呂平（天津職業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津300402）

超微粉碎聯(lián)合超聲輔助萃取制備人參總皂苷的研究

呂平
（天津職業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，天津300402）

人參皂苷是人參中最重要的活性成分。通過超微粉碎聯(lián)合超聲波輔助提取技術(shù)制備了人參總皂苷。試驗(yàn)結(jié)果表明，超微粉碎后的人參微粉最小平均粒徑可達(dá)到49.18 μm，只有粗粉的1/3到1/4，并可以顯著提高人參中總皂苷的提取效率。人參總皂苷提取的最佳提取條件是人參平均粒徑為69.48 μm，乙醇濃度為50%，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為40min，液固比為40∶1（mL/g），此條件下的總皂苷含量為8.564mg/100mL。

超微粉碎；超聲輔助萃??；人參皂苷

人參是一種名貴中藥材，其主要生物活性和藥理成份是人參皂苷。目前國內(nèi)從人參、西洋參根須中提取人參皂苷的常規(guī)提取方法有：浸漬法［1］、滲漉法、蒸煮法、回流法［2］和索式提取法等［3］。依托這些方法的生產(chǎn)工藝一般較長，溶媒用量大，且有效成分提取不完全，既浪費(fèi)藥材又影響療效，蒸煮法受熱時(shí)間長，溫度高，有效成份易破壞。在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上，近二十年來又發(fā)展了微波輔助提取法、超聲輔助法和超臨界CO2萃取法等新型提取方法。超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速藥物有效成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。張憲臣等對不同超聲處理?xiàng)l件下的人參總皂苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明人參總皂苷的最佳提取工藝為：水飽和正丁醇提取、超聲時(shí)間60 min、超聲2次［4］。張春紅等比較了稀醋酸超聲波提取法和常規(guī)超聲水提取法的優(yōu)劣。結(jié)果表明，稀醋酸提取法所得總皂苷和各主要單體皂苷收率均比常規(guī)超聲水提法明顯提高［5］。于兆慧等通過超聲輔助酶解人參總皂苷成功制備了人參稀有皂苷Compound K［6］。陳紅專對人參超聲逆流提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明最佳工藝條件是藥材粉碎過30目篩，用70%乙醇，溶媒逆流體積流量與進(jìn)料質(zhì)量流量之比為8∶1［7］。金達(dá)明得出的最佳超聲提取條件為：乙醇濃度64%、超聲時(shí)間15 min、溶媒比26 mL/g，在該條件下人參總皂苷的提取率為5.23%［8］。超微粉碎是近來年發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，能把原材料加工成微米甚至納米級(jí)的微粉。超微粉碎通過高效率地破碎細(xì)胞壁，增加藥物吸收率提高其利用度，有利于保留人參的活性成份提高藥效，因而在人參的加工中已經(jīng)開始逐步使用。張晶等比較普通粉碎、超微粉碎對人參中皂苷溶出率的影響，結(jié)果表明粒徑介于0.5 μm～1 μm的人參微粉的皂苷溶出率明顯高于其他粒徑人參粉［9］。趙亞等研究了超微粉碎參須中人參總皂苷的溶出工藝后認(rèn)為超微粉碎顯著提高了人參中總皂苷的溶出［10］。陳斌等的研究結(jié)果表明超微粉碎在破壞人參花細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上使人參皂苷溶出率顯著提高［11］。關(guān)天增等在研究超微粉碎對婦斑消膠囊中人參皂溶出效果的影響也得出了同樣的結(jié)論，可明顯增加人參皂苷Rg1、Re的溶出［12］。本試驗(yàn)擬將超微粉碎和超聲提取技術(shù)結(jié)合起來，優(yōu)化人參中總皂苷的提取條件，為建立一種快速、高效的人參總皂苷新工藝奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

人參：白山銀嶺特產(chǎn)貿(mào)易有限公司；乙醇、丙酮、正丁醇：天津市化學(xué)試劑一廠；人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品：上海極威生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：天津康科德化工有限公司。

KQM-X4（/B）型行星式球磨機(jī)：咸陽金宏通用機(jī)械有限公司；Mastersizer2000 E型激光粒徑儀：英國馬爾文公司；LC-20A液相色譜儀：日本島津；JP300G型超聲波提取器：武漢嘉鵬電子有限公司。

