黃浩，趙熙，黃懷生，銀霞，粟本文，鐘興剛，黃建安，鄭紅發(fā)*，劉仲華*

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茯茶“散茶發(fā)花”加工前后差異化學(xué)成分的分離與鑒定

黃浩1,2,3，趙熙1，黃懷生1，銀霞1，粟本文1，鐘興剛1，黃建安2,3，鄭紅發(fā)1*，劉仲華2,3*

1. 湖南省茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

以烏龍茶（大紅袍）、紅茶、綠茶、黑茶（天尖茶原料、金湘益茯磚茶原料）為加工原料，運(yùn)用“散茶發(fā)花”技術(shù)，加工制得不同茶類(lèi)散裝茯茶制品。本研究以不同性質(zhì)茶葉的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣作為研究對(duì)象，將“發(fā)花”前后的茶樣經(jīng)HPLC圖譜疊加比對(duì)分析，尋找“發(fā)花”前后主要新增差異化學(xué)成分，同時(shí)運(yùn)用制備色譜制備目標(biāo)差異化學(xué)成分，并經(jīng)HR-MS和NMR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明，在本研究的分離條件下，不同性質(zhì)的5種茶葉原料經(jīng)相同“發(fā)花”處理后，各組形成的差異化學(xué)成分基本表現(xiàn)一致，其中選取分離、鑒定的兩種新增差異化學(xué)成分均為黃酮醇化合物，分別是槲皮素和山奈酚。

茯茶；散茶發(fā)花；新增差異化學(xué)成分；黃酮類(lèi)化合物；槲皮素；山奈酚

歷年來(lái)，我國(guó)西北地區(qū)游牧名族日常生活以牛、羊肉及奶制品等高脂、高熱量食物為主，蔬菜缺乏的邊疆地區(qū)將傳統(tǒng)茯磚茶作為膳食纖維添加而被人們廣泛攝取，氣候特點(diǎn)與飲食習(xí)慣造就了茯磚茶在邊疆地區(qū)的興起，該茶成了人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?，“寧可三日無(wú)糧，不可一日無(wú)茶”[1]的美譽(yù)在邊疆地區(qū)的流傳見(jiàn)證了茯磚茶在我國(guó)邊疆地區(qū)的興旺與發(fā)展。生活水平的提升與健康理念的加強(qiáng)，現(xiàn)代化茯茶加工工藝的發(fā)展及創(chuàng)新型茯茶產(chǎn)品的涌現(xiàn)推動(dòng)了茯茶產(chǎn)業(yè)鏈的形成和高速發(fā)展，顯著提升了茯茶制品的流通量，如今，茯茶制品的銷(xiāo)售區(qū)域也由過(guò)去的邊疆地區(qū)逐漸向內(nèi)陸地區(qū)甚至全世界迅速擴(kuò)張。

茯茶不僅因其獨(dú)特的加工工藝與風(fēng)味品質(zhì)聞名于世，且其突出的保健功效也逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。獨(dú)有的“發(fā)花”工藝與成品茶中形成的優(yōu)勢(shì)“金花”菌使現(xiàn)代化茯茶具備了區(qū)別于其加工原料的特有品質(zhì)風(fēng)味與保健功效[2]，現(xiàn)代科學(xué)研究證明，茯茶在調(diào)節(jié)高血脂癥、高血糖癥、減肥等保健功效方面有著突出的功效[3-5]，“金花”菌則被視作為保健功效的關(guān)鍵，因此，“發(fā)花”處理的茯茶成品中特異性功能成分的分離與鑒定成了研究的重點(diǎn)。本研究運(yùn)用現(xiàn)代化茯茶加工新技術(shù)——茯茶“散茶發(fā)花”技術(shù)，分別以不同茶類(lèi)原料茯茶的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣作為研究對(duì)象，對(duì)“發(fā)花”前后的茶樣經(jīng)HPLC圖譜疊加比對(duì)分析，尋找“發(fā)花”前后主要新增差異化合物，并運(yùn)用制備色譜制備目標(biāo)差異化合物，經(jīng)HR-MS和NMR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，以期為茯茶保健功效的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

