賀國文，鐘桐生，彭曉赟，龍立平，趙運林,3*，章衛(wèi)民

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茯磚茶褐素組分特征及對α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

賀國文1,2，鐘桐生1，彭曉赟1，龍立平1，趙運林1,3*，章衛(wèi)民4

1. 湖南城市學院化學與環(huán)境工程學院，湖南 益陽 413000；2. 中南大學化學化工學院，湖南 長沙 410083；3. 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004；4. 廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070

采用膜分離技術得到分子質(zhì)量分別為≤3.5?kDa、3.5~25?kDa、25~50?kDa、50~100?kDa和≥100?kDa的5種茯磚茶褐素，比較了其光譜和理化性質(zhì)，鑒定出可能存在的39種成分，研究了它們對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的差異。結果顯示，茯磚茶褐素具有優(yōu)越的降糖功效，活性強弱與總酸性基團、羧基、酚羥基、多糖、蛋白質(zhì)等含量有關。5種茶褐素屬酚類物質(zhì)，均含有羥基、烷基、羧基及苯環(huán)，且在230?nm處有一特征吸收峰。多糖含量隨著分子量的增加而增加，蛋白質(zhì)含量反之，活性顯示25~50?kDa透出部分對α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，相當于阿卡波糖的1.9倍。推測茯磚茶褐素屬苯多酚類，內(nèi)含多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，共同構成半椅狀或椅狀構型。

茯磚茶；茶褐素；組分特征；α-葡萄糖苷酶

茶葉中的很多活性成分有生命保護的功能[1-2]，研究茶中活性成分對于生命健康具有重要意義。茯磚茶是以三級或四級黑毛茶為原料，經(jīng)微生物固體發(fā)酵而成的一種緊壓黑茶。由于生產(chǎn)中微生物的參與，使得茶葉原料中以茶多酚為主的化學成分在微生物酶促作用下發(fā)生一系列的化學變化，香氣具獨特陳香，滋味醇厚[3-4]。研究證明茯磚茶水提物對肥胖小鼠有很強的降脂減肥功效[5-6]。體外α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）抑制試驗是目前一種較為快捷的降糖藥物篩選方法。α-葡萄糖苷酶存在于人體小腸刷狀緣上，人體對淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的利用吸收依賴于小腸刷狀緣上該酶的活性[7]。因此，通過尋找并利用合適的α-葡萄糖苷酶抑制劑來與該酶反應從而降低餐后血糖值已成為目前的研究重點。臨床證明阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑幾乎不被機體所吸收，能與α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結合而形成游離狀態(tài)，從而抑制酶活，阻滯雙糖水解為單糖，有效推遲并減輕餐后血糖升高的時間及進程[8]，同時α-葡萄糖苷酶與酶抑制劑的產(chǎn)物能以原型排出體外或者在大腸內(nèi)經(jīng)細菌發(fā)酵成揮發(fā)氣體排出體外[9-10]。目前，已發(fā)現(xiàn)植物中的多糖及糖苷類、黃酮類、生物堿類、酚酸類和萜類等具有很好的降血糖效果。如茶葉中水溶性復合多糖具有很好的降血糖作用[10]，降血糖的有效成分與色素物質(zhì)有密切關系[11]。

茶褐素是發(fā)酵茶中主要的色素類物質(zhì)，是茶多酚、茶黃素和茶紅素被氧化和聚合的最終產(chǎn)物，是一類分子差異極大的復雜高聚合物[12]。目前對于茶褐素的研究多集中在普洱茶和紅茶方面[13-15]，而對于茯磚茶褐素的組分特征和活性研究鮮見報道，本文對茯磚茶中茶褐素進行提取和純化，并對其光譜學性質(zhì)、理化性質(zhì)和降糖性能進行研究，以明確茯磚茶中茶褐素的基本化學組成和活性基團，可望為闡明茯磚茶褐素的生理活性及其應用提供價值參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

茯磚茶購自湖南益陽茶廠，牛血清蛋白、α-葡萄糖苷酶、對-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷購自Sigma公司，阿卡波糖購自TCI，96孔板為Corning Costa。葡聚糖、無水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、過氧化氫、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鋇、醋酸鈣、考馬斯亮藍G250均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見近紅外分光光度計（UV-3010，日本島津）；紅外光譜儀（370FT-IR，美國熱電）；電熱鼓風干燥機（天津市泰斯特儀器）；自動電位滴定儀（ZD-2A，上海宇通儀器）；酶標儀（MULTISKAN FC，美國熱電）；Bruker DRX500交叉極化魔有旋轉核磁共振儀，采用D2O作溶劑。