1.2人參微粉的制備

將人參粗粉在50℃烘箱中干燥3 h后放入星式球磨機(jī)中，分別粉碎6、12、18、24、30、60 min得到7種人參微粉。行星式球磨機(jī)的公轉(zhuǎn)速度為360 r/min，自轉(zhuǎn)速度為600 r/min。粉碎選用聚胺脂磨罐，氧化鋁磨介，物料和磨介比為1∶1（質(zhì)量比）。

1.3人參微粉的粒徑測定

取適量人參粉體置于激光粒徑儀容器內(nèi)，用超聲波對粉體進(jìn)行分散，測定粉體的粒徑及其粒徑分布。激光粒徑儀轉(zhuǎn)速為2 200 r/min，超聲分散時(shí)間12 s，采用蒸餾水作為分散劑。測量結(jié)果為d（0，1）、d（0，5）、d（0，9），分別表示在粒徑累積分布曲線上，10%、50%、90%顆粒的直徑小于或等于此值。d（0，5）又稱顆粒的平均粒徑。

1.4超聲輔助提取的工藝

準(zhǔn)確稱取人參粉末1 g，于250 mL燒瓶中，加入提取溶劑，裝上回流冷凝器，在70℃水浴中進(jìn)行提取，過濾除去濾渣，濾液減壓蒸干得提取浸膏，浸膏加水溶解后上大孔樹脂分離柱，水洗除糖、無機(jī)鹽等雜質(zhì)成分，再用70%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇流分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加甲醇溶解定容100 mL，以高效液相色譜法測定總皂苷的含量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定使用乙醇水溶液為提取溶劑，選取人參粉末粒徑、乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲功率和液固比為因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)篩選提取人參總皂苷的最佳工藝條件，并研究各因素之間的相互關(guān)系。正交試驗(yàn)因數(shù)和水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments

1.5人參總皂苷的測定（HPLC法）

準(zhǔn)確稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品0.00153g置于5mL量瓶中，先加人3 mL色譜純甲醇溶解，超聲振蕩1 min，然后用甲醇定容，置4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆?。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液系列，使標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為0.035 1、0.070 2、0.140 4、0.280 8、0.388 0 mg/mL。

采用LC-20A液相色譜儀，Diamonsil-C18ODS色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫：36℃，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣體積5μL，流動(dòng)相由乙睛和水（0.05%磷酸）組成，流速1.0 mL/min，梯度洗脫程序?yàn)椋?～15 min，乙睛的體積分?jǐn)?shù)為20%～25%；15 min～35 min，乙睛的體積分?jǐn)?shù)為25%～45%；35 min～45 min，乙睛的體積分?jǐn)?shù)為45%～60%；45 min～60 min，乙睛的體積分?jǐn)?shù)為60%～100%；60 min～65 min，乙睛的體積分?jǐn)?shù)為100%～20%。人參總皂苷Re的保留時(shí)間為26.68 min，標(biāo)準(zhǔn)曲

線為：Y=2.465×10-7X-3.996×10-3（R2=0.998 91）。

2　結(jié)果與分析

2.1超微粉碎后人參微粉平均粒徑的分析

本試驗(yàn)使用行星式球磨機(jī)在不添加任何抗結(jié)劑、助磨劑的情況下對人參粗粉進(jìn)行干法粉碎，人參粗粉和粉碎后6種人參微粉粒徑測定結(jié)果如表2所示。

從表2中可以看出，超微粉碎后的人參微粉的平均粒徑均小于100 μm，都屬于微粉的粒徑范圍。隨著粉碎時(shí)間的增加，平均粒徑為單凹型曲線，即先降低后增加，在粉碎時(shí)間為24min平均粒徑最小達(dá)到49.18μm。d（0，1）和d（0，9）與平均粒徑有相似的變化規(guī)律，而且最低值都在24 min時(shí)出現(xiàn)，表現(xiàn)出良好的同步性?？傮w上看，人參超微粉碎后的粒徑只有粗粉的1/3到1/4。

