曾光輝，馬青平，王偉東，周琳，尹盈，黎星輝*

?

自然低溫對茶樹內源激素含量的影響

曾光輝1,2，馬青平2，王偉東2，周琳2，尹盈2，黎星輝2*

1.溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006；2. 南京農業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京210095

以南京中山陵茶園中十年生龍井長葉茶樹為試驗材料，用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定自然低溫下茶樹葉片內源激素含量的變化，以探討自然低溫下茶樹內源激素變化規(guī)律。結果顯示，自然越冬期間，茶樹葉片中吲哚乙酸（IAA）含量的波動幅度最大，脫落酸（ABA）次之，而赤霉素（GA3）與玉米素核苷（ZR）波動幅度較??；同時，除了ABA外，茶樹其他內源激素IAA、ZR和GA3含量變化趨勢一致；激素間比值變化和相關性分析顯示ZR與GA3、ZR與IAA、IAA與GA3含量變化極顯著相關，ABA與IAA、ABA與ZR呈顯著正相關。試驗結果表明，茶樹內源激素之間關系密切，茶樹可能通過調控ABA/(GA3+IAA+ZR)的比值來適應自然低溫環(huán)境。

茶樹；自然低溫；內源激素

低溫是影響茶樹（(L.) Kuntze）生長和繁殖的重要因素，冬季的極端低溫和初春的“霜凍”或“倒春寒”常常造成茶樹的低溫傷害，制約茶葉產業(yè)發(fā)展[1-2]。

植物內源激素是植物生長發(fā)育過程中重要的調節(jié)物質，主要包括生長素類（IAA）、脫落酸（ABA）、細胞分裂素（CTK）、赤霉素類（GAs）和乙烯類（Eth），以及油菜素甾體類（BRs）、多胺類（PA）及茉莉酸類（JA）等近似激素類物質[3]。植物內源激素幾乎參與了植物生長發(fā)育過程中所有生理過程的調節(jié)，同時在非生物脅迫中也起著至關重要的作用[3-6]。其中，關于植物內源激素在低溫脅迫下的響應，國內外已有大量的研究報道。曲凌慧等[7]研究表明，低溫下葡萄葉片中出現(xiàn)ABA和JA的猝發(fā)。Xu等[8]研究顯示，冷脅迫誘導ABA的合成，且外源ABA能夠提高植株的抗寒性，意味著ABA在植物適應低溫環(huán)境中具有重要作用。其他激素，特別是CTK、水楊酸（SA）和JA，也被證實在植物對低溫脅迫的響應過程中發(fā)揮直接或間接的作用[3]。茶樹內源激素的研究起步相對較晚，且偏重于激素對茶樹生長發(fā)育影響的研究。其中，Pan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹新梢的生長受IAA和ABA含量的影響，更受二者比值的影響；潘根生等[10-12]發(fā)現(xiàn)，低ABA/GA3和ABA/玉米素（ZT）比值是茶樹新梢生長的必要條件，而高ABA/GA3和ABA/ZT比值則是誘發(fā)茶樹新梢冬季休眠的主要原因，且新梢的生長速率與內源ZT含量呈顯著正相關，表明ABA、GA3和ZT間的相互作用對茶樹新梢生長起著重要作用。目前，關于植物內源激素與茶樹抗性的研究較少，且集中在茶樹耐旱與其內源激素關系的研究。潘根生等[13]研究表明，耐旱型茶樹具有較高的ABA/ZT比值和水分利用率，這可作為茶樹耐旱性的育種指標。然而，由于茶樹中內源激素測定技術的限制，低溫對茶樹葉片中內源激素含量影響的研究尚未見報道，而內源激素可能是茶樹耐寒的一個重要機制，本試驗測定分析了龍井長葉在自然低溫期間葉片中內源激素的含量，以探討自然低溫下茶樹內源激素的變化規(guī)律，從而為進一步深入研究茶樹耐寒與其內源激素的關系研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試驗設計