1.2 茶褐素的提取純化

根據(jù)茶褐素溶于水，不溶于乙酸乙酯和正丁醇等有機溶劑的特性[13-14]，依次去掉茶褐素中夾帶的茶黃素、茶紅素和皂甙，對茯磚茶褐素進行逐級純化，具體步驟見圖1。

1.3 茶褐素理化性質(zhì)檢測

純化后茶褐素樣品的紫外可見吸收光譜（UV-vis）分析：分別稱取0.01?g茶褐素分級樣品溶于100?mL蒸餾水中，配置成質(zhì)量濃度為0.1?g·L-1的溶液，于200~800?nm波長范圍內(nèi)掃描。

純化后茶褐素樣品的化學結構檢測：茶褐素經(jīng)KBr壓片，于傅立葉變換紅外光譜儀掃描分析，掃描波數(shù)范圍500~4?000?cm-1，分辨率8?cm-1，掃描次數(shù)16。液體核磁共振分析：取樣品約10?mg于核磁管，加入氘代試劑D2O上機測試。

1.4 茶褐素成分檢測

茶褐素成分采用居里點熱裂解氣質(zhì)聯(lián)用（CP-GC/M）分析：將樣品包裹于JHP-5熱箔片中，熱裂解溫度為255℃，時間5?s，進樣針溫度為280℃，采用Agilent公司HP-5色譜柱或DB-5色譜柱。GC分析采用一級程序升溫，60℃下停留2?min，以30℃·min-1升溫至120℃，保持1?min，再以25℃·min-1升溫至250℃，保持10?min。檢測器溫度為280℃，載氣為氦氣，流量為20?mL·min-1，分流比100∶1。質(zhì)譜條件為電離源電子能量70?eV，離子源溫度230℃，掃描范圍為15~500?U。

1.5 茶褐素中基團的測定

總酸性基、茶褐素羧基、茶褐素酚羥基的測定參照文獻[16]，多糖的測定采用苯酚-硫酸法[17]，蛋白質(zhì)采用考馬斯亮藍法[18]測定, 茶褐素分級樣品抑制α-葡萄糖苷酶的效果采用96微孔板試驗方法測定[19]。

2 結果與討論

2.1 茯磚茶褐素不同分子質(zhì)量產(chǎn)品的光譜學性質(zhì)

2.1.1 UV-vis分析結果

所有透析產(chǎn)物在230?nm處附近有吸收肩峰，且紫外區(qū)段隨波長減小吸收值迅速上升。其中吸光度的強弱表現(xiàn)為：3.5?kDa透出部分＞3.5~25?kDa透出部分＞25~50?kDa透出部分＞50~100?kDa透出部分＞100?kDa未透出部分，結果見圖2。

2.1.2 茶褐素的化學結構

所有透析產(chǎn)物的紅外譜圖表現(xiàn)出一致性，在3?420?cm-1處的強吸收峰為-OH的伸縮振動峰，存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵，在3?000~ 3600?cm-1出現(xiàn)的寬峰還可能包含N-H伸縮振動，2?930?cm-1處為烷基的-CH2伸縮振動峰，1?625?cm-1處為C=O的伸縮振動峰，1?409?cm-1處為COO-的對稱伸縮振動峰，1?313?cm-1處應為芳香族C-N的伸縮振動峰，1?240?cm-1處為酚類的C-O伸縮振動峰，1?095?cm-1處為C-O-C的伸縮振動峰，780?cm-1處為苯環(huán)上C-H面外彎曲振動，結果見圖3。由此可知，茶褐素為多羥基酚類物質(zhì)，并含有羧基，可能含有蛋白質(zhì)和與其結合的多糖。與秦誼等[12]對普洱茶茶褐素的紅外光譜研究有一定的相似性，說明兩種發(fā)酵茶中的茶褐素具有相同的官能團。但更確切的基團情況，如聯(lián)接方式、基團數(shù)目、有無分支等尚需其他相關分析。

