林麗萍，朱亞麗，馬啟超，彭云杏，王紅霞，徐超

梅毒血清固定患者外周血細(xì)胞免疫功能的表達(dá)研究

林麗萍，朱亞麗，馬啟超，彭云杏，王紅霞，徐超

目的 分析梅毒血清固定患者外周血CD4、CD8、Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)情況，以探討細(xì)胞免疫功能與梅毒血清固定的關(guān)系。方法 采用流式細(xì)胞儀檢測梅毒血清固定患者、健康對照者及梅毒血清轉(zhuǎn)陰患者外周血CD4、CD8、Treg、Th17細(xì)胞的水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 血清固定組CD4和Th17與健康組比較明顯減少；血清固定組CD8和Treg與健康組比較明顯增多；血清固定組CD4和Th17與梅毒血清轉(zhuǎn)陰組比較明顯減少；血清固定組CD8和Treg與梅毒血清轉(zhuǎn)陰組比較明顯增多；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；梅毒血清轉(zhuǎn)陰組與健康對照組CD4、CD8、Th17、Treg細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。結(jié)論 梅毒血清固定患者可能存在CD4、CD8、Th17、Treg等T細(xì)胞亞群的失衡，從而影響梅毒患者的細(xì)胞免疫功能，造成梅毒患者血清固定。

血清固定；Treg；Th17；CD4；CD8

梅毒血清固定一直是臨床亟待解決的難題，可能與早期梅毒治療、病期、類型、是否為復(fù)發(fā)或再感染、體內(nèi)潛在病灶、機(jī)體細(xì)胞免疫受到抑制及合并其他疾病等多種因素有關(guān)。梅毒患者一旦發(fā)生血清固定，加大藥物劑量、延長療程也不能使血清學(xué)轉(zhuǎn)陰。由于血清固定患者復(fù)發(fā)率高達(dá)35%[1]，患者心理壓力巨大。目前血清固定形成的機(jī)制尚不清楚，傳統(tǒng)研究認(rèn)為梅毒血清固定患者存在細(xì)胞免疫失衡即CD4、CD8細(xì)胞等T細(xì)胞亞群的失衡[2]。本研究觀察梅毒血清固定患者外周血CD4、CD8、Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2012年10月至2014年9月寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院皮膚科梅毒血清固定患者和梅毒血清轉(zhuǎn)陰患者各35例的血清標(biāo)本。梅毒血清固定患者的判定標(biāo)準(zhǔn)為：確診梅毒并經(jīng)規(guī)則治療，連續(xù)跟蹤2年，不加熱血清反應(yīng)試驗(yàn)（TRUST）不轉(zhuǎn)陰者，并排除再感染、神經(jīng)梅毒及HIV感染者。血清固定組男21例，女14例；年齡20～51歲，平均（26.61±1.57）歲；血清TRUST稀釋原倍（+）。血清轉(zhuǎn)陰組男20例，女15例；年齡19～50歲，平均（25.87±1.43）歲。同時(shí)收集健康體檢者30例為正常對照組，男16例，女14例；年齡19～50歲，平均（26.11±1.76）歲。3組患者一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 試劑 CD3、CD4、CD8、CD25、抗IL-17的熒光抗體、同型對照抗體均購自Becton Dickinso公司；固定及破膜劑、淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞培養(yǎng)液、PMA、Ivnomycin、BFA均購自美國Sigma公司；流式細(xì)胞儀EPICS.XL型（BackmanCoulter公司）。

1.2.2 標(biāo)本制備 取患者外用血5 ml肝素抗凝，采用密度梯度法分離PBMC，并按6×106/ml濃度用RPMI1640重懸備用，IL-17分子在細(xì)胞內(nèi)濃度較低，檢測前需要先對細(xì)胞進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)，因而取出500l細(xì)胞懸液分別加入 25 g/L的PMA、1mg/L的伊屋諾霉素（ionomycin）和10 mg/L的BFA后，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h備用。