“金花”菌——冠突散囊菌（）[6]，為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藏菌株，分離自湖南益陽(yáng)茶廠有限公司產(chǎn)茯磚（800?g裝，產(chǎn)于2007年）。

1.2 供試茶葉及取樣

2013年產(chǎn)大紅袍（福建武夷山，代號(hào)A），2010年產(chǎn)紅茶（湖南石門(mén)，代號(hào)B），2011年產(chǎn)綠茶（湖南石門(mén)，代號(hào)C），2012年產(chǎn)天尖茶原料（湖南安化，代號(hào)D），2008年金湘益茯磚茶原料（湖南益陽(yáng)，代號(hào)E）。按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求[2]對(duì)以上4種不同茶類(lèi)的5種茶葉原料進(jìn)行“散茶發(fā)花”處理（n=6），恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)花10?d，“發(fā)花”后茶樣經(jīng)70℃干燥4?h，編號(hào)并置于－20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

兒茶素、生物堿、槲皮素、山奈酚等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%）均購(gòu)置Sigma公司，乙腈（色譜純，美國(guó)MERCK公司），甲醇（色譜純，美國(guó)Honeywell公司），乙酸（分析純，成都科龍化學(xué)試劑有限公司），超純水（Millipore超純水儀自制）。

1.4 儀器與設(shè)備

Delta320 pH計(jì)（Mettler）、Motic B1光學(xué)顯微鏡（Motic公司）、萬(wàn)分之一電子天平（Mettler AE240）、MIKRO-35高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich）、蘇凈雙人單面超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)）、振蕩恒溫培養(yǎng)箱（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（江蘇環(huán)保儀器廠）、高溫高壓滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）、冷凍干燥儀（廣州貝立思有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）、Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6320離子阱質(zhì)譜、Bruker 400 Ultra-ShieldTM超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振、水浴鍋、5?mL一次性注射器（河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司）、100?mL容量瓶、0.45?μm微濾過(guò)濾頭（Millipore）等。

1.5 “散茶發(fā)花”茯茶茶樣與茶湯制備

按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求將各茶類(lèi)原料加水至相同最終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，置培養(yǎng)箱中控溫、控濕培養(yǎng)10?d，“發(fā)花”結(jié)束后置于70℃恒溫干燥箱中4?h即可取出封存[7]。

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥茶樣2.0?g至錐形瓶，加沸水100?mL置90℃水浴鍋中浸提30?min，期間每10?min搖瓶1次，浸提結(jié)束后精細(xì)抽濾于100?mL容量瓶中冷卻定容，混勻備用[8-9]。分析檢測(cè)與鑒定樣品需經(jīng)孔徑0.45?μm濾膜過(guò)濾。

1.6 “散茶發(fā)花”茯茶加工前后差異化合物分析

1.6.1 “散茶發(fā)花”茯茶發(fā)酵前后HPLC圖譜 分析

色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器及柱溫箱，色譜柱Welchrom C18（4.6?mm×250?mm，5?μm），流動(dòng)相A為0.2%乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速為1?mL·min-1，柱后分流0.5?mL·min-1進(jìn)入質(zhì)譜離子源，柱溫30℃，進(jìn)樣量5?μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280?nm，梯度條件[10]為：0~4?min，B：6%；4~16?min，B：6%~14%；16~22?min，B：14%~15%；22~32?min，B：15%~18%；32~ 37?min，B：18%~29%；37~47?min，B：29%~ 45%；47~52?min，B：45%；52~53?min，B：45%~6%；53~63?min，B：6%。