2.2 茯磚茶褐素的核磁共振分析和主要組分結構表征

為了表征茯磚茶褐素的基團信息，對茶褐素進行核磁共振分析（1H-NMR和13C-NMR），結果見圖4?？梢钥吹?，沒有進行膜分離的茶褐素和分子量在25?kDa＜M≤50?kDa的茶褐素在l~2?mg·kg-1為甲基及亞甲基H峰，3.2~4.8?mg·kg-1之間的峰呈現(xiàn)糖類物質(zhì)特有的H峰，4.8 mg·kg-1為水峰，6~7?mg·kg-1出現(xiàn)微凸狀峰（圖4-a、圖4-b），此處多為苯環(huán)峰，表明該物質(zhì)含大量苯環(huán)，但分子量大于100?kDa的茶褐素的1H-NMR沒有出現(xiàn)特征氫峰（圖4-c），分子量為25?kDa＜M≤50?kDa的茶褐素的13C-NMR（圖4-d）未見吸收峰，主要是因為該物質(zhì)聚合度較大，其次在氘代試劑中溶解性變差。

鑒于茯磚茶褐素屬于非常復雜的組合物，核磁技術不能完全解析茶褐素的基團信息，精細結構很難明確。在本研究中，選取分子量為25?kDa＜M≤50?kDa的茶褐素作為研究對象，首先將其進行居里點熱裂解，再采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）對裂解產(chǎn)物進行檢測。理想情況下，熱解條件應足夠溫和以使熱解產(chǎn)物更好地保持原來的結構。但是太溫和的溫度下，可能裂解不完全，無法產(chǎn)生理想的熱解產(chǎn)物。相反，過高的裂解溫度會將一些物質(zhì)分解成水、二氧化碳等小分子物質(zhì)。因此，本研究中采用較為適宜的裂解溫度255℃進行實驗，圖5為分子量為25kDa＜M≤50?kDa的茯磚茶褐素的熱裂解總離子色譜圖。依據(jù)圖中的信息進行解析，對相似度>65%的裂解成分進行鑒定，共鑒定出39種可能存在的化合物，其中第29、32、34和36四個物質(zhì)均與17-三十五烯烴有很大的相似度（超過77%），可分別定義為類17-三十五烯烴（一、二、三、四），參見表1。從這些物質(zhì)可以看出茶褐素中含有多苯環(huán)類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)、烯烴類物質(zhì)和酯類。

2.3 茯磚茶褐素不同組分的基團成分分析

茯磚茶為黑茶的一種，是由黑毛茶殺青后在其發(fā)酵過程中由多種微生物以及在加工過程中的高溫高濕作用下，發(fā)生了茶多酚的氧化和縮合、蛋白質(zhì)和纖維素等大分子的分解及氨基酸、咖啡堿、糖類等各成分之間的聚合、縮合等一系列的復雜反應而形成的[20]。由表2可知，茯磚茶褐素中含有大量的羧基、酚羥基等活性基團，其中50~100?kDa透出部分的總酸性基團、羧基、酚羥基含量最高，＞100?kDa未透出部分次之，其次為＜3.5?kDa、25~50?kDa、3.5~25?kDa。本研究與張欽等[11]對普洱茶茶褐素膜分離產(chǎn)品的理化性質(zhì)研究有較大相似性。研究發(fā)現(xiàn)羧基、酚羥基均為茶褐素的活性基團，與茶葉藥理活性及品質(zhì)之間有重要關系[16]。同時，多糖含量隨著分子質(zhì)量的增大逐漸增多，以＞100?kDa未透出部分最多，達到0.14%。而蛋白質(zhì)含量則隨著樣品分子質(zhì)量的增大而減少，以＜3.5?kDa透出部分最多，含量為7.55%。推測其原因是多糖、蛋白質(zhì)及茶褐素三者均為大分子高聚物，多糖、蛋白質(zhì)對茶褐素的結合可能為競爭性結合。

2.4 茯磚茶褐素不同組分對α-葡萄糖苷酶活性的影響

小腸黏膜上皮的α-葡萄糖苷酶能夠水解蔗糖、麥芽糖等寡糖類的α-1,4-糖苷鍵，而α-葡萄糖苷酶抑制劑可逆性競爭抑制小腸粘膜刷狀緣α-葡萄糖苷酶的活性，降低淀粉、蔗糖、麥芽糖的分解，使葡萄糖的生成和吸收減緩，使餐后血糖曲線較為平穩(wěn)。從而降低餐后血糖峰值，減少血糖對胰腺的刺激，提高胰島素的敏感性，保護胰腺的功能，有效預防并改善高血糖并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，因此對Ⅱ型糖尿病的預防和治療具有積極作用[21]。

