)基不去除)，并加入適量的營養(yǎng)土。先將移栽的苗放在與分化培養(yǎng)相同溫度和光照強(qiáng)度的培養(yǎng)箱中煉苗1周后，再放到室外培養(yǎng)1周，移栽到大田，并統(tǒng)計(jì)成活率。

成活率 = 成活苗數(shù)/分化苗數(shù) × 100%

表 3　蘇丹草愈傷組織分化培養(yǎng)的植物生長物質(zhì)處理組合

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析在Excel和DPS軟件中完成。

2　結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子愈傷組織誘導(dǎo)比較分析

從總體上來看，這兩個(gè)蘇丹草品系成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)率不高，平均為17.19%；而褐化率較高，平均達(dá)33.33%(表4)。這兩個(gè)品系誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色和特征基本相似，都是白色半透明、疏松質(zhì)軟，成不規(guī)則的塊狀(圖1)。

6個(gè)處理之間愈傷組織形成率差異較大，最小的為處理6，平均為4.69%，而最大的為處理4，平均為21.88%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，這6個(gè)處理的愈傷組織形成率之間差異顯著，但前5個(gè)處理之間差異不顯著。這說明當(dāng)2,4-D和NAA(萘乙酸)都為較大濃度時(shí)，蘇丹草愈傷組織的形成率降低較明顯。從以上結(jié)果看出，添加NAA不但不能提高蘇丹草成熟種子愈傷的誘導(dǎo)率，在較大濃度時(shí)還會(huì)使誘導(dǎo)率降低。因此， 2,4-D對蘇丹草成熟種子愈傷組織形成率起促進(jìn)作用，而誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中合適的2,4-D濃度為0.5或1 mg·L-1。

圖 1　蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織　A. Sa; B. S722。下同。Fig. 1　Callus induced from mature seeds of Sa and S722　A. Sa; B. S722. The same below.

表 4　兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)愈傷結(jié)果

注： 不同小寫字母表示在0.05水平上顯著。下同。

Note: Different small letters mean significant differences at 0.05 level. The same below.

另外，進(jìn)一步比較這兩個(gè)蘇丹草品系的愈傷組織形成率則表明，兩個(gè)蘇丹草品系成熟種子的愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.2 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)的比較分析

為了解植物生長物質(zhì)對愈傷組織繼代增殖的影響，設(shè)定2種不同濃度的6-BA與2，4-D組合對愈傷組織進(jìn)行繼代增殖。結(jié)果表明，處理2(2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1)的效果很差，愈傷組織接種以后變?yōu)辄S褐色，生長很慢(圖2:A)。相反，處理1(2,4-D 1.0 mg·L-1)的效果較好，愈傷組織為淡黃色，質(zhì)地疏松，增殖較快(圖2: B)。這說明在增殖培養(yǎng)基中添加6-BA，對愈傷組織生長有抑制作用，并導(dǎo)致愈傷組織褐化。

2.3 兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)結(jié)果的比較分析

從5個(gè)不同植物生長物質(zhì)處理的結(jié)果來看，這5個(gè)處理都能使愈傷組織分化成苗，但不同處理組合的分化效果不一致。從分化的時(shí)間上來看，從出現(xiàn)綠點(diǎn)到芽的形成一般為4～9 d。這5個(gè)處理分化效果有較大差異，其中只有處理3能使這兩個(gè)蘇丹草品系都分化成苗。另外，在這5個(gè)處理中，只有處理5不能使S722分化成苗，而其它4個(gè)處理都能夠使S722分化成苗。這說明相對于蘇丹草品系Sa來看，S722更容易分化成苗。因此，對于不同的蘇丹草品系其分化效果不一致，如S722處理1的分化率最高，達(dá)33.3%。綜合看來，不同蘇丹草品系對植物生長物質(zhì)種類及濃度要求不同。如果需要達(dá)到最佳的分化效果，研究者應(yīng)對不同的蘇丹草品系愈傷植物生長物質(zhì)濃度進(jìn)行優(yōu)化。

2.4 兩個(gè)蘇丹草Sa和S722品系再生植株的移栽分析

愈傷分化出苗1個(gè)月，對再生植株進(jìn)行煉苗和移栽。結(jié)果表明S722的移栽成活率達(dá)65%，Sa的成活率則達(dá)75%。這說明再生植株能成活， 而且這兩個(gè)蘇丹草品系再生植株的成活率較高。

圖 3　蘇丹草品系Sa和S722分化成苗Fig. 3　Regenerated plants of Sa and S722

表 5　兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織繼代培養(yǎng)結(jié)果

3　討論

蘇丹草為高粱屬草本植物，而高粱是公認(rèn)的組織培養(yǎng)較困難的一種作物。目前，對于蘇丹草組織培養(yǎng)的研究還較少，所選用的外植體只有成熟種子和幼穗。鐘小仙等(2005)利用蘇丹草幼穗進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，誘導(dǎo)頻率為80%～90%，誘導(dǎo)率較高。王立艷等 (2006) 利用蘇丹草185的成熟種子進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高為26.6%。在本研究中，蘇丹草S722在2，4-D濃度為0.5 mg·L-1加NAA為0.2 mg·L-1的MS培養(yǎng)中的誘導(dǎo)率為31.25%，而Sa在2，4-D濃度為1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為25%。從上述可以看出，幼穗為外植體的誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于成熟種子，但成熟種子具有取材方便，在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)不受季節(jié)限制的優(yōu)點(diǎn)。本研究中，成熟種子誘導(dǎo)率較低，其主要原因是褐化率較高。因此，如何控制褐化來提高誘導(dǎo)率則需要更進(jìn)一步的研究。