表2　人參的粒徑測定Table 2　Determination of particle size of panax ginseng

2.2超聲波輔助提取的單因素試驗(yàn)

為了研究超聲輔助提取過程中關(guān)鍵因素對人參總皂苷提取效率的影響情況和為優(yōu)化超聲輔助提取工藝提供基礎(chǔ)，試驗(yàn)選取了人參總皂苷超聲輔助提取中的人參粉末粒徑、超聲溶劑、溶劑濃度、超聲時(shí)間、超聲功率和液固比6個(gè)因素為考察對象，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)中超聲輔助提取的基本條件為：提取溶劑為50%乙醇，超聲功率為300 W，頻率50 kHz，超聲時(shí)間為40 min，液固比為50∶1（mL/g）。

2.2.1人參粉末粒徑對人參總皂苷提取效率的影響

相關(guān)文獻(xiàn)認(rèn)為中藥經(jīng)過超微粉碎后，實(shí)現(xiàn)了植物細(xì)胞壁的破碎，增大了顆粒的表面積，使其分散性、吸附能力、表面活性等都起了綜合性變化，有利于中藥有效成分的溶出，從而提高有效成分提取率。因此，試驗(yàn)首先對已經(jīng)粉碎的不同粒徑的人參超微粉末進(jìn)行了超聲輔助提取試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3　人參粉末粒徑對人參總皂苷提取效率的影響Table 3　Effect of particle size on the extraction efficiency of total saponins

從表3中可以看出，隨著超微粉粒徑的減小，人參總皂苷的含量先是不斷增加，到超微粉C時(shí)達(dá)到最高值，為8.225 mg/100 mL，再不斷降低，表現(xiàn)為明顯的單峰曲線。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是隨著超微粉體粒徑的減小，植物細(xì)胞壁的破壁率和顆粒表面積不斷增加，人參總皂苷的提取率不斷增加，但當(dāng)粒徑進(jìn)一步減小時(shí)，隨著細(xì)胞壁的深度碎片化和超聲空化剪切作用的加強(qiáng)會(huì)對人參總皂苷產(chǎn)生一定的破壞作用，反而使提取效率有所下降。從表2中還可以看出，從人參超微粉超聲提取的總皂苷含量明顯高于微粉的總皂苷含量，基本上可以達(dá)到微粉人參皂苷含量的1.5倍～1.8倍。因此，可以初步確認(rèn)超微粉碎技術(shù)有助于提高人參總皂苷的提取效率。

2.2.2提取溶劑對人參總皂苷提取效率的影響

考慮到提取溶劑的安全性和價(jià)格，試驗(yàn)中選取了常用的提取溶劑50%乙醇水溶液、50%丙酮水溶液和正丁醇3種提取溶劑，進(jìn)行對比。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　提取溶劑對人參總皂苷提取效率的影響Table 4　Effect of extraction solvent on the extraction efficiency of total saponins

從表4可以看出，正丁醇提取得率較高、50%丙酮水溶液次之，50%乙醇水溶液最低，但三者之間的差距很小。正丁醇價(jià)格較高，而且沸點(diǎn)較高會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的精制工藝會(huì)比較復(fù)雜，提取后有效成分的分離較為困難，所以正丁醇不是理想提取溶劑。乙醇相對丙酮，價(jià)格便宜，而且安全性高。綜合考慮，在本試驗(yàn)中最合適的提取溶劑為乙醇的水溶液。

2.2.3乙醇濃度對人參總皂苷提取效率的影響

在確定提取溶劑為乙醇的水溶液后，還要進(jìn)一步確定乙醇的水溶液的最佳濃度。為此以30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液為提取溶劑進(jìn)行人參總皂苷的超聲輔助提取試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5　乙醇濃度對人參總皂苷提取效率的影響Table 5　Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of total saponins

