黃丹娟，馬建強，陳亮

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茶樹PVP申請品種的SSR分子標記鑒定和系譜關系分析

黃丹娟，馬建強，陳亮*

中國農業(yè)科學院茶葉研究所國家茶樹改良中心，農業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

利用30對SSR引物，對26個植物新品種保護（PVP）申請茶樹品種及其13個近似品種與親本進行了分子鑒定和系譜關系分析，探討SSR分子標記在茶樹新品種保護工作和DUS測試中的應用。研究結果顯示，30對SSR引物共檢測到131個等位基因，每對引物檢測的等位基因數為3~7個，平均4.4個。平均Shannon信息指數（I）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為1.04和0.51。39個參試品種的遺傳距離在0.03~0.70之間。在遺傳距離為0.15時，可將39個品種劃分為7類，其中地理來源一致或遺傳背景相似的材料基本上聚為一類。30對引物的品種鑒定能力差異較大，每對引物能鑒定的品種數為3~16個。通過4對核心引物的組合可以鑒定全部39個參試品種，并依此構建了SSR指紋圖譜。

茶樹；PVP；SSR標記；指紋圖譜

植物新品種保護（Plant variety protection，PVP）是知識產權的一種保護形式。1999年，我國加入國際植物新品種保護聯盟（The international union for the protection of new varieties of plants，UPOV），隨后開始植物新品種保護工作。山茶屬植物與茶組植物分別于1999年和2008年被列入國家林業(yè)局和農業(yè)部發(fā)布的中華人民共和國植物新品種保護名錄。隨著農業(yè)科技創(chuàng)新和知識產權意識的提升，茶樹新品種保護日益受到人們的關注和重視。目前，已獲得植物新品種權授權的茶樹品種有9個，正在進行新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）測試的申請品種有20多個。目前現行的茶樹DUS測試與品種鑒定通常采用基于外觀形態(tài)特征的田間觀察檢測方法，需要茶苗定植后兩年以上才能開展，并且測試性狀多為多基因控制的數量性狀，受環(huán)境條件影響，可能導致測試結果不穩(wěn)定，進一步延長測試周期。同時，近年來茶樹新品種的遺傳基礎越來越集中在少數骨干親本上，根據形態(tài)學進行品種鑒定越來越困難。因此，開發(fā)簡單快速穩(wěn)定的測試技術，對于提升茶樹新品種保護和管理能力具有重要意義。

基于DNA標記技術構建的分子指紋圖譜，具有高度的特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，是植物品種鑒定中十分有效的輔助手段。其中，SSR（Simple sequence repeat）標記因具有等位變異高、共顯性遺傳、操作簡便快速等優(yōu)點[1]，在植物指紋圖譜研究中被廣泛應用。UPOV在其生物化學和分子技術測試指南中已將SSR標記作為DNA指紋數據庫構建的推薦標記之一。目前，我國利用SSR標記已構建了玉米[2-3]、小麥[4-5]、水稻[6-7]等作物現有品種的DNA指紋數據庫，并且在新品種DUS測試中展現出巨大的應用潛力。

本研究利用30對SSR引物對26個茶樹PVP申請品種及其13個近似品種與親本進行分子鑒定和系譜關系分析，通過篩選特征引物組合，構建參試品種的SSR指紋圖譜，探討其在茶樹DUS測試中的應用潛力，以期為我國茶樹新品種權保護提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的39個茶樹品種如表1所示，其中1~26號為已經獲得新品種權或正在進行DUS測試的品種，27~39號為對應的近似品種和親本。從國家種質杭州茶樹圃（I）和勐海茶樹分圃（II）、貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所（III）、廣東省農業(yè)科學院飲料植物研究所（IV）采摘各參試品種無病蟲害感染的一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用改進的CTAB法[8]提取基因組DNA，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，ND-1000 UV-Vis Speetrophotometer檢測DNA濃度，稀釋到20?ng·μL-1用于PCR擴增。

1.2.2 PCR擴增及產物檢測

30對SSR引物的相關信息參見馬建強[9]的報道。引物序列由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系為DNA 2?μL，10×PCR buffer (Mg2+) l?μL，2?U·μL-1Taq DNA polymerase 0.2?μL，10?μmol·L-1Forward primer 0.2?μL，10?μmol·L-1Reverse primer 0.2?μL，10?nmol·L-1dNTPs 0.2?μL。PCR反應程序為94℃預變性4?min，然后94℃變性30?s，退火30?s（退火溫度根據所用引物確定），72℃延伸30?s，重復35個循環(huán)；隨后72℃下延伸7?min。PCR產物用10%的聚丙烯酰胺凝膠和銀染法進行檢測[10]。