表3為不同分子量的茶褐素及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，很明顯，5種不同分子量透出部分的茶褐素對α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用?？傮w來看，5種產(chǎn)品均對α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈顯著劑量關系，隨著反應體系中濃度的增加，抑制率均呈極顯著上升（＜0.01）。其中25?kDa＜M≤50?kDa、50?kDa＜M≤100?kDa及3.5?kDa＜M≤25?kDa透出部分對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度分別為240?μg·mL-1、290?μg·mL-1及380?μg·mL-1，均低于阿卡波糖的454?μg·mL-1，顯示出了很好的降糖效果。

3 小結與討論

茯磚茶褐素主要是由酚和羧酸類物質(zhì)構成，是由多酚類進一步氧化、聚合而成，同時有糖類、蛋白質(zhì)等非酚類物質(zhì)參與，在結構上為苯多酚類化合物。本研究共鑒定出39種可能存在的多苯環(huán)類物質(zhì)和多酚類化合物。5種不同分子量級的茶褐素產(chǎn)品均表現(xiàn)出了優(yōu)越的降糖性能，其中25~50?kDa透出部分對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最強，降糖效果優(yōu)于阿卡波糖。在今后茶褐素功能產(chǎn)品的開發(fā)中可以根據(jù)產(chǎn)品的需求對其進行不同分子質(zhì)量截取，為黑茶的深度開發(fā)提供價值參考。

α-葡萄糖苷酶活性中心是由甘氨酸或天冬氨酸提供的-COOH相互連接起來的4個亞基，α-葡萄糖苷酶與糖反應時先形成糖-酶中間體，-COOH會與異頭碳結合形成碳氧錨離子過渡態(tài)，并且糖苷環(huán)上的其他-OH也會與酶的多種氨基酸之間形成氫鍵，通過靜電作用保持過渡態(tài)的穩(wěn)定性，然后通過亞基間的酸性進行酸堿催化及親核作用，形成碳陽離子過渡態(tài)物質(zhì)，最終使糖水解[22]。因此有研究指出α-葡萄糖苷酶對底物或抑制劑的結構要求較為嚴格，好的α-葡萄糖苷酶抑制劑應該是酶-底物反應的中間體或碳氧錨離子過渡態(tài)類似物，需要有恰當?shù)牧u基構象、陽離子、三角形的異頭碳中心，并且有1個共價連接的環(huán)所形成的半椅狀或椅狀構型[23]。因此，結合本研究結果，推測茶褐素可能也具有半椅狀或椅狀構型。

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Comparative Study on Component Characteristics and Inhibitory Activities on α-glucosidase of Theabrownin from Fuzhuan Brick Tea

HE Guowen1,2, ZHONG Tongsheng1, PENG Xiaoyun1, LONG Liping1, ZHAO Yunlin1,3*, ZHANG Weimin4

1. College of Chemical and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China; 3. College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 4. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China

By using Fuzhuan brick tea as raw material, five kinds of theabrownin with different molecular weight (≤3.5?kDa、3.5-25?kDa、25-50?kDa、50-100?kDa and ≥100?kDa) have been obtained by membrane separation technology. The spectral and physicochemical properties and inhibition on the α-glucosidase activity of theabrownins were comparative studied. The results showed 39 components from pyrolysis of Fuzhuan theabrownines were identified. The results showed that the theabrownins possessed the advantageous hypoglycemic effect. Effects of biological activity influenced by the total content of acidic group, carboxyl, phenolic hydroxyl, polysaccharide and protein. Five kinds of theabrownin belong to phenolic compounds containing hydroxyl, alkyl, carboxyl and phenyl, and showed a characteristic absorption peak at the 230?nm in UV-vis spectrum. The polysaccharide contents increased with the increase of theabrownin molecular weight, while the protein decreased. The theabrownin with

molecular weight 25-50?kDa showed highest inhibition rate to α-glucosidase, which is equivalent of 1.9 times to that of acarbose. It is suggested that the Fuzhuan brick theabrownine is a benzene substance containing polyphenols, polysaccharides and proteins, which constitute a half chair or the chair conformation.

Fuzhuan brick tea, theabrownine, component characteristics, α-glucosidaseinhibitory

TS272.5+4；Q946.5

A

1000-369X（2016）01-102-09

2015-07-02

2015-08-12

湖南省教育廳一般項目（12C0576）、湖南省科技計劃重點項目（2012WK2013）、湖南省應用基礎研究基地科研基金資助項目（湘科計字[2012]154號）、湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助項目（湘教通[2014]207號）。

賀國文，男，博士，副教授，主要從事中草藥活性功能成分和有機功能材料的研究。*通訊作者：zyl8291290@163.com