質(zhì)譜條件：正、負(fù)離子ESI源的Agilent 6320離子阱質(zhì)譜，霧化器壓力為45?psi，毛細(xì)管電壓：3.5?kV，干燥氣流速為12?mL·min-1，干燥氣溫度為350℃，質(zhì)量掃描范圍：100~1000?amu。

1.6.2 “散茶發(fā)花”茯茶目標(biāo)差異物制備與鑒定

（1）茶葉水提物制備：將茶葉粉碎后參照1.5提取，精細(xì)抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后至冷凍干燥器中凍干，獲得茶葉提取物干粉，袋裝封口置于－20℃冰箱中備用。

（2）色譜條件：Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱LUNA C18（50?mm×250?mm，10?μm），DAC：Novasep 50?mm，流動(dòng)相：乙腈（0.1%三氟乙酸）∶硝酸鈰銨=70∶30，流速為118?mL·min-1，進(jìn)樣量5?mL，運(yùn)行時(shí)間為30?min。

（3）質(zhì)譜測(cè)定條件：正、負(fù)離子ESI源的Agilent 6320離子阱質(zhì)譜，霧化器壓力為45?psi，毛細(xì)管電壓：3.5?kV，干燥氣流速為12?mL·min-1，干燥氣溫度350℃，質(zhì)量掃描范圍：100~1000? amu。

（4）NMR：Bruker 400 Ultra-ShieldTM超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振儀。H-NMR和C-NMR：以氘代水為溶劑，丙酮為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種茶樣“散茶發(fā)花”茯茶樣品

按照“散茶發(fā)花”的技術(shù)要求將各茶類(lèi)原料加水至相同最終含水量，接以相同劑量的冠突散囊菌，放置培養(yǎng)箱控溫控濕培養(yǎng)10?d，“發(fā)花”結(jié)束后置于70℃恒溫干燥箱中4?h，取出封存。比對(duì)各茶樣“發(fā)花”的茯茶實(shí)物圖（圖1）發(fā)現(xiàn)，相同劑量和相同時(shí)間處理的“發(fā)花”茶樣均“金花”滿披，除外觀形態(tài)有細(xì)微差別外，其他并無(wú)表現(xiàn)出明顯差異。

2.2“散茶發(fā)花”茯茶“發(fā)花”前后差異化合物HPLC圖譜疊加比對(duì)分析

按照1.6.1的HPLC方法進(jìn)樣分析，經(jīng)HPLC圖譜比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5種茶樣發(fā)花前后的差異化合物表現(xiàn)出一致性（圖2~圖6），同時(shí)分別在保留時(shí)間45.9?min和49.3?min左右新增兩個(gè)峰，且5種“發(fā)花”處理樣品中新增的兩個(gè)目標(biāo)化合物在保留時(shí)間上呈現(xiàn)高度一致（圖7），這說(shuō)明采用不同茶葉原料進(jìn)行相同“發(fā)花”處理，最終形成了相同的差異化合物。

2.3 差異化合物制備

按照方法1.6.2對(duì)“發(fā)花”10?d的茶樣進(jìn)行制備色譜分離制備，所得色譜圖如圖8所示，結(jié)果表明，在保留時(shí)間為12.5?min（差異化合物1）和22.5?min（差異化合物2）處分別檢測(cè)到單一流分，隨即分別對(duì)這兩處流分進(jìn)行收集，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃水浴下濃縮以去除有機(jī)溶劑，最后再進(jìn)行冷凍干燥并保存。

2.4 差異化合物結(jié)構(gòu)鑒定

按照方法1.6.1，分別對(duì)所得流分1和2進(jìn)行分析型HPLC進(jìn)樣分析，所得色譜圖如圖9、圖10所示，結(jié)果表明，在保留時(shí)間為45.794?min和49.299?min處分別檢測(cè)到差異化合物1和差異化合物2，并將所得兩個(gè)化合物作HR-MS和NMR檢測(cè)分析。