1.2.3 數據統計與分析

采用人工讀帶方法，每對引物只分析目標條帶附近的擴增位點，等位基因按照電泳圖譜從上到下依次命名為A、B、C、D、E等。利用POPGENE[11]統計每對引物在39個茶樹品種中擴增等位基因數（Observed number of alleles，Na），計算有效等位基因（Effective number of alleles，Ne）、等位基因頻率（Allele frequency）、觀測雜合度（Observed heterozygosity，HO）、期望雜合度（Expected heterozygosity，HE）、Shannon信息指數（Shannon’s information index，I）。采用PowerMarker[12]計算基因型數（Genotype）、多態(tài)性信息量（Polymorphism information content，PIC），并根據Nei′s[13]遺傳距離，進行Neighbor-Joining聚類分析。根據所選SSR引物的擴增條帶清晰程度、基因型個數、PIC值高低等因素，篩選出能鑒別所有品種的核心引物。將核心引物擴增出的基因型轉換為[0, 1]數據矩陣，利用在線二維碼生成器（http://cli.im）構建DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的多態(tài)性

利用30對SSR引物對39份供試材料進行擴增，結果如表2所示。30對SSR引物共擴增出131個等位基因，每對引物擴增出的等位基因數為2~7個，平均4.4個；有效等位基因變異范圍1.29~4.49，平均2.53個；共檢測到239個基因型，平均達8個。引物觀測雜合度（HO）最大為0.76，最小為0.21，平均值為0.47；期望雜合度（HE）最大為0.79，最小為0.23，平均值為0.56。Shannon信息指數（I）變化范圍較大，為0.38~1.60，平均1.04。多態(tài)信息含量（PIC）最小為0.20，平均多態(tài)信息含量為0.51，引物TM391的PIC信息最高為0.74。

30對SSR引物在供試品種中共檢測出了131個等位基因，不同等位基因出現頻率差異很大。TM526的等位基因B出現頻率最高（84%），其次為TM584的等位基因C（82%）。出現頻率最低的為TM535的等位基因A和E，都只有1%（圖1）。

2.2 39個新品種DNA指紋圖譜的構建

將30對SSR引物的擴增譜帶轉化為[0, 1]數據進行分析，根據SSR引物擴增結果，30個茶樹品種中有23個具有特征譜帶（表3）。

利用特征引物可以快速準確地鑒定這些茶樹品種。

根據特征譜帶統計結果可以看出，任何1對引物都不能區(qū)分開所有品種，只有采用引物組合鑒定的方式才能將39個品種全部區(qū)分開來。綜合考慮所選SSR引物的擴增條帶清晰程度、基因型個數、PIC值高低等因素，將引物進行排序，通過組合的方式，本研究采用最少4對引物（TM444、TM548、TM259、TM566），便可將參試品種全部區(qū)分開來。利用這4個標記的擴增信息，將參試品種的等位基因轉換為l和0字符串，作為每一品種的分子身份證，并利用在線二維碼生成器（http://cli.im）建立39份供試材料的指紋圖譜（表4，圖2）。

2.3 品種系譜關系分析

根據30對SSR引物等位基因出現的頻率計算Nei′s遺傳距離（D），結果顯示39個品種的遺傳距離為0.03~0.70。其中來源于浙江的品種黃金斑和金玉緣的遺傳距離最小，來源于浙江的品種花欲容和來源于云南的品種云

茶奇蕊的遺傳距離最大。

根據Nei′s遺傳距離（D），繪制39份材料的Neighbor-Joining聚類圖。當D為0.15時可以將所有供試材料分為7類，相同地理來源或遺傳背景的品種基本上聚為一類。例如，第I和第II類群主要聚類了浙江省的品種，第IV和第V類群分別聚類了貴州和云南的品種。從遺傳背景來看，中茶125、中茶126和中茶128都是從龍井43的雜交后代中選育而來，黃金斑和金玉緣分別為黃金芽自然芽變后代培育獲得，云抗14號和云抗10號均選自南糯山群體，它們分別聚在了一起。