茶樹供試材料為栽植于南京中山陵茶園的十年生龍井長葉品種茶樹。

隨機選取60株生長良好且長勢一致的茶樹植株作為樣株，并掛牌標記。于2012年11月15日開始，到翌年4月1日，每隔15?d對相同部位的完整、無病蟲害成熟葉片進行取樣，取樣時間為上午8：00。所取樣品用蒸餾水清洗干凈并用濾紙吸干多余水分，稱重后放入液氮速凍，－70℃冰箱保存。試驗期間，取樣當天的氣溫由南京市氣象局中山植物園觀測站提供（表1）。

1.2 內源激素的提取與測定

植物內源激素的提取參考吳曼等[14]所述，將植物樣品置于預冷的研缽中，加入2?mL提取液（80%冷甲醇，含1?mmol?L-1二叔丁基對甲苯酚）并研磨至勻漿，轉入10?mL試管，再用2?mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉入試管中。充分混勻，于4℃下提取4?h，3?500?r·min-1離心8?min，取上清液；沉淀中加1?mL提取液，攪勻，置于4℃下再提取1?h，離心后合并上清液并記錄體積。上清液通過C18固相萃取柱進行純化，收集液經真空干燥后稀釋定容用于后續(xù)實驗。參照李宗霆等[15]所述，通過酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme- linked Immunosorbent Assays，ELISA）測定樣品中吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）和脫落酸（ABA）含量。

1.3 數(shù)據統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據為多次重復的平均值，使用Excel 2007與SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析各組試驗結果數(shù)據的平均值與標準偏差，采用新復極差法（Duncan’s）進行多重比較，使用Excel 2007作圖描繪各組處理及試驗指標的變化曲線。

2 結果與分析

2.1 自然越冬期間茶樹葉片內源激素含量的變化

2.1.1 茶樹葉片IAA含量的變化

如圖1所示，自然越冬期間茶樹葉片內IAA含量的變化幅度較大，2012年11月15日IAA含量為26.33?ng·g-1，11月30日IAA含量達到81.83?ng·g-1，12月15日降至36.01?ng·g-1。另外，12月31日至1月30日間，最低氣溫在0℃以下，IAA含量均較高；
1月30日至3月1日間，隨著氣溫的上升，IAA含量顯著降低；3月15日至3月30日間，IAA含量均高于80?ng·g-1。

2.1.2 茶樹葉片ZR含量的變化

ZR在促進細胞分裂，保證核酸和蛋白質免遭破壞，以及促進核酸和蛋白質的積累方面起著重要作用。自然越冬期間茶樹葉片ZR含量的變化趨勢與IAA基本一致（圖2），ZR含量在越冬期間雖有顯著變化，但其含量較低，均在6.0~14.0?ng·g-1之間。

2.1.3 茶樹葉片ABA含量的變化

自然越冬期間，茶樹葉片脫落酸（ABA）含量為80~165?ng·g-1，保持著較高濃度（圖3）。11月15日至1月15日期間以及3月1日至3月30日期間，ABA含量變化趨勢基本與IAA一致；而1月30日至2月15日期間，ABA含量逐漸增高，IAA則顯著降低。

2.1.4 茶樹葉片GA3含量的變化

茶樹葉片在自然越冬期間赤霉素（GA3）含量變化如圖4所示，越冬期間，除了1月30日與3月15日時GA3含量分別高達16.22、13.47?ng·g-1，其余時間含量在4.93~9.05?ng·g-1間波動。

總之，自然越冬期間，茶樹葉片中內源激素波動幅度依次為IAA>ABA>GA3>ZR，其中IAA、ZR和GA3含量變化趨勢一致，ABA含量變化略有不同。

2.2 自然越冬期間茶樹葉片內源激素比例的變化

為了研究自然越冬期間茶樹葉片中各激素間的相互作用，對內源激素間的比值變化進行了分析。如表2所示，自然越冬期間，ABA含量基本均高于IAA、ZR、GA3含量。ABA含量在2013年1月30日時略低于IAA含量，同時該天ABA含量較低，ABA/IAA、ABA/ZR、ABA/GA3和ABA/（GA3+IAA+ZR）為越冬期間比值最低值。ABA/（GA3+IAA+ZR）在自然越冬期間，在最低氣溫低于0℃期間（2012年12月31日至2013年1月30日以及2013年3月15日至3月31日）比值較小。

