葛風(fēng)偉， 曾衛(wèi)軍， 李艷紅， 趙惠新

( 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 烏魯木齊 830054 )

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小蓬NeMT2基因的克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建

葛風(fēng)偉， 曾衛(wèi)軍， 李艷紅， 趙惠新*

( 新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 烏魯木齊 830054 )

該研究利用RACE (Rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)從小蓬中成功分離編碼金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)的cDNA序列，命名為NeMT2，在GenBank中登錄號(hào)為KT835290。該基因全長(zhǎng)590 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?37 bp，編碼78個(gè)氨基酸，編碼的氨基酸序列中含有14個(gè)半胱氨酸殘基(Cys，C)，呈C-C，C-X-C，C-X-X-C排列，集中分布在肽鏈的N端和C端，基因編碼蛋白的分子量為7.603 6 kD，等電點(diǎn)為4.71。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，小蓬金屬硫蛋白NeMT2與藜科的海蓬子(AEF01492)和鹽穗木(AHI62953)同源性最高，其次是甜菜(XP_010667708.1)。生物信息學(xué)分析表明，金屬硫蛋白NeMT2無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，屬于非跨膜親水性蛋白；疏水性分析表明，NeMT2蛋白的35～45個(gè)氨基酸之間有較強(qiáng)的疏水性，其中第41位Asp具最強(qiáng)的疏水性(1.444)；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件是無(wú)規(guī)則卷曲。通過(guò)RT-PCR對(duì)NeMT2基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，NeMT2基因在銅礦區(qū)和非銅礦區(qū)的小蓬葉片中均有表達(dá)，但該基因在銅礦區(qū)小蓬葉片的表達(dá)量明顯高于非銅礦區(qū)。將小蓬NeMT2基因定向克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300的35S 啟動(dòng)子下游，構(gòu)建該基因的植物超表達(dá)載體pCAMBIA1300+NeMT2。該研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能和小蓬響應(yīng)重金屬脅迫的分子機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)。

小蓬，NeMT2， RACE， 序列分析， 植物表達(dá)載體

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量(6 000～7 000 Da)蛋白，富含半胱氨酸(Cystine，Cys)，對(duì)多種金屬有高度親和性。植物金屬硫蛋白在重金屬離子解毒及金屬離子代謝(常團(tuán)結(jié)和朱禎，2002a)、活性氧清除(Akashi et al，2004)、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存金屬離子(Belghith et al, 2016)、維持金屬離子穩(wěn)態(tài)(Hegelund et al, 2012)等方面起到重要作用。另外，該基因還參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、胚胎發(fā)育、果實(shí)成熟、衰老和抗逆反應(yīng)等植物生理過(guò)程(常團(tuán)結(jié)和朱禎，2002a，b；Charbonnel-Campaa et al, 2000)。因此，對(duì)金屬硫蛋白基因MT的研究將成為植物抗逆研究中的一個(gè)重要方向(樊連梅等，2011)。目前，已從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到擬南芥等多種植物的金屬硫蛋白基因，但對(duì)其功能研究還知之甚少。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的日新月異，植物抗逆基因資源的開(kāi)發(fā)及轉(zhuǎn)基因育種方面的研究，已成為植物逆境分子生物學(xué)的熱點(diǎn)和農(nóng)業(yè)抗逆領(lǐng)域的重要課題(顏宏等，2006)。

小蓬(Nanophytonerinaceum)是藜科小蓬屬植物，是重要的抗逆植物。常生于戈壁、石質(zhì)山坡，其適應(yīng)性極強(qiáng)，在我國(guó)僅分布于新疆(新疆植物志編委會(huì)，1994)。阿勒泰市是新疆重點(diǎn)有色金屬開(kāi)發(fā)帶，通過(guò)前期野外考察發(fā)現(xiàn)小蓬是阿勒泰富蘊(yùn)縣銅礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)物種之一。目前對(duì)小蓬的研究多集中在抗逆生理學(xué)方面，關(guān)于其抗逆的分子機(jī)制尤其是小蓬金屬硫蛋白基因MT的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以小蓬葉片為材料，通過(guò)RACE技術(shù)從小蓬中克隆得到金屬硫蛋白基因NeMT2的cDNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息分析方法對(duì)NeMT2基因編碼的氨基酸序列與組成、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、發(fā)育樹(shù)進(jìn)化分析、跨膜區(qū)與信號(hào)肽、疏水性分析、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析了NeMT2基因的表達(dá)，以pCAMBIA1300載體為基本載體構(gòu)建了該基因的表達(dá)載體，上述工作將為小蓬金屬硫蛋白基因NeMT2功能的研究提供理論依據(jù)。