3 討論

3.1 SSR引物的多態(tài)性

利用分子標記構建指紋圖譜的原則之一就是利用盡量少的引物分開盡量多的品種，以降低成本，提高檢測效率，這對所用標記的多態(tài)性有一定要求。段艷鳳等[14]從138對SSR引物中篩選出6對多態(tài)性高、譜帶清晰的引物，構建了88個馬鈴薯品種的指紋圖譜，引物多態(tài)信息含量均大于0.7。羅忠霞等[15]從342對SSR引物中篩選出了16對SSR核心引物，其平均多態(tài)信息含量達0.79，最終用2對引物即可鑒別所有52份甘薯種質資源。本研究所用的30個SSR標記是前期經篩選過的，擴增效果都比較清晰、穩(wěn)定，大部分樣品獲得了1~2條譜帶，平均多態(tài)信息含量為0.51。多態(tài)性較低的標記（PIC＜0.25）有3個；多態(tài)性適中（0.25＜PIC＜0.5）的有9個；多態(tài)性高（PIC＞0.5）的達18個，占所有引物總數的60%。上述結果說明，本研究選用的30個SSR標記多態(tài)信息含量豐富，在品種鑒定方面具有較高的應用潛力。

3.2 DNA指紋圖譜的構建

核心標記組合法在構建作物DNA指紋圖譜時十分有效。韓宗福等[16]從63對SSR引物中篩選出5對引物的組合，構建了黃河流域棉花主栽品種的分子指紋圖譜。陸徐忠等[5]從前人研究的基礎上篩選出一套12對SSR核心引物（每條染色體1對）對127份水稻品種進行了分子指紋分析。在茶樹DNA指紋圖譜構建中，Ujihara等[17]、楊陽等[18]、劉本英等[19]、王讓劍等[20]進一步驗證了核心SSR引物組合的適用性。本研究篩選出TM444、TM548、TM259和TM566等4對核心引物可區(qū)分開所有的品種。這4對核心引物單獨可鑒定的品種數分別是13、11、9、7。根據劉峰等[21]提出的核心引物理論，可區(qū)分的最大品種數N=G1×……×Gn，Gn為n個引物在參試品種中檢測到的基因型。這4對核心引物組合理論上可鑒定的最大品種數為9009，理論上可以滿足現有茶樹PVP申請品種鑒定的需要。

3.3 DUS測試中近似品種選擇

在DUS測試中，需要將申請品種與近似品種進行多方面比較，當兩個品種存在明顯和穩(wěn)定的差異時，申請品種才具有特異性。因此，近似品種的選擇至關重要，必須以科學、嚴謹的方法篩選。系譜真實反映了品種之間的親緣關系，具有相同遺傳背景的品種，在表型性狀和SSR擴增電泳圖譜上均具有相似性，因此，近似品種的選擇可以參考親緣關系分析[22]。本研究中，遺傳背景相似的品種大多聚在一起。例如黃金斑和金玉緣都是由黃金芽的自然突變單株選育而來，二者遺傳距離在所有參試品種中最小，只有0.03。有的品種與父母本中的一個親本聚在一起，而與另一個親本則相距甚遠。如中茶126為毛蟹與龍井43的雜交后代，它與毛蟹分在了不同類群，而與龍井43聚在一起。綜上所述，SSR標記應用于茶樹DUS測試近似品種輔助選擇是可行的。

本研究通過30對SSR引物對26個茶樹PVP申請品種及其13個近似品種和親本進行分子鑒定和系譜關系分析，30對SSR引物中60%的引物多態(tài)性高，聚類分析將地理來源一致或遺傳背景相似的材料基本上聚為一類。通過4對核心引物的組合可以清晰地區(qū)分所有39個參試品種，并依此構建了SSR指紋圖譜，為茶樹PVP申請品種鑒定、DUS測試和知識產權保護等方面提供一定的理論依據。

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SSR Identification and Pedigree Analysis of PVP Application Cultivars in Tea Plant

HUANG Danjuan, MA Jianqiang, CHEN Liang*

Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Thirty SSR markers were used in this study for molecular identification and pedigree analysis of 26 PVP application tea cultivars, and 13 similar cultivars and parents, for probing the possible application of PVP and DUS testing using SSR markers in tea plant. A total of 131 alleles were detected, the number of alleles detected by each SSR marker ranged from 3 to 7, with a mean of 4.4. The average values of Shannon index and polymorphism information content were 1.04 and 0.51, respectively. The genetic distance ranged from 0.03 to 0.70 between 39 cultivars. When the genetic distance was 0.15, they could be classified into 7 groups. Tea cultivars from the same province and genetic background were clustered into one group to some extent. The identification ability of the 30 SSR markers was quite different, each marker could identify 3-16 cultivars. The 39 tea cultivars could be clearly distinguished by 4 core primers which were used to construct the molecular fingerprinting of all cultivars.

tea cultivars, PVP, SSR markers, fingerprinting

S571.1；Q52

A

1000-369X（2016）01-068-09

2015-08-12

2015-09-14

國家茶葉產業(yè)技術項目（CARS-023）、中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）、浙江省農業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12905）資助。

黃丹娟，女，碩士研究生，主要從事茶樹資源育種研究。*通訊作者：liangchen@tricass.com