1.2.3 CD4和CD8細(xì)胞檢測 取EDTA抗凝血100l加20l CD3、CD4、CD8三色熒光抗體，混勻放置20～30 min（室溫避光），再加2 ml紅細(xì)胞裂解液，裂解10～15min（室溫避光），用PBS沖洗，最后500 l1%多聚甲醛PBS液固定細(xì)胞后上機(jī)檢測。

1.2.4 Treg細(xì)胞檢測 取4個試管各加入100 l未經(jīng)培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞懸液，其中3管分別加入相應(yīng)的同型對照抗體作為陰性對照，檢測管先加入CD4-FITC 和CD25PE-CY5抗體避光孵育，然后按說明書加入固定/破膜劑破膜后，再加入Foxp3-PE抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)記，標(biāo)本清洗后，PBS重懸上機(jī)檢測。

1.2.5 Th17細(xì)胞檢測 取經(jīng)過體外刺激的PBMC細(xì)胞懸液，參照檢測步驟，進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記，然后將細(xì)胞固定與破膜后加入PE標(biāo)記的抗IL-17單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)分子標(biāo)記，最后清洗，用PBS重懸上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法或Dunnett’s法。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血清固定組CD4和Th17與健康組比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；血清固定組CD8和Treg與健康組比較明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；血清固定組CD4和Th17與梅毒血清轉(zhuǎn)陰組比較明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；血清固定組CD8和Treg與梅毒血清轉(zhuǎn)陰組比較明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）；梅毒血清轉(zhuǎn)陰組與健康對照組CD4、CD8、Th17、Treg細(xì)胞差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。見表1。

表1 3組外周血CD4、CD8、Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá) %

3 討論

梅毒是蒼白螺旋體（TP）感染所引起的一種慢性經(jīng)典的性傳播疾病。近年來隨著梅毒發(fā)病率的升高，血清固定的發(fā)生率也明顯上升。目前血清固定發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚，國內(nèi)外有研究發(fā)現(xiàn)血清固定患者存在免疫學(xué)方面的異常[3-4]。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞免疫在梅毒的病程中起著很重要的作用[5]。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為細(xì)胞免疫是清除體內(nèi)TP的主要方式，其中又以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。眾所周知，在胸腺的作用下，T淋巴細(xì)胞分化為成熟的CD4和CD8亞群。CD4細(xì)胞亞群主要是輔助性 T細(xì)胞，可分化為Th1、Th2細(xì)胞；CD8細(xì)胞亞群主要為免疫抑制性T細(xì)胞（Ts）。在機(jī)體抗梅毒螺旋體感染的過程中 CD4細(xì)胞發(fā)揮著重要作用，CD4細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮具有特定的免疫調(diào)節(jié)和殺傷作用；CD8細(xì)胞在抗螺旋體感染的過程中通過抑制自身反應(yīng)性 CD4細(xì)胞活性及梅毒螺旋體制動抗產(chǎn)生而抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，Ts增高表明細(xì)胞免疫功能受到抑制。有研究表明，血清固定患者存在細(xì)胞免疫失調(diào)與免疫抑制[6-7]，主要表現(xiàn)CD4淋巴細(xì)胞明顯降低，CD8淋巴細(xì)胞明顯升高，使得TP清除下降，造成TP殘存而引發(fā)血清固定。本研究結(jié)果顯示：血清固定組與健康對照組、血清轉(zhuǎn)陰組相比較，外周血CD8細(xì)胞明顯增高，CD4細(xì)胞明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05），與徐剛等[8]研究一致。由此進(jìn)一步證實(shí)，血清固定患者機(jī)體內(nèi)存在免疫不平衡和免疫抑制現(xiàn)象。