1　 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料利用大量采樣法分別采集生長(zhǎng)在新疆阿勒泰富蘊(yùn)縣銅礦區(qū)(46°45.477′ N，89°41.430′ E)和非銅礦區(qū)(距離銅礦區(qū)3.5 km的國(guó)道)的小蓬植株，選取株齡基本一致的小蓬頂端光合枝葉片作為材料。在小蓬生長(zhǎng)旺盛的銅礦區(qū)選取3個(gè)5 m × 5 m的采集區(qū)樣方，分別于每個(gè)樣方的4個(gè)方向各選1個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)選取5株共60株小蓬進(jìn)行樣品采集。同時(shí)選取距銅礦區(qū)3.5 km處的非礦區(qū)采集小蓬葉片，方法同礦區(qū)一致。收集的葉片樣品經(jīng)液氮處理后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-70 ℃冰箱中保存，提取的總RNA用于RT-PCR分析。

1.1.2 試劑菌株E.coliDH5α由實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒載體為pMD18-T Vector(Invitrogen)。MMLV第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自寶生物公司，TRIzol、DNA凝膠回收試劑盒(AxyGEN)、PCR擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自北京天根公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與第一鏈cDNA合成采用TRIzol法提取小蓬幼葉總RNA。提取的總RNA上樣于1%瓊脂糖凝膠中，檢測(cè)RNA的完整性。取11 μL的總RNA為模板，依據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。合成的cDNA樣品稀釋5～10倍，置于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)的基因克隆實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)金屬硫蛋白基因克隆引物(表1)，送至華大基因科技有限公司合成。

1.2.2NeMT2基因的克隆與序列測(cè)定根據(jù)本課題組前期研究獲得的金屬硫蛋白基因部分序列(KT821088，221 bp)，設(shè)計(jì)3′RACE上游引物GSP3′1 和GSP3′ 2(表1)進(jìn)行NeMT2基因3′序列的克隆。以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，表1相對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GSP3′ 1為上游引物，AP1為下游引物，進(jìn)行第1輪擴(kuò)增。GSP3′ 2為上游引物，AP2為下游引物，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。同樣根據(jù)NeMT2基因部分序列設(shè)計(jì)5′RACE的下游引物GSP5′1 和GSP5′2(表1)進(jìn)行NeMT2基因5′序列的克隆。以AP3為上游引物，GSP5′1 為下游引物，進(jìn)行第1輪擴(kuò)增反應(yīng)。以AP4為上游引物，GSP5′2為下游引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增反應(yīng)。

利用克隆獲得NeMT2的3′和5′的基因片段，拼接得到NeMT2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。用NCBI的ORF程序搜索NeMT2的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物NeMT2-F 和NeMT2-R(表1)，PCR擴(kuò)增NeMT2基因的編碼區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物上樣于1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)片段大小，根據(jù)凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行片段回收與純化。取4.5 μL純化產(chǎn)物與1 μL pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以氨芐為篩選標(biāo)記在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，之后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選重組子。挑取單克隆菌落搖菌培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定，菌液送華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.3NeMT2基因生物信息學(xué)分析用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST軟件進(jìn)行同源性搜索，用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測(cè)金屬硫蛋白基因的開(kāi)放閱讀框；用Conserved Domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析；之后使用ClustalX軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析；采用MEGA 5.0構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用ExPASy的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、親水性分析等理化性質(zhì)(Walker，2005)；用ExPASy的ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl) 以默認(rèn)算法 (Hphob./Kyte & Doolittle)

表 1　小蓬NeMT2基因克隆引物

進(jìn)行疏水性分析(Kyte et al，1982)；利用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred Server(http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行金屬硫蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對(duì)編碼蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(Petersen et al，2011)；用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)預(yù)測(cè)NeMT2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(Geourjon & Deleage，1995)。

