趙江，陳純，王紅,2，王軼菲,2，呂曉玲，王浩，*（.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

山楂提取物對高脂損傷果蠅的保護(hù)作用

趙江1，陳純1，王紅1,2，王軼菲1,2，呂曉玲1，王浩1，*
（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

研究山楂提取物（Hawthorn Fruit Extract，HFE）對高脂致氧化損傷的雄性果蠅壽命的影響并探究其延緩果蠅衰老的分子機(jī)制。將2d齡雄性果蠅隨機(jī)分組，在高脂培養(yǎng)基中飼喂不同劑量（0.5、1.5、4.5mg/mL）山楂提取物，研究山楂提取物對果蠅生存壽命及果蠅體內(nèi)抗氧化酶活性（銅鋅超氧化物歧化酶，Copper-zinc-containing superoxide dismutase，Cu/ Zn-SOD；錳超氧化物歧化酶Manganese-containingsuperoxide dismutase，Mn-SOD；過氧化氫酶，Catalase，CAT）、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量、蛋白質(zhì)羰基（ProteinCarbonyl，PCO）含量及抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。HFE可以顯著延長果蠅的平均壽命和最高壽命（4.5 mg/mL，P＜0.05）；4.5 mg/mL HFE可以顯著提高果蠅體內(nèi)SOD和CAT活性（P＜0.05），顯著降低MDA（P＜0.01）和PCO含量（P＜0.05）；同時顯著上調(diào)果蠅體內(nèi)Cu/Zn-SOD及Nrf2 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）并且極顯著上調(diào)Mn-SOD和CATmRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。HFE對高脂膳食所導(dǎo)致的果蠅氧化損傷具有保護(hù)作用，HFE延緩果蠅衰老和抗氧化作用可能與其調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)水平相關(guān)。

山楂提取物；果蠅；高脂；抗氧化

山楂屬雙子葉植物綱薔薇科植物，具有多方面的藥理活性及營養(yǎng)價值［1］?，F(xiàn)代研究證明山楂果實中主要含有有機(jī)酸、黃酮類、花色苷類、三萜類等化合物［2］，這些化合物是良好的抗氧化物質(zhì)［3-4］。有關(guān)研究顯示，山楂活性成分具有增加血液抗氧化活性的作用［5］，Liu等［6］研究亦發(fā)現(xiàn)HFE具有明顯清除羥自由基與過氧化氫的能力，其抗氧化活性顯著高于VC和VE。張銳巧［7］等研究表明山楂果肉的原花青素具有很好的體外清除活性氧和保護(hù)DNA損傷的活性。40 μg/mL的山楂果肉提取物對體外DNA損傷抑制率達(dá)80.7%。一定劑量的山楂提取液可以有效的抑制大鼠肝臟CYP2E1的活性，有效降低了多種前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物的可能性，以及減少了CYP2E1誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量自由基，降低對肝臟的氧化損傷［8］。

衰老自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基對細(xì)胞的各種成分和結(jié)構(gòu)都可產(chǎn)生損傷效應(yīng)，這些效應(yīng)的累積勢必造成細(xì)胞功能的減退［9］。在高脂情況下，生物膜上的脂質(zhì)成分更易受到自由基的攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化，使機(jī)體加速衰老［10］。抗氧化劑可以有效清除體內(nèi)多余的自由基，延緩高脂導(dǎo)致的氧化損傷。

果蠅（Drosophila melanogaster）具有與人類十分相似的衰老基因［11-12］，被廣泛作為評估活性成分對壽命的影響機(jī)理的動物模型，外源抗氧化酶或活性物質(zhì)如藍(lán)莓、韓國紅參，姜黃素等對果蠅壽命及抗氧化有很大的影響［13-14］。本實驗以O(shè)regon K野生型黑腹雄性果蠅為模式生物，研究山楂提取物對高脂所致果蠅脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步研究其保護(hù)作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

野生型Oregon K黑腹果蠅（Drosophila melanogaster，wild Oregon K strain）：由天津科技大學(xué)食品添加劑與營養(yǎng)調(diào)控研究室提供；山楂提取物：由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供。

1.2果蠅飼養(yǎng)條件

培養(yǎng)基配制參照之前論文方法［15］?？瞻讓φ战M果蠅飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，高脂模型組果蠅飼喂高脂培養(yǎng)基，實驗組果蠅則飼喂添加0.5、1.5、4.5 mg/mLHFE的高脂培養(yǎng)基。實驗選用2 d齡Oregon K野生型雄性黑腹果蠅，培養(yǎng)于溫度（25+1）℃，濕度（55+5）%、光/暗時間為12 h/12 h的恒溫恒濕智能培養(yǎng)箱。

1.3果蠅生存實驗

收集2 d齡羽化未交配的果蠅成蟲進(jìn)行雌雄鑒別，CO2麻醉觀察其個體特征，將腹部末端顏色深且圓鈍的雄性果蠅挑選出來，收集1 000只，隨機(jī)分為5組：空白對照組，高脂模型組，HFE組（0.5、1.5、4.5 mg/mL），定期記錄各組果蠅存活只數(shù)直至果蠅全部死亡，繪制壽命曲線，并重復(fù)實驗，計算平均壽命和平均最高壽命，最高壽命為最后10%死亡果蠅的平均生存時間。