從表5中可以得到乙醇濃度對人參總皂苷提取有比較明顯的影響。隨乙醇濃度的增大，人參總皂苷含量不斷增加。當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，人參皂苷的含量達(dá)到最大值，為8.326 mg/100 mL，當(dāng)乙醇濃度超過70%時(shí)，人參皂苷的含量開始逐步下降，可能是在乙醇濃度在30%至60%之間時(shí)，乙醇濃度的增加，提高了提取溶劑的極性，增加皂苷的溶解性，使人參皂苷的含量逐漸提高，但當(dāng)乙醇濃度70%時(shí)，會(huì)使人參中的大分子糖類和蛋白質(zhì)發(fā)生凝聚，而沉淀，使提取效率顯著下降。因此，乙醇水溶液的最佳濃度為60%。

2.2.4超聲時(shí)間和超聲功率對人參總皂苷提取效率的影響

在超聲輔助提取中，超聲時(shí)間和功率是非常重要的影響因素，需要探討超聲時(shí)間（20、30、40、50、60 min）和功率（100、200、300、400、500 W）對人參總皂苷提取的影響。結(jié)果見表6和表7。

表6　超聲時(shí)間對人參總皂苷提取效率的影響Table 6　Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of total saponins

由表6可以看到，超聲時(shí)間對提取效率有一定的影響。在開始階段，隨著超聲提取時(shí)間的延長，人參總皂苷的含量不斷增長，但到40 min后，人參總皂苷的含量增加緩慢，基本穩(wěn)定在8.156 mg/100 mL水平。因此超聲波輔助提取人參總皂苷的最佳提取時(shí)間為40 min。

表7　超聲功率對人參總皂苷提取效率的影響Table 7　Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of total saponins

從表7可以看到，超聲功率對人參總皂苷的提取有著顯著的影響。隨著超聲功率的增加，人參總皂苷的含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，在200 W時(shí)達(dá)到最高含量，為8.210 mg/100 mL。一般認(rèn)為隨著超聲功率的增加產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等都迅速增加，增大了皂苷擴(kuò)散過程的傳質(zhì)動(dòng)力，因而使得開始階段人參皂苷總含量快速提高，而后隨超聲功率的進(jìn)一步增加，空化效應(yīng)、熱效應(yīng)過強(qiáng)會(huì)對人參皂苷產(chǎn)生一定的破壞作用，同時(shí)也會(huì)對人參中的糖類、蛋白類物質(zhì)產(chǎn)生一定的降解作用，反而阻礙了皂苷擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使得提取效率有所降低。因此，本試驗(yàn)中超聲提取的最佳功率為200 W。

2.2.5液固比對皂苷提取效率的影響

液固比對人參總皂苷的提取效率和控制提取工藝的成本等有著十分重要的影響，試驗(yàn)考察了不同液固比下人參總皂苷的提取效率，結(jié)果見表8。

由表8可以看到，隨著液固比的增加，人參總皂苷的含量逐漸增加。當(dāng)溶劑與固體原料的比例大于40∶1 （mL∶g）后雖有增加，但增加幅度很小，人參皂苷的總含量基本維持在8.112 mg/100 mL～8.120 mg/100 mL之間?？紤]到超聲提取工藝中要盡量節(jié)約溶劑、減低成本，因此選擇超聲提取人參皂苷的液固比為40∶1 （mL/g）。

表8　液固比對人參總皂苷提取效率的影響Table 8　Effect of solution-material ratio on the extraction efficiency of total saponins

2.3人參總皂苷超聲輔助提取正交優(yōu)化

前面分別分析了單個(gè)因素對人參總皂苷的影響，還不能據(jù)此得出最佳的超聲輔助提取工藝。為此設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)以優(yōu)化人參總皂苷超聲輔助提取條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表9，方差分析結(jié)果見表10。

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 9　Results and analysis of orthogonal experiments

表10　正交方差分析表（人參總皂苷）Table 10　Orthogonal analysis of variance（total saponins of panax ginseng）

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，以人參總皂苷的含量為考察指標(biāo)，人參粉末粒徑的最大K值是8.247，對應(yīng)的最優(yōu)水平是平均粒徑為69.48 μm；乙醇濃度的最大K值是8.250，對應(yīng)的最優(yōu)水平是50%；超聲功率的最大K值是8.313，對應(yīng)的最優(yōu)水平是200 W。超聲時(shí)間最大K值是8.274，對應(yīng)的最優(yōu)水平是40 min。液固比的最大K值是8.322，對應(yīng)的最優(yōu)水平是40∶1（mL/g）。因此5個(gè)因素的最優(yōu)水平組合為A1B2C2D3E3，也是人參總皂苷超聲輔助提取的的最優(yōu)水平組合。