1.2.4NeMT2基因RT-PCR表達(dá)分析利用大量采樣法分別采集生長(zhǎng)在新疆阿勒泰富蘊(yùn)縣銅礦區(qū)和非銅礦區(qū)小蓬植株，采集小蓬頂端光合枝的葉片用TRIzol法提取總RNA，用酶標(biāo)儀(Bio-tek ELx 800)測(cè)定RNA的濃度。分別取礦區(qū)和非礦區(qū)的小蓬葉片等量總RNA，依據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。根據(jù)藜科植物Actin基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物Actin-F：5′-GTGGTCGTACAACGGTATTGTG-3′，Actin-R：5′-GACCCTCCAATCCAGACACTG-3′。以反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，用上述合成的Actin引物和NeMT2基因特異性引物同批異管進(jìn)行RT-PCR基因表達(dá)分析。

1.2.5NeMT2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和PstI雙酶切含有NeMT2基因的克隆載體pMD18-T，pCAMBIA1300質(zhì)粒同樣進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行膠回收及純化。將目的基因與pCAMBIA1300載體進(jìn)行體外連接，構(gòu)建NeMT2基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300+NeMT2。隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在含Kan的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 。將轉(zhuǎn)化出來(lái)的單菌落通過(guò)搖菌，將經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定的陽(yáng)性菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將抽提的重組質(zhì)粒分別使用BamHI和PstI進(jìn)行雙酶切，根據(jù)片段大小鑒定質(zhì)粒的構(gòu)建。

2　結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

由圖1可見(jiàn)，28S、18S和5S條帶整齊清晰，表明所提總RNA完整性較好，沒(méi)有降解；紫外分光光度檢測(cè)OD260/OD280為1.8～2.0之間。提取的總RNA的純度及完整性都較高，可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄分析。

圖 1　RNA凝膠電泳圖Fig. 1　RNA agarose gel electrophoresis

2.2 小蓬金屬硫蛋白NeMT2基因的克隆

由圖2可知，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，Blastn比對(duì)結(jié)果顯示：其與藜科植物海蓬子MT基因(GenBank登錄號(hào)：KF876178.1)序列的同源性為83%，與鹽穗木MT2基因(GenBank登錄號(hào)：JF780913.1)序列的同源性為80%。小蓬金屬硫蛋白基因與其它植物的金屬硫蛋白基因的親緣關(guān)系也較近，序列同源性分析見(jiàn)表2，可推測(cè)其為MT家族成員。將克隆的基因命名為NeMT2，并提交到GenBank上，登錄號(hào)為KT835290。

克隆獲得的NeMT2基因全長(zhǎng)590 bp，通過(guò)生物信息學(xué)(ORF Finder)分析其完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)。發(fā)現(xiàn)該基因包含一個(gè)237 bp開(kāi)放閱讀框，編碼78個(gè)氨基酸，其中5′非編碼區(qū)211 bp，3′非編碼區(qū)412 bp(圖3)。

2.3 小蓬金屬硫蛋白NeMT2理化性質(zhì)預(yù)測(cè)及分析

ExPASy ProtParam預(yù)測(cè)表明，小蓬NeMT2基因編碼蛋白的分子式為C300H477N89O108S17，理論分子量為7.6036 kD，理論等電點(diǎn)為4.71；預(yù)測(cè)該蛋白的半衰期為30 h ，不穩(wěn)定參數(shù)為30.72 ，預(yù)測(cè)其為穩(wěn)定蛋白(< 40為穩(wěn)定蛋白)。相對(duì)含量較多的氨基酸有Gly (15個(gè)，19.2%)，Cys (14個(gè)， 17.9%)，Ala(8個(gè)，10.3%)，Asn (6個(gè)，7.7%)，Lys(5個(gè)，6.4%)，Pro(4個(gè)，5.1%)，Ser(4個(gè)，5.1%)，Thr(4個(gè)，5.1%)，Glu(4個(gè)，5.1%)，Asp(3個(gè)，3.8%)，Ile(3個(gè)，3.8%)，Met(3個(gè)，3.8%)，Phe(2個(gè)，2.6%)和Val(2個(gè)，2.6%)；相對(duì)含量較少的氨基酸有Tyr(1個(gè)，1.3%)；NeMT2蛋白不含有Pyl，Sec，Arg，Trp，Leu，Gln和His。親水性平均數(shù)為-0.027，預(yù)測(cè)NeMT2蛋白為親水性蛋白。

表 2　NCBI Blastn同源序列搜索

2.4 小蓬金屬硫蛋白NeMT2氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.4.1 金屬硫蛋白NeMT2氨基酸序列比對(duì)分析根據(jù)Blast搜索，篩選出與小蓬NeMT2蛋白序列相似度較高的7個(gè)植物金屬硫蛋白的同源序列，采用Clustal W軟件進(jìn)行多重序列的比對(duì)分析(圖4)。