1.4果蠅抗氧化酶活性及基因表達(dá)水平的測定

果蠅培養(yǎng)同生存實驗方法，收集40 d齡果蠅，麻醉后稱重，加入生理鹽水制成2%的組織勻漿，離心，收集上清液，按照試劑盒說明書上方法分別測定各管果蠅體內(nèi)的總蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法）、T-SOD、Cu/Zn-SOD活性（黃嘌呤氧化酶法）、CAT活性（紫外分光光度法）、MDA含量（硫代巴比妥酸法）以及PCO含量（二硝基苯肼比色法）。同上收集40 d齡果蠅，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以RP49為內(nèi)參基因，Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2及瑪氏薩拉（Methuselah，MTH）為目的基因，Real-time PCR擴(kuò)增檢測抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。

1.5數(shù)據(jù)的分析與處理

使用SPSS statistics17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方法表示結(jié)果，組間差異進(jìn)行方差檢驗分析，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。果蠅抗氧化基因?qū)崟r定量引物引物見表1。

表1　果蠅抗氧化基因?qū)崟r定量引物引物Table 1　RT-PCR primers for the detection of mRNA expression of antioxidant genes in Drosophila melanogaster

2　結(jié)果與分析

2.1山楂提取物的活性成分

山楂提取物的活性成分見圖1。

圖1　高效液相色譜法測定山楂活性成分Fig.1　HPLC chromatogram of hawthorn active ingredients

山楂提取物的主要活性成分及其所占比重分別為：原花青素B219.86%，表兒茶素15.27%，綠原酸3.10%，金絲桃苷2.91%，異槲皮素1.34%。

2.2HFE對高脂果蠅壽命的影響

圖2　高脂果蠅壽命曲線（n=200）Fig 2　Lifespan curve of fatty Drosophila melanogaster（n=200）

如表2所示，HFE對果蠅體重?zé)o明顯影響，（P＞0.05）。給予豬油后，果蠅平均壽命和最高壽命均顯著降低（P＜0.01），說明造模成功。HFE組果蠅的平均壽命及最高壽命與模型組相比均有所提高，且隨著HFE濃度的增加，平均壽命和最高壽命依次延長，表明HFE對高脂損傷組果蠅有一定的保護(hù)作用。其中4.5 mg/ mL HFE組果蠅的平均壽命延長了13.57%（P＜0.05），最高壽命延長了9.85%（P＜0.01）。

表2　山楂提取物對高脂果蠅壽命的影響（n=200）Tab 2　Effect of HFE on lifespan of fatty Drosophila melanogaster（n=200）

2.3HFE對高脂果蠅體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

HFE對高脂果蠅體內(nèi)抗氧化酶活性的影響見表3。

與空白對照組相比，模型組果蠅的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT活性明顯降低，差異性顯著（P＜0.05），說明高脂膳食能夠?qū)壴斐梢欢ǔ潭鹊难趸瘬p傷，加速衰老；與模型組相比，果蠅在飼喂HFE 40 d之后，0.5、1.5、4.5 mg/mLHFE組果蠅體內(nèi)SOD及CAT活性與HFE濃度呈劑量依賴關(guān)系，其中4.5 mg/mL組果蠅的Cu/Zn-SOD和CAT酶活性顯著升高（P＜0.05），Mn-SOD活性極顯著升高（P＜0.01）。

2.4HFE對高脂果蠅丙二醛及蛋白質(zhì)羰基含量的影響

HFE對高脂果蠅丙二醛及蛋白質(zhì)羰基含量的影響見表4。

由表4可知，與空白對照組相比，模型組果蠅的PCO和MDA含量顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，果蠅體內(nèi)PCO和MDA含量隨山楂提取物添加量增加呈逐漸降低的趨勢，其中4.5 mg/mL組果蠅體內(nèi)MDA含量極顯著降低（P＜0.01），蛋白質(zhì)羰基值顯著降低（P＜0.05）。

2.5HFE對高脂果蠅抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

HFE對高脂果蠅抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)水平的影響見圖3。

表3　高脂果蠅體內(nèi)抗氧化酶活性（n=4）Tab 3　The antioxidant enzyme activity in fatty Drosophila melanogaster（n=4）

表4　丙二醛及蛋白質(zhì)羰基含量Tab 4　The content of MDA and PCO in fatty Drosophila melanogaster（n=4）

圖3高脂果蠅體內(nèi)抗氧化基因Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、MTH、Nrf2 mRNA表達(dá)水平（n=4）Fig 3　mRNA expression level of Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，MTH and Nrf2 in fatty Drosophila melanogaster（n=4）

與空白組相比，模型組果蠅的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，各劑量組（0.5、1.5、4.5 mg/mL）果蠅的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、Nrf2 mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)，其中4.5 mg/mL組果蠅Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），分別比模型組提高了78.57% 與83.78%，Nrf2 mRNA顯著上調(diào)以及MTH mRNA顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3　討論