根據(jù)化合物1和2的類(lèi)別判斷可知，二者均為黃酮類(lèi)化合物，化合物1，C15H11O7，淡黃色無(wú)定型粉末，MS，/：303.0500，[M+H]+（圖11）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d7.73 (1H, d,= 1.8 Hz, H-11)，7.63 (1H, dd,= 8.0 Hz, H-15)，6.88 (1H, 1H, d,= 8.0 Hz,H-14)，6.38 (1H, d,= 1.8 Hz H-8)，6.18 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.7(C-7)，162.6 (C-5)，158.4 (C-9)，148.9 (C-13)，148.2 (C-1)，146.3 (C-12)，137.3 (C-2)，124.3 (C-10)，121.8 (C-15)，116.4 (C-14)，116.1(C-11)，104.6 (C-4)，99.4 (C-6)，94.5 (C-8)，經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[11-13]，以上數(shù)據(jù)與槲皮素基本一致，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖12，化合物1的關(guān)鍵HMBC二維核磁相關(guān)見(jiàn)圖13。

化合物2，C15H11O6，淡黃色無(wú)定型粉末，MS,/: 287.0553, [M+H]+（圖14）；1H NMR (CD3OD, 600 MHz)d8.09 (2H, d,= 8.0 Hz, H-11, H-15)，6.90 (2H, d,= 8.0 Hz, H-12, H-14)，6.40 (1H, d,= 1.8 Hz, H-8)，6.18 (d,= 1.8 Hz, H-6)，13C NMR (CD3OD, 125M Hz)d177.5 (C-3)，165.8(C-7)，162.6 (C-5)，160.7 (C-13)，158.48 (C-9)，148.2 (C-1)，116.4 (C-14)，

116.4 (C-12)，137.2 (C-2)，130.8 (C-15)，130.8(C-11)，123.9 (C-10)，104.7 (C-4)，99.4 (C-6)，94.6 (C-8)。經(jīng)與文獻(xiàn)對(duì)照[12-14]，以上數(shù)據(jù)與山奈酚基本一致，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖15，化合物2的關(guān)鍵HMBC二維核磁相關(guān)見(jiàn)圖16。同時(shí)結(jié)合兩種化合物的高效液相色譜圖，其保留時(shí)間分別與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素、山奈酚均一致，見(jiàn)圖17。因此將目標(biāo)差異化合物分別鑒定為槲皮素（化合物1）和山奈酚（化合物2）。

3 討論

從傳統(tǒng)的茯磚茶到多樣化的現(xiàn)代化茯茶的演變，經(jīng)歷了加工工藝的改善與簡(jiǎn)化，生產(chǎn)效率的提高，質(zhì)量可控性的加強(qiáng)，產(chǎn)品形式的增加，消費(fèi)者飲用方式的改變與產(chǎn)品價(jià)值的提升，同時(shí)工藝的改進(jìn)使研究者們能夠更加便捷地獲得特定茶葉原料制茯茶，甚至非茶葉原料

制發(fā)花試驗(yàn)材料[15]，茯茶“散茶發(fā)花”技術(shù)的應(yīng)用為以冠突散囊菌為供試發(fā)酵真菌對(duì)特定植物材料或功能性生化成分的微生物代謝、生物轉(zhuǎn)化研究及功能性真菌發(fā)酵食品的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

茯茶因其獨(dú)特的加工工藝、風(fēng)味品質(zhì)與突出的保健功效而聞名于世，獨(dú)有的“發(fā)花”工藝與成品茶中的優(yōu)勢(shì)“金花”菌使現(xiàn)代茯茶形成了區(qū)別于其加工原料的特有的品質(zhì)風(fēng)味與保健功效，其實(shí)質(zhì)是“金花”菌通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中分泌復(fù)雜多樣的孢外酶以及微生物熱，直接或者間接利用茶葉生化成分作為滿足其生長(zhǎng)、繁殖需要的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)[16]，期間發(fā)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，一方面形成了茯茶特異的風(fēng)味品質(zhì)，另一方面“金花”菌以茶葉功能成分為代謝基質(zhì)或代謝出性質(zhì)更為全面或功能更強(qiáng)的生化成分。