發(fā)現(xiàn)小蓬NeMT2蛋白的氨基酸序列同藜科海蓬子(Salicorniabrachiata)和鹽穗木(Halostachyscaspica)相似序列較高。NeMT2基因編碼的氨基酸序列共有14個(gè)Cys殘基，該殘基主要集中在肽鏈的N端和C端。Cys殘基以C-C型，C-X-C型和C-X-X-C型排列，其中C-X-C型在該氨基酸序列出現(xiàn)了5次。該氨基酸中部不含有Cys，保守性很低?？梢?jiàn)，Cys殘基的數(shù)目和位置在不同物種間都有很高的保守性。根據(jù)Conserved Domains程序預(yù)測(cè)小蓬NeMT2蛋白的保守序列，發(fā)現(xiàn)第26～77個(gè)氨基酸之間的序列是Metallothionein-2的保守區(qū)，該區(qū)域具有金屬硫蛋白基因典型的結(jié)構(gòu)域特征，從而確定NeMT2基因?yàn)棰蝾惤饘倭虻鞍谆?ClassⅡ)(圖5)。

圖 2　小蓬NeMT2基因全長(zhǎng)cDNA及其推測(cè)的氨基酸序列　編碼區(qū)用下劃線標(biāo)出(起始密碼子ATG，終止密碼子TGA)。Fig. 2　Total cDNA sequence of NeMT2 gene from Nanophyton erinaceum and deduced amino acid sequence Coding sequence is underlined (initiation codon is ATG, and stop codon is TGA).

圖 3　NeMT2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增　M. 分子量標(biāo)記 (DL 2 000)； 1. 3′ RACE產(chǎn)物； 2. 5′ RACE產(chǎn)物； 3. CDS產(chǎn)物。Fig. 3　PCR amplification result of NeMT2 M. Marker (DL 2 000); 1. 3′ RACE product; 2. 5′ RACE product; 3. CDS product.

2.4.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析從NCBI上搜索了海蓬子、鹽穗木、蠅子草(Sileneniceensis)、甜菜(Betavulgaris)、紅樹(shù)(Bruguieragymnorhiza)蓮(Nelumbonucifera)、莧菜(Amaranthuscruentus)棉花(Gossypiumarboreum)、菠菜(Spinaciaoleracea)、馬黛茶(IIexparaguariensis)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、薺藍(lán)(Camelinasativa)和星星草(Puccinelliatenuiflora)共13種植物的金屬硫蛋白基因的氨基酸序列，用于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(圖6)。進(jìn)化分析表明，藜科的海蓬子(AEF01492)和鹽穗木(AHI62953)來(lái)自同一個(gè)進(jìn)化分枝，而本研究所克隆NeMT2基因所推測(cè)的氨基酸序列與這二者的同源性最高，其次是甜菜(XP_010667708.1)；而與蓮(XP_010253171)和馬黛茶(AFP93964)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.5 小蓬金屬硫蛋白NeMT2跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)及疏水性分析

蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，NeMT2蛋白的肽鏈位于細(xì)胞膜外，說(shuō)明該蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域。利用SignalP 4.1對(duì)NeMT2蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白并不存在信號(hào)肽序列?？梢?jiàn)，小蓬NeMT2蛋白屬于非跨膜、非分泌型蛋白。

通過(guò)Protscale程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的疏水性預(yù)測(cè)(圖7)結(jié)果可知，小蓬金屬硫蛋白NeMT2中部疏水性較強(qiáng)，而兩端則為親水區(qū)。由圖可知，第64位Cys的親水性最強(qiáng)，分值為-1.178(最低)；第41位Asp的疏水性最強(qiáng)，分值為1.444(最高)。

2.6 小蓬金屬硫蛋白NeMT2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

利用SOPMA程序預(yù)測(cè)小蓬金屬硫蛋白NeMT2的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖8)。由圖8可知，金屬硫蛋白NeMT2的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含65.38%的無(wú)規(guī)則卷曲、16.67%的α-螺旋、11.54%的延伸鏈、6.41%的β-折疊?？梢?jiàn)，無(wú)規(guī)則卷曲在該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中占有大多數(shù)，預(yù)測(cè)其形成α-螺旋、β-折疊的氨基酸很少。