2.3 自然越冬期茶樹葉片內源激素相關性比較

如表3所示，在自然低溫期間，茶樹葉片中ZR與GA3含量、ZR與IAA含量、IAA與GA3含量極顯著相關，相關系數(shù)分別為0.831、0.812、0.729；ABA與IAA、ABA與ZR呈顯著正相關，關系數(shù)分別為0.270、0.283；ABA與GA3相關性不顯著。

3 討論

植物激素在生物信號間存在相互作用，包括生物合成、代謝與運輸、信號轉導途徑等方面的相互作用[6,16-18]。姚永宏等[19]研究表明，秋季茶樹內源激素波動幅度IAA最大，ABA次之，而ZR最??；IAA、ZR含量變化趨勢相近，但與ABA相反。本試驗中，自然越冬期間，內源激素波動幅度IAA＞ABA＞GA3＞ZR，同時，IAA和ZR含量變化趨勢一致，這與姚永宏的研究結果基本一致。與秋季不同的是，茶樹內源激素ABA在冬季期間僅在1月30日至2月15日期間變化趨勢相反，與IAA變化趨勢不一致。

生長素是最早發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，它調控側根形成、維管組織分化、頂端優(yōu)勢以及植物的向性反應等。本試驗中，當最低氣溫低于0℃時，IAA含量均保持較高值。近年來，ABA已經被認為是一種脅迫激素，在植物抗寒力的調控以及對維持細胞膜結構功能方面起著重要作用；植物受到生物和非生物脅迫后，內源ABA含量增加，并誘導多種抗逆基因的表達，從而增強其抗逆性；ABA含量的增加對于植物抗性的提高有明顯作用已被證實[20-23]。在自然越冬期間，ABA濃度始終高于85?ng·g-1。因此，自然越冬期間，IAA和ABA含量較高，同時波動幅度較大，兩種激素可能在越冬期間起著重要的調控作用，其含量高低可能是影響茶樹抗寒性的重要指示因子。

玉米素核苷（ZR）是細胞分裂素之一，產生于植物根部，由葉片的蒸騰作用隨木質部向上運輸[24]。自然越冬期間，ZR的變化規(guī)律可能與越冬期間氣溫較低有關，越冬期間最高氣溫、最低氣溫、平均氣溫分別低于20℃、7℃、12℃；低溫下，根系活力較低，蒸騰作用少，因此葉片中ZR含量較低，變化幅度小。赤霉素類（GAs）是種類最多的植物激素，能刺激細胞分裂和伸長，對植物頂端幼嫩部分形成，促進植物的伸長生長等具有顯著效應。試驗期間，茶樹生長緩慢，選擇成熟葉片作為材料，因此測得的GA3含量均在20?ng·g-1以下，且變化幅度較小。

IAA、GA3、ZR為促生長類激素，能影響細胞的伸長、分裂和分化，對植物的生長發(fā)育有促進作用，在逆境脅迫下該類激素含量降低，可使植物生長速度減慢[25-26]。本試驗中，ABA/ZR和ABA/GA3比值雖然在2013年3月1日至3月15日期間隨著氣溫的升高有所降低，但在整個自然越冬期間一直保持著較高值。由此可見在自然低溫期間，隨著溫度的降低，茶樹可能通過對內源激素的調控，增加ABA的合成，減少IAA、ZR和GA3的合成，使茶樹進入冬季休眠或保持休眠狀態(tài)，以減輕低溫對茶樹的傷害。3月1日至3月15日期間隨著氣溫的顯著升高，IAA、ZR、GA3合成速率也提高，導致了ABA/IAA、ABA/ZR和ABA/GA3比值下降，促進了茶樹新梢的生長。而3月15日至3月30日期間，IAA與ABA含量顯著降低，這種變化可能由溫度升高后，新梢生長過程中展葉數(shù)增加導致的。