因此，“發(fā)花”處理的茯茶成品中特異性功能成分的尋找成了研究者們關(guān)注的重點(diǎn)，本研究運(yùn)用現(xiàn)代化茯茶加工新技術(shù)的便捷性，分別以不同茶類(lèi)原料制茯茶的“發(fā)花”（真菌固體發(fā)酵）前后茶樣為研究對(duì)象，對(duì)“發(fā)花”前后的茶樣經(jīng)HPLC圖譜疊加比對(duì)分析，尋找“發(fā)花”前后主要差異化學(xué)成分，并運(yùn)用制備色譜制備目標(biāo)差異化合物，經(jīng)HR-MS和NMR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果表明，在本研究的分離條件下，不同性質(zhì)的茶葉原料經(jīng)相同“發(fā)花”處理，與其對(duì)應(yīng)原料相比，各組形成的差異化學(xué)成分表現(xiàn)出高度一致性，差異化學(xué)成分均為黃酮醇化合物，分別為槲皮素和山奈酚。

黃酮類(lèi)化合物因分子中有酚羥基而顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中；黃酮類(lèi)化合物分子中γ-吡喃酮環(huán)上的1-位氧原子因有未共用的電子對(duì)，所以表現(xiàn)出微弱的堿性，其溶解度也因結(jié)構(gòu)不同而具有很大的差異，黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑和稀堿液中，而黃酮類(lèi)化合物通常以黃酮糖苷的形式存在于茶葉中，因此本研究在各茶葉原料HPLC圖譜中未找到兩種目標(biāo)黃酮醇化合物，經(jīng)“發(fā)花”處理后，實(shí)質(zhì)可能是在微生物分泌的酶和熱的作用下將原本以黃酮苷形式存在于茶葉中的黃酮類(lèi)化合物經(jīng)水解作用形成了黃酮醇化合物，從而在不同茶類(lèi)“發(fā)花”制品的HPLC圖譜中檢測(cè)到相同的兩種差異黃酮醇化合物，此研究結(jié)果可能為“發(fā)花”茯茶的突出保健功效提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of Variant Phytochemical in the Processing of Fu Tea by Fungal Fermentation with Loose Tea

HUANG Hao1,2,3, ZHAO Xi1, HUANG Huaisheng1, YIN Xia1, SU Benwen1, ZHONG Xinggang1, HUANG Jian’an2,3, ZHENG Hongfa1*, LIU Zhonghua2,3*

1. Hunan Tea Research Institute, Changsha 410125, China; 2. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China

Several kinds of Fu tea were obtained by the technology of “fungal fermentation with loose tea” with different tea samples such as Dahongpao tea, black tea, green tea, the raw material of Tianjian tea and the raw material of Jinxiangyi brick tea. With different properties of tea samples (fungal solid state fermentation) generated from “fungal fermentation” as the research objects, this article has searched the main variant phytochemical through comparative analysis with the help of HPLC overlay method. Meanwhile, targeted variant compounds have been constructed with preparative HPLC with preliminary identification by HR-MS and NMR. The experiment indicated that under the detached condition of this study, different kinds of Fu tea generated the same compounds after “fungal fermentation”. And the two added variant compounds are flavonols, named quercetin and kaempferol respectively.

Fu tea, fungal fermentation with loose tea, variant compounds, flavonols,quercetin, kaempferol

TS272.5+4；Q946.84+1

A

1000-369X（2016）01-027-11

2015-06-02

2015-08-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471706）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-23）、湖南省茶葉研究所所長(zhǎng)基金（2015SJ01）。

黃浩，男，博士，主要從事茶葉加工及功能成分研究。*通訊作者