2.7 NeMT2基因RT-PCR表達(dá)分析

以小蓬肌動(dòng)蛋白Actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行定量，通過(guò)RT-PCR對(duì)NeMT2基因在礦區(qū)和非礦區(qū)小蓬葉片中的表達(dá)進(jìn)行分析。圖9結(jié)果表明，NeMT2基因在銅礦區(qū)和非銅礦區(qū)的小蓬葉片中均有表達(dá)，但該基因在銅礦區(qū)小蓬葉片的表達(dá)量明顯高于非銅礦區(qū)。

圖 4　小蓬金屬硫蛋白NeMT2與7種植物MT蛋白序列的比對(duì)Fig. 4　Multiple sequence alignment of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum with MT protein from seven plants

圖 5　NeMT2氨基酸保守功能區(qū)Fig. 5　Conserved domain of NeMT2

圖 6　小蓬金屬硫蛋白NeMT2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析標(biāo)尺在左下方，Bootstap = 1 000。Fig. 6　Phylogenetic tree analysis of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum　The scale was at the bottom-left, and the bootstrap values based on 1 000 replicates were indicated.

圖 7　小蓬金屬硫蛋白NeMT2疏水性分析　Fig. 7　Hydrophobicity profile of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum

2.8 NeMT2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用BamHI和PstI雙酶切克隆載體pMD18-T+NeMT2和pCAMBIA1300，將NeMT2片段和pCAMBIA1300載體片段用 T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選的陽(yáng)性克隆用酶切驗(yàn)證(圖10)。從圖10(泳道3)可知，重組質(zhì)粒用BamHI和PstI雙酶切獲得一條約 230 bp的條帶，說(shuō)明構(gòu)建的植物表達(dá)載體已成功將小蓬NeMT2基因整合進(jìn)去。

3　討論

通過(guò)前期野外考察，發(fā)現(xiàn)小蓬是阿勒泰富蘊(yùn)縣銅礦區(qū)的優(yōu)勢(shì)物種。目前，關(guān)于金屬硫蛋白基因MT的結(jié)構(gòu)組成及特點(diǎn)、該基因在小蓬耐受重金屬脅迫過(guò)程中的作用等相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用RACE技術(shù)從小蓬葉片中克隆得到金屬硫蛋白基因NeMT2的cDNA全長(zhǎng)序列。通常依據(jù)氨基酸序列中Cys 殘基的排列方式對(duì)植物金屬硫蛋白基因進(jìn)行分類(張艷等，2007)。根據(jù)Cobbett & Goldsbrough(2002)的分類方法將小蓬金屬硫蛋白NeMT2歸為第Ⅱ類。Ⅱ類MT不存在信號(hào)肽序列，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非分泌親水性蛋白；其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件是無(wú)規(guī)則卷曲(孟紅恩等，2014)。對(duì)克隆得到的小蓬金屬硫蛋白NeMT2進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，NeMT2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分是無(wú)規(guī)則卷曲，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)中較少形成α-螺旋和β-折疊的肽段。張艷等(2006)認(rèn)為MT分子中不含α-螺旋和β-折疊肽段，但存在一種很堅(jiān)固的構(gòu)象，本研究的預(yù)測(cè)與該文獻(xiàn)相符。另外，NeMT2蛋白中共含有14個(gè)Cys殘基，占該蛋白總氨基酸的17.9%，這些Cys殘基主要分布在肽鏈的N端和C端。本研究同源序列比對(duì)表明，不同來(lái)源的植物金屬硫蛋白兩端序列的同源性很高，而中部同源性低，Cys殘基都集中分布在肽鏈的N端和C端，可見(jiàn)N端和C端序列對(duì)金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的重要性。金屬硫蛋白基因結(jié)構(gòu)典型的特征是Cys含量高(Hamer，1986)。該結(jié)構(gòu)也是金屬硫蛋白對(duì)重金屬脅迫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(劉瑜等，2011；Liu et al,2016)。