植物激素在生長發(fā)育和適應環(huán)境變化的過程中，并不是孤立地起作用，而是受多種激素相互作用共同調節(jié)。試驗結果表明，自然低溫期間ZR與GA3、ZR與IAA、IAA與GA3含量變化極顯著相關；ABA與IAA、ABA與ZR顯著正相關；ABA與GA3相關性不顯著。由此可見，茶樹內源激素雖然含量很低，但它們在調節(jié)茶樹的生長、生理和新陳代謝等各個方面起著重要的調控作用。茶樹對低溫的適應是一個復雜的綜合反映，內源激素的調節(jié)起著非常重要的作用，對茶樹營養(yǎng)器官和生殖器官在不同低溫條件下內源激素的變化、相互關系及其對應基因表達的深入研究，將有助于了解茶樹對低溫的響應機制，從而在豐富茶樹生物學理論和促進茶葉生產方面發(fā)揮積極作用。

[1] 鄒中偉, 房婉萍, 張定, 等. 低溫脅迫下茶樹基因表達的差異分析[J]. 茶葉科學, 2008, 28(4): 249-254.

[2] 朱全武, 范凱, 謝艷蘭, 等. 植物低溫脅迫響應miRNAs及其在茶樹抗寒研究中的應用[J]. 茶葉科學, 2013, 33(3): 212-220.

[3] Peleg Z, Blumwald E. Hormone balance and abiotic stress tolerance in crop plants [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(3): 290-295.

[4] Baron K N, Schroeder D F, Stasolla C. Transcriptional response of abscisic acid (ABA) metabolism and transport to coldand heat stress applied at the reproductive stage of development in Arabidopsisthaliana [J]. Plant Science, 2012, 188: 48-59.

[5] Durbak A, Yao H, McSteen P. Hormone signaling in plant development [J]. Current opinion in plant biology, 2012, 15(1): 92-96.

[6] Du H, Wu N, Chang Y, et al. Carotenoid deficiency impairs ABA and IAA biosynthesisand differentially affects drought and cold tolerance in rice [J]. Plant molecular biology, 2013, 83(4): 475-488.

[7] 曲凌慧, 車永梅, 劉新, 等. ABA和JA等激素參與葡萄對低溫脅迫的應答[J]. 青島農業(yè)大學學報: 自然科學版, 2010, 27(1): 36-41.

[8] Xu X X, Shao H B, Mi Y Y, et al. Biotechnological implications from abscisic acid (ABA) roles in cold stress and leaf senescence as an important signal for improving plant sustainable survival under abiotic-stressed conditions [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2010, 30(3): 222-230.

[9] Pan G S, Masaki T, Shigeki K. A study on the relationships between the growth of tea and endogenous hormones IAA and ABA [J]. Acta Agriculturae Universitatis Zhejiangensis, 1992, 18(S): 133-137.

[10] 潘根生, 沈生榮, 錢利生, 等. 茶樹新梢生育的內源激素水平及其調控機理: 第一報[J]. 茶葉, 2000, 26(3): 139-143.

[11] 潘根生, 沈生榮, 錢利生, 等. 茶樹新梢生育的內源激素水平及其調控機理: 第二報[J]. 茶葉, 2000, 26(4): 200-204.

[12] 潘根生, 沈生榮, 吳伯千, 等. 茶樹新梢生育過程內源激素水平的變化[J]. 茶葉科學, 1997, 17(增刊1): 86-91.

[13] 潘根生, 吳伯千, 沈生榮, 等. 水分脅迫過程中茶樹新梢內源激素水平的消長及其與耐旱性的關系[J]. 中國農業(yè)科學, 1996, 29(35): 9-15.

[14] 吳曼, 張文會, 王榮, 等. ‘紅麗’海棠早實植株發(fā)育過程中內源激素變化[J]. 園藝學報, 2013, 40(1): 10-20.

[15] 李宗霆, 周燮. 植物激素及其免疫檢測技術[M]. 南京: 江蘇科學技術出版社, 1996: 279-286.

