王麗紅，張香娜，王楠楠，黃　錦，楊百萬(wàn)，李　興，王光明

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，云南大理 671000)

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神經(jīng)元特異核蛋白單克隆抗體的構(gòu)建*

王麗紅1，張香娜1，王楠楠1，黃錦1，楊百萬(wàn)1，李興1，王光明2△

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)臨床醫(yī)學(xué)，云南大理 671000；2.大理大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，云南大理 671000)

目的根據(jù)Pubmed報(bào)道的FOX3 cDNA序列，構(gòu)建神經(jīng)元特異核蛋白(Neun)單克隆抗體。方法獲得FOX3 cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，利用pcDNATM3.3-TOPO TA將純化后的PCR產(chǎn)物插入真核表達(dá)載體中，得到FOX3蛋白，然后利用該蛋白免疫小鼠，免疫后小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，篩選后獲得的雜交瘤細(xì)胞小鼠腹腔接種，收獲腹腔積液后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果所獲得的腹腔積液經(jīng)免疫印跡檢測(cè)，在(46～48)×103處顯示兩條帶，免疫熒光檢測(cè)后細(xì)胞核顯示陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)論根據(jù)FOX3 cDNA序列構(gòu)建的抗體與商業(yè)化的抗Neun抗體在免疫熒光和免疫印跡上表現(xiàn)一致，Neun與FOX3為同一基因。

神經(jīng)元特異核蛋白；FOX3；單克隆抗體

在1992年，Mullen等利用大鼠腦組織細(xì)胞核提取物免疫BALB/c小鼠，獲得對(duì)神經(jīng)元特異的單克隆抗體：mAb A60，該抗體識(shí)別所有脊椎動(dòng)物神經(jīng)元特異的核蛋白，把該抗原命名為神經(jīng)元特異核蛋白(neuron-specific nuclear protein，NeuN)，已廣泛用于神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞研究領(lǐng)域以及臨床病理診斷中[1]。

然而，目前市面上的Neun抗體僅僅是Mullen等利用嚙齒類動(dòng)物腦組織蛋白提取物免疫動(dòng)物獲得的，其應(yīng)用僅僅局限于科研領(lǐng)域,并且Neun基因的cDNA序列無(wú)法獲得。2009年Kim等[2]研究發(fā)現(xiàn)認(rèn)為NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3。因此本研究在2014年1月至2015年5月根據(jù)FOX3的序列進(jìn)行FOX3抗體的克隆，經(jīng)研究證實(shí)，F(xiàn)OX3與Neun為同一個(gè)基因，因此達(dá)到Neun抗體的國(guó)產(chǎn)化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料人腦組織來(lái)源于大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心進(jìn)行尸檢的腦組織石蠟標(biāo)本，材料使用獲得本校醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和本院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1tRNA的提取和cDNA的合成，引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

1.2.1.1腦組織cDNA合成切取8片5 μm石蠟包埋組織,按照EASYspin 石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，中國(guó))的說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，按照cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))的說(shuō)明書進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.1.2FOX3引物設(shè)計(jì)根據(jù)pubmed上人FOX3的cDNA序列(NM_001082575.2)，用gene runner軟件設(shè)計(jì)引物，正義鏈：5′-ATG GCC CAG CCC TAC CCC CCC GCC CAG-3′；反義鏈：5′-TCA CAT GGT TCC AAT GCT GTA GGT CGC-3′。

1.2.1.3真核表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增試劑購(gòu)自Invitrogen公司。起始變性95 ℃10 min，循環(huán)95 ℃10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)25次。PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)OMEGA公司(美國(guó))的Gel Extraction kit