金屬硫蛋白與生物體內(nèi)的多種生理功能相關(guān)，其最為主要的功能就是解除重金屬離子的毒害作用，提高植物的重金屬耐性。金屬硫蛋白富含Cys殘基，肽鏈中巰基(SH)含量高因而導(dǎo)致其對(duì)重金屬的親和力高，該蛋白可以螯合Cu、Zn、Pb等18種重金屬，所以金屬硫蛋白在解除重金屬毒害方面起著重要作用(趙之偉等，2013)。龍葵的金屬硫蛋白MTS基因家族已被證明涉及重金屬鉻、銅的解毒(Fidalgo et al, 2013；Teixeira et al, 2013)。植物金屬硫蛋白兩端富含 Cys 的區(qū)域在中間區(qū)的幫助下相互接近，與金屬離子結(jié)合形成一個(gè)結(jié)構(gòu)域(Jordi et al，2006；孟紅恩等，2014)。在植物對(duì)Zn2+和Cu2+的解毒過(guò)程中，金屬硫蛋白是通過(guò)巰基與金屬離子結(jié)合，從而降低重金屬離子的毒性(Nathalie et al，2001)。但到目前為止，金屬硫蛋白參與植物重金屬解毒的作用機(jī)理仍不十分清楚。

植物金屬硫蛋白基因的表達(dá)具有可誘導(dǎo)性。植物金屬硫蛋白基因的表達(dá)受金屬離子、高鹽、干旱、低溫、熱激等不同環(huán)境因子的影響(全先慶等，2006；張艷等，2007)。目前研究最多的是植物金屬硫蛋白基因?qū)χ亟饘俚拿{迫響應(yīng)。Kumar et al(2012)研究發(fā)現(xiàn)，藜科植物海蓬子在高鹽、高溫和干旱脅迫處理下，金屬硫蛋白基因SbMT-2表達(dá)量增加；而受冷脅迫處理后，該基因的表達(dá)量明顯下降，說(shuō)明SbMT-2基因可能在提高海蓬子抵御逆境方面發(fā)揮了重要作用。轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)已廣泛用于金屬硫蛋白的功能研究，結(jié)果證實(shí)金屬硫蛋白不但能降低重金屬對(duì)植物的毒害，還能提高植物的耐受性(Brkljacic et al，2004；趙之偉等，2013)。Turchi et al(2012)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入菜豌豆金屬硫蛋白MTA1基因的白楊，對(duì)重金屬鋅和銅的抗性顯著提高；轉(zhuǎn)金屬硫蛋白MT基因的矮牽牛對(duì)鉛的抗性及吸收能力明顯增強(qiáng)(李偉等，2001)；轉(zhuǎn)木豆MT1基因的擬南芥植株，對(duì)重金屬Cu2+和Cd2+的抗性明顯提高(Sekhar et al，2011)。在擬南芥中表達(dá)MT4a基因提高了銅脅迫下植物的金屬耐性，使植物體中銅的積累量增加(Rodríguez-Llorente et al，2010)。植物金屬硫蛋白既受重金屬離子誘導(dǎo)又有重金屬解毒的作用，該蛋白可以作為一種重金屬污染生物標(biāo)志物(陳春等，2009)。

新疆阿勒泰富蘊(yùn)縣銅礦區(qū)和非銅礦區(qū)土壤重金屬Cu含量分別為4 035.65和1 100.09 mg·kg-1(前期研究結(jié)果)。本研究利用RT-PCR對(duì)小蓬NeMT2基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NeMT2基因在銅礦區(qū)小蓬葉片的表達(dá)量明顯高于非銅礦區(qū)。可見(jiàn)，NeMT2

圖 8　小蓬金屬硫蛋白NeMT2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 8　The secondary structures predication of metallothionein NeMT2 from Nanophyton erinaceum

圖 9　小蓬NeMT2基因的RT-PCR表達(dá)分析　M. 分子量標(biāo)記DL 2 000； 1. NeMT2基因(非銅礦區(qū))； 2. NeMT2基因(銅礦區(qū))； 3. Actin基因(非銅礦區(qū))； 4. Actin基因(銅礦區(qū))。Fig. 9　RT-PCR expression analysis of NeMT2 from Nanophyton erinaceum　M. Marker DL 2 000; 1. NeMT2 gene (nor-mining area); 2. NeMT2 gene (mining area); 3. Actin gene (nor-mining area)； 4. Actin gene (mining area).