山楂作為傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含黃酮類、花青素等天然抗氧化物。有研究表明山楂提取物能有效清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等自由基，且無論是在體內(nèi)還是體外都具有較高的抗氧化活性［16-19］。果蠅進(jìn)食高脂膳食后，與空白對照組相比，果蠅壽命明顯縮短，說明高脂膳食能夠?qū)е鹿夡w內(nèi)發(fā)生一定程度的氧化應(yīng)激損傷，加速果蠅衰老，高脂果蠅造模成功。亦有報道顯示豬油能使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，加速衰老［20］。與高脂模型組相比，HFE各劑量組果蠅壽命及最高壽命均明顯延長，說明HFE對高脂膳食致氧化損傷的果蠅具有一定程度的保護(hù)作用。

SOD、CAT是果蠅體內(nèi)最主要的抗氧化酶，其酶活性的增加可以顯著減少自由基氧化損傷，提高抗氧化活性，延緩衰老，因此SOD和CAT的活性水平間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力［21-22］。Chen［23］等研究發(fā)現(xiàn)原花青素和丹酚酸有效延緩了果蠅衰老，升高了血清中SOD的水平，降低了MDA的含量。抗氧化酶活性測定結(jié)果顯示，HFE組果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性較模型組明顯提高，這與Wang［24］等研究的HFE能夠升高加速衰老鼠血液抗氧化酶活性的結(jié)果相一致。

MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，通常作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)［25］。王文［26］等研究山楂水提取液對體外發(fā)光有抑制作用，可使大鼠體內(nèi)MDA的含量降低，具有顯著消除體內(nèi)自由基及抗脂質(zhì)過氧化作用，且與VE抗自由基及脂質(zhì)過氧化具有等同作用。蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾一個重要標(biāo)志，因此可以通過測定羰基含量判斷蛋白質(zhì)是否被氧化損傷。本實驗測得蛋白質(zhì)羰基給予果蠅4.5 mg/mLHFE顯著。Stadtman與Oliver［27］等報道了蛋白質(zhì)羰基含量與衰老的關(guān)系，指出蛋白質(zhì)羰基含量隨年齡的增長而增加。

實時定量熒光PCR測定結(jié)果顯示，果蠅體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT等mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），這與果蠅體內(nèi)相關(guān)抗氧化酶活性升高的趨勢相一致。Peng等［28］也研究發(fā)現(xiàn)茶黃素可以有效延長果蠅壽命，上調(diào)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)水平，同時下調(diào)MTH mRNA表達(dá)水平。Zhang等［29］亦研究發(fā)現(xiàn)HFE能夠有效提高載體蛋白E缺陷型小鼠的抗氧化活性，并顯著上調(diào)小鼠體內(nèi)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。E.A. Baldal等［30］的研究表明敲除MTH內(nèi)源性配體基因或者過表達(dá)MTH受體的肽類拮抗劑均能延長果蠅的壽命。Nrf2［31］是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，受Keap1的調(diào)控，通過與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達(dá)，給予HFE后測得果蠅體內(nèi)Nrf2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)。

實驗結(jié)果表明，山楂富含多種抗氧化活性成分，一定劑量的HFE能夠通過多種調(diào)控方式參與模式生物氧化能力的提升，增強(qiáng)機(jī)體清除體內(nèi)自由基的能力，有效降低高脂膳食對果蠅的氧化損傷作用，從而延長機(jī)體的壽命。

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Protective Effect of Hawthorn Fruit Extract on the Fat-induced Damage in Drosophila melanogaster

ZHAO Jiang1，CHEN Chun1，WANG Hong1，2，WANG Yi-fei1，2，Lü Xiao-ling1，WANG Hao1，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.School of Biological Engineering，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

To explore the effect of hawthorn fruit extract on lifespan in male Drosophila melanogaster damaged by high fat and the underlying mechanism of anti-aging.Male Drosophila melanogaster within 2 d-old were treated with different doses（0.5，1.5，4.5 mg/mL）of HFE.The lifespan，anti-oxidation enzymes activities andtheir encoding genes expressions were evaluated.Dietary addition of HFE could prolong the lifespan of Drosophila melanogaster significantly（especially at 4.5 mg/mL）.Given HFE 4.5 mg/mL made the enzyme activity of SOD and CAT increase markedly（P＜0.05）with decreasing the content of malondialdehyde（MDA）（P＜0.01）and protein carbonyl（PCO）（P＜0.05）；moreover，a significant increase in Cu/Zn-SOD and CAT mRNA expression（P＜0.05）as well as Mn-SOD and CAT mRNA expression（P＜0.01）was found.HFE might play a positive and protective role on high-fat fruit flies.Simultaneously，the anti-aging and antioxidant activity of HFE was accompanied by regulation of antioxidation genes expression.

hawthorn fruit extract；Drosophila melanogaste；high fat；antioxidant

2015-09-07

趙江（1963—），男（漢），研究員，研究生，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。

王浩，男，副教授，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。