Treg、Thl7細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的兩種新淋巴細(xì)胞亞群，成為近幾年來免疫學(xué)研究的新熱點(diǎn)。Treg細(xì)胞具有免疫抑制的特性，并同時(shí)表達(dá)CD25和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，誘導(dǎo)和維持機(jī)體的免疫耐受，主要分泌IL-4、IL-10和TGF-等細(xì)胞因子[9-10]。Thl7細(xì)胞能夠分泌產(chǎn)生IL-17、IL-6、IL-22及TNF-等，與誘導(dǎo)炎性反應(yīng)和自身免疫疾病有關(guān)[11]。有學(xué)者提出，人體內(nèi)存在著Treg/Thl7細(xì)胞的平衡，某些疾病的發(fā)生可能正是由于初始CD4細(xì)胞在分化過程中出現(xiàn)了Treg/Thl7細(xì)胞的平衡偏移所造成的[12]。趙建斌等[12]研究顯示，梅毒血清固定患者外周血淋巴細(xì)胞中存在Treg細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)升高，Th17細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子ROR-t的表達(dá)降低，即Treg/Thl7細(xì)胞的平衡偏移，推測梅毒血清固定的發(fā)病與此有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：外周血Treg細(xì)胞明顯增高，Th17細(xì)胞明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)Treg/ Thl7細(xì)胞失衡對血清梅毒固定的影響。

綜上所述，CD4/CD8/Treg/Th17細(xì)胞間的平衡狀態(tài)與梅毒血清固定可能存在著某種關(guān)聯(lián)，了解其中的調(diào)控機(jī)制，就可以在今后的臨床治療過程中更多關(guān)注患者的免疫學(xué)狀態(tài)，制定個性化免疫學(xué)干預(yù)方案，為解決梅毒血清固定問題帶來新的途徑。

[1] Samoff E,Koumans EH,Gibson JJ,eta1.Pre-treatmentsyphilistiters：distri bution and evaluation of their use to distinguish early from late latent syphilis and to prioritize contact investigations[J].Sex Transm Dis,2009,36(12):789-793.

[2]李秋濤,樊曼云,張秋堂,等.梅毒患者細(xì)胞免疫功能的檢測[J].中華皮膚科雜志, 2002,35(3):183-182.

[3] 黃晶.早期梅毒血清固定患者淋巴細(xì)胞的檢測及意義[J].中國皮膚性病學(xué)雜志, 2008,22(9):546-547.

[4] Hook EW,Behets F,Van Damme K,et al. A phase III equivalencetrial of azithromy-cin versus benzathine penicillinfor treat-ment of early syphilis[J].J Infect Dis,2010, (201):1729-1735.

[5] CDC.Sexually transmitted disease streatment guidelines,2006[J].MMWR,2006,55 (RR-11):1-94.

[6] 凌昕,劉潤秋,施辛,等.血清固定與神經(jīng)梅患者淋巴細(xì)胞亞群的檢測[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2010,24(5):418-420.

[7]謝海莉,趙進(jìn),李偉,等.梅毒血清固定患者細(xì)胞免疫功能檢測[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2013,27(1):49-51.

[8]徐剛,鄭健英,梅淑清,等.梅毒血清固定患者檢測外周血T細(xì)胞亞群白細(xì)胞介素-12 -10與自然殺傷細(xì)胞水平的結(jié)果研究[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2014,21(12):1263-1265.

[9] Beissert S,Schwarz A,Schwarz T.Regulatory T cells[J].J Invest Dermatol,2006, 126(1):15-24.

[10]Bettelli E,Korn T,Kuchroo VK.Thl7:the third member of the effector T cell trilogy[J]. Curt Opin Immunol,2007,19(6):652-657.

[11]Huang H,Lu Z,Jiang C,et a1.Imbalance between Thl7 andregulatory T-Cells in sareoidosis[J].Int JMol Sci,2013,14(11): 21463-2173.

[12]趙建斌,張明海,馬杰,等.梅毒血清固定患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞平衡的研究[J].中華皮膚科雜志,2012,45(5): 347-349.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.056

R759.1

A

1671-0800(2016)01-0105-03

2015-08-01（本文編輯：陳志翔）

315100寧波，寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院

徐超，Email：xuchaoharbin@163.com