圖10　Escherichia coli DH5a中的載體pCAMBIA1300+NeMT2的酶切驗(yàn)證　M. DNA分子量標(biāo)記; 1. pCAMBIA1300+NeMT2重組質(zhì)粒； 2. pCAMBIA1300+NeMT2重組質(zhì)粒BamH I單酶切產(chǎn)物； 3. pCAMBIA1300+NeMT2重組質(zhì)粒BamH I和Pst I雙酶切產(chǎn)物。Fig. 10　Identification by restriction of vector pCAMBIA1300+NeMT2 in Escherichia coli DH5a　M. DNA Marker; 1. Plasmid of pCAMBIA1300+NeMT2; 2. Plasmid of pCAMBIA1300+NeMT2 digestion with BamH I; 3. Plasmid of pCAMBIA1300+NeMT2 digestion with both BamH I and Pst I.

基因的表達(dá)隨著重金屬Cu含量的不同表現(xiàn)出明顯的變化，暗示該基因有可能參與小蓬對(duì)重金屬Cu脅迫的應(yīng)答過(guò)程。鑒于此，該基因可作為培育抗重金屬轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)良基因。當(dāng)然，該基因參與小蓬重金屬脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理還有待于更深入的研究。小蓬金屬硫蛋白基因NeMT2的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建，將為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and construction of plant expression vector ofNeMT2 gene inNanophytonerinaceum

GEFeng-Wei,ZENGWei-Jun,LIYan-Hong,ZHAOHui-Xin*

( Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology，College of Life Sciences， Xinjiang Normal University，Urumqi830054 )

Nanophytonerinaceumhas a long living history at Aletai Copper Mine in Xinjiang. In order to analyze the relation between metallothionein gene and heavy metal response stress, a new heavy metal-responsive gene cDNA sequence was successfully cloned by RACE (Rapid amplification of cDNA ends) fromN.erinaceum. The gene was named asNeMT2, and its accession number in GenBank was KT835290. The metallothionein geneNeMT2 was 590 bp in full length, and it had 237 bp ORF (open reading frame) which encoded 78 amino acid residues. There were 14 Cys residues, arranged in the form of C-C, C-X-C and C-X-X-C, in the 78 amino acid residues, and these Cys residues distributed in N terminal and C terminal of peptides. The protein encoding by geneNeMT2 molecular weight was 7.603 6 kD and its isoelectric point was 4.71. Phylogenetic analysis results demonstrated that the deduced amino acid sequence of geneNeMT2 was the highest homology as theSalicorniabrachiata(AEF01492) and theHalostachyscaspica(AHI62953), secondly theBetavulgaris(XP_010667708.1), but the lowest similarity with theNelumbonucifera(XP_010253171). Bioinformation analysis showed that metallothionein NeMT2 had no signal peptide and belonged to the hydrophilic non-transmembrane protein. Hydrophobicity analysis was carried out and the results showed that there was a strong hydrophobicity region between 35 to 45 amino acids, and the 41 Asp had the strongest hydrophobic property (1.444). Predication of structure indicated that random coil was the major components of its secondary structure. Expression analysis ofNeMT2 gene was carried out by RT-PCR. The results showed that expression ofNeMT2 gene was detected both in Copper Mine and nor Copper Mine inNanophytonerinaceumleaves, but the former was more stronger than the latter, which indicated thatNeMT2 gene was responsive to the heavy metal stress. ThenNeMT2 gene inNanophytonerinaceumwas cloned into 35S promoter downstream of plant over-expression vector pCAMBIA1300 in orientation. The plant overexpression vector pCAMBIA1300+NeMT2 was successfully constructed. These findings will provide information for the functional study ofNeMT2 and its molecular mechanism in repnse to the heavy metal stress.

Nanophytonerinaceum,NeMT2, rapid amplification of cDNA ends, sequence analysis, plant expression vector

10.11931/guihaia.gxzw201601029葛風(fēng)偉， 曾衛(wèi)軍， 李艷紅， 等. 小蓬NeMT2基因的克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建 [J]. 廣西植物， 2016， 36(8):897-905

GE FW, ZENG WJ, LI YH， et al. Cloning and construction of plant expression vector ofNeMT2 gene inNanophytonerinaceum[J]. Guihaia， 2016， 36(8):897-905

2016-01-19

2016-04-21

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2013211A024)[Supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang (2013211A024)]。

葛風(fēng)偉(1976-)，女，江蘇新沂人，博士，講師，從事植物逆境分子生物學(xué)研究，(E-mail)mastergfw@163.com。

趙惠新，博士，副教授，從事植物逆境分子生物學(xué)研究，(E-mail)954843437@qq.com。

Q786

A

1000-3142(2016)08-0897-09