[16] Golenberg E W, West N W. Hormonal interactions and gene regulation can link monoecy and environmental plasticity to the evolution of dioecy in plants [J]. American Journal of Botany, 2013, 100(6): 1022-1037.

[17] Miransari M, Smith D L. Plant hormones and seed germination [J]. Environmental and Experimental Botany, 2014, 99: 110-121.

[18] Cheng Y Q, Liu J F, Yang X D, et al. Construction of ethylene regulatory network based on the phytohormones related gene transcriptome profiling and prediction of transcription factor activities in soybean [J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2013, 35(4): 1303-1317.

[19] 姚永宏, 徐澤, 侯渝嘉, 等. 秋季茶樹內源激素的ELISA分析及其在不同器官中的分布[J]. 渝西學院學報: 自然科學版, 2005, 4(4): 26-33.

[20] Cao F Y, Yoshioka K, Desveaux D. The roles of ABA in plant–pathogen interactions [J]. Journal of Plant Research, 2011, 124(4): 489-499.

[21] Lee S C, Luan S. ABA signal transduction at the crossroad of biotic and abiotic stress responses [J]. Plant Cell and Environment, 2012, 35(1): 53-60.

[22] Nakamura T, Yazaki J, KishimotoN, et al. Comparison of long-term up-regulated genes during induction of freezing tolerance by cold and ABA in bromegrass cell cultures revealed by microarray analyses [J]. Plant Growth Regulation, 2013, 71(2): 113-136.

[23] Danquah A, Zelicourt A D, Colcombet J, et al. The role of ABA and MAPK signaling pathways in plant abiotic stress responses [J]. Plant Biotechnology, 2014, 32(1): 40-52.

[24] Hansen H, D?rffling K. Root-derived trans-zeatinriboside and abscisic acid in drought-stressed and rewatered sunflower plants: interaction in the control of leaf diffusive resistance? [J]. Functional Plant Biology，2003, 30(4): 365 -375.

[25] 張根發(fā), 王舒靜, 張桂芳, 等. 低溫和植物生長調節(jié)物質處理對好好芭無性系試管苗抗寒相關酶類活性的影響[J]. 中國油料作物學報, 2003, 25(3): 59-63.

[26] Wang C R, Yang A F, Yin H Y, et al. Influence of water stress on endogenous hormone contents and cell damage of maize seedlings [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(4): 427-434.

Effect of Natural Low-temperature on Endogenous Hormones of(L.) Kuntze Plant

ZENG Guanghui1,2, MA Qingping2, WANG Weidong2, ZHOU Lin2, YIN Ying2, LI Xinghui2*

1. Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China; 2. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

To understand the changes of endogenous hormones in tea plant [(L.) O. Kuntze] under natural low-temperature, ten-year-old tea plants of the cultivar ‘Longjingchangye’ were used as the material and the changes of endogenous hormones content were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the fluctuation amplitude of indole acetic acid (IAA) content is highest among all detected hormones during overwintering period. The change of abscisic acid (ABA) content was smaller than IAA but higher than that of gibberellins (GA3) and zeatinriboside (ZR). In addition, the changing trends of IAA, ZR and GA3content is consistent, while the trend of ABA is different from them. Furthermore, the changes between ZR and GA3, ZR and IAA, IAA and GA3content were significantly related. As well, there are significant positive correlations between ABA and IAA, ZR, respectively. All of the above results suggest that endogenous hormones in tea plant are closely related under natural low-temperature. Tea plant may regulate the ratio of ABA/(GA3+ IAA + ZR) to adapt to low temperature.

tea plant, natural low temperature, endogenous hormone

S571.1；Q946.885

A

1000-369X（2016）01-085-07

2015-08-17

2015-10-20

現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金（CARS-23）、國家自然科學基金（31470690）、南京市科技計劃（201301076）、浙江省教育廳高等學校訪問學者專業(yè)發(fā)展項目（FX2012146）。

曾光輝，男，副教授，主要從事園藝作物生理生態(tài)研究。*通訊作者：lxh@njau.edu.cn