比較各R值大小有如下關(guān)系：R液固比＞R超聲功率＞R超聲時(shí)間＞R乙醇濃度＞R人參粉末粒徑，因而因素對人參總皂苷含量影響的主次順序是液固比＞超聲功率＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度＞人參粉末粒徑，即液固比影響最大，其次為超聲功率和超聲時(shí)間，而乙醇濃度和人參粉末粒徑影響最小。方差分析結(jié)果與此一致。但其F都不大，均小于F臨界值，說明這些因素對人參總皂苷的超聲提取都有著重要的作用。與前面的單因素試驗(yàn)結(jié)果相比較，除超聲時(shí)間、超聲功率和液固比外，乙醇濃度和人參粉末粒徑的最優(yōu)水平都發(fā)生了改變，說明這些因素之間的互助作用比較顯著。綜上所述，人參總皂苷超聲提取的最佳提取條件為：人參平均粒徑為69.48μm，乙醇濃度為50%，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為40 min，液固比為40∶1（mL/g）。在此條件下，進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，測定總皂苷的含量為8.564 mg/100 mL。

2.4不同粉體和方法提取人參總皂苷的比較

上述試驗(yàn)得出的最佳超聲提取條件只是針對人參微粉而言，沒有對人參粗粉進(jìn)行超聲輔助提取試驗(yàn)。同時(shí)為了進(jìn)一步研究超聲輔助提取是比常規(guī)提取方法有優(yōu)勢，課題組分別對人參粗粉（平均粒徑267.41 μm）和超微粉（平均粒徑56.36 μm）進(jìn)行了回流提取和超聲輔助提取試驗(yàn)，結(jié)果見表11。

表11　不同粉體和方法提取人參總皂苷的含量Table 11　Extraction of total saponins from panax ginseng by different powders and methods

從表11可以看出，超微粉無論是回流提取還是超聲輔助提取其總皂苷含量都高于粗粉，說明人參超微粉碎后提高了總皂苷的提取效率。同時(shí)無論是粗粉還是超微粉，超聲輔助提取的總皂苷含量都高于回流提取。通過超微粉碎聯(lián)合超聲輔助提取工藝提取的總皂苷含量高達(dá)8.564 mg/100 mL，較粗粉回流提取的總皂苷含量提高63.6%，表明超聲輔助提取人參總皂苷是一種高效的提取方法。

3　結(jié)論

1）超微粉碎后的人參微粉最小平均粒徑可達(dá)到49.18 μm，只有粗粉的1/3到1/4，并可以顯著的提高人參中總皂苷的超聲輔助提取效率。

2）人參總皂苷超聲提取的最佳提取條件是人參平均粒徑為69.48 μm，乙醇濃度為50%，超聲功率為200 W，超聲時(shí)間為40 min，液固比為40∶1（mL/g），此條件下的總皂苷含量為8.564 mg/100 mL。

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Study of Process of Ginsenoside by Superfine Grinding and Ultrasound-assisted Extraction

LU¨Ping
（Department of Biological and Environmental Engineering，Tianjin Professional College，Tianjin 300402，China）

Ginsenoside is the most important active ingredients in ginseng.The process of superfine grinding and ultrasound-assisted extraction was used to extract ginsenoside from ginseng.The minimal average particle size of ginseng reached to 49.18 μm by superfine grinding，only coarse powder of ginseng 1/3 to 1/4，and the efficiency of extraction of total ginsenoside was significantly improved.The optimum process conditions were as follows：the average particle size of ginseng was 69.48 μm；ethanol concentration was 50%；ultrasound time was 40 min，solution-material ratio was 40∶1（mL/g）；ultrasonic power was 200 W.The content of total ginsenoside was up to 8.564 mg/100 mL under above process conditions.

superfine grinding；ultrasound-assisted extraction；ginsenoside

2016-03-08

呂平（1975—），男（漢），副教授，博士研究生/博士，研究方向：天然產(chǎn)物提取技術(shù)。