表 6　兩個(gè)蘇丹草品系Sa和S722成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織分化培養(yǎng)結(jié)果

蘇丹草和所有高粱屬植物一樣，在組織培養(yǎng)過程中易褐化，褐化產(chǎn)生的酚類物質(zhì)影響愈傷的生長，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致愈傷死亡。呂宗友等(2011)研究表明，活性炭、Vc、PVP和AgNO3均能不同程度地降低褐化率。Wu et al(2014)對高粱的研究表明，丹寧含量較低的高粱材料其褐化率也較低。在本研究中，在繼代培養(yǎng)和分化培養(yǎng)時(shí)，不同的植物生長物質(zhì)處理也會(huì)造成愈傷組織褐化。例如，在繼代培養(yǎng)中添加6-BA會(huì)造成蘇丹草愈傷組織褐化。因此，在對高粱屬植物進(jìn)行組織培養(yǎng)中，適當(dāng)?shù)闹参锷L物質(zhì)水平是需要考慮的一個(gè)重要因素。

高粱的組織培養(yǎng)研究表明，不同的高粱材料愈傷誘導(dǎo)率有較大差異，例如高粱Tx430就比較容易成功(朱莉等, 2011; Liu et al, 2014; Zhao et al, 2000)。本研究中，蘇丹草S722和Sa在愈傷誘導(dǎo)率上差異不顯著，但在最后的分化成苗則表現(xiàn)出較大的差異，S722更容易分化成苗。這說明，不同的品系之間在組織培養(yǎng)上有較大的差異。因此，選用更容易進(jìn)行分化的材料，能更容易獲得再生植株。本研究則表明S722比Sa更適合進(jìn)行組織培養(yǎng)。

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Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains

LI Jie-Qin, WANG Li-Hua, ZHAN Qiu-Wen, HU Neng-Bing, WANG Shi-Jian

(CollegeofAgriculture,AnhuiScienceandTechnologyUniversity, Fengyang 233100, China )

In the study, mature seeds of sudangrass strains S722 and Sa as explants were used to study the factors affecting callus induction, subculture and differentiation using different combinations of plant growth substances and MS (Murashige and Skoog) media for basic media. Six treatment combinations, including three different levels of 2,4-D and NAA, were used to induce callus from mature seeds of two sudangrass strains in callus induction process. The results showed that the percentage of callus induction was not significantly different between the two sudangrass strains. And the average percentage of callus induction was 17.19% for the two sudangrass strains. The proper concentration of 2, 4-D for callus induction was 0.5 or 1 mg·L-1in MS media. The percentage of callus induction did not changed when NAA was added in basic media in callus induction process. The results showed that it was not helpful for callus induction when NAA was added in MS basic media. Four treatment combinations including two different concentrations of 2,4-D and 6-BA were used to subculture for induced callus. The best combination was treatment No. 1, which included 1 mg·L-12, 4-D and 0 mg·L-16-BA. When 6-BA was added in MS basic media, callus became brown and the growth of callus was also inhibited. These results indicated that 6-BA inhibited the growth of callus in subculture process when 6-BA was added in MS basic media. To gain a better understanding about the effects of different combinations of plant growth substances in callus differentiation, five treatment combinations including two different 6-BA and NAA concentrations and three different concentrations of KT were used to differentiate for callus when the callus had been subcultured. Treatment No.1 was the best combination in the five treatment combinations. And the differentiation rate of callus from mature seeds of S722 was 33.3% when 2 mg·L-16-BA was added in MS basic media. It was the highest differentiation rate when the concentration of 6-BA was added in media. Callus from S722 mature seeds were more easily differentiated than the other sudangrass strain Sa. Summarily, the best concentration of 2,4-D for callus induction and subculture was 1 mg·L-1in basic media when mature sudangrass seeds were used for explants. 6-BA had inhibition effects for callus in subculture process. And the best concentration of 6-BA for callus differentiation was 2 mg·L-1in basic media. The different sudangrass strains should use different combinations of plant growth substances in tissue culture process. Therefore, plant regeneration rate would be improved if the concentrations and combinations of plant growth substances were adjusted in media for tissue culture and plant regeneration of sudangrass when different sudangrass strain’s mature seeds were used as explants.

sudangrass, seeds, tissue culture, plant regeneration, plant growth substances

10.11931/guihaia.gxzw201409050李杰勤， 王麗華， 詹秋文， 等. 兩個(gè)蘇丹草品系成熟種子的組織培養(yǎng)和植株再生研究[J]. 廣西植物， 2016， 36(8):930-936LI JQ, WANG LH, ZHAN QW， et al. Tissue culture and plant regeneration using mature seeds of two sudangrass strains[J]. Guihaia， 2016， 36(8):930-936

2014-09-26

2015-03-24

國家自然科學(xué)基金(31301383)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(ZRC2013371)；國家“星火”計(jì)劃項(xiàng)目(2012GA710076)；安徽省省級學(xué)科建設(shè)重大項(xiàng)目—草學(xué)(皖教秘科[2014]28)；農(nóng)業(yè)部科研任務(wù)專項(xiàng)(201503133)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31301383); Natural Science Research Program of Anhui Science and Technology Univesity(ZRC2013371)； National Spark Plan(2012GA710076); Anhui Key Program of Discipline ([2014]28); Special Fund for Scientific Research of Agricultural Ministry(31301383)]。

李杰勤(1980-)，男，四川屏山人，博士，講師，主要從事飼草遺傳育種研究，(E-mail) wlhljq@163.com。

Q943.1

A

1000-3142(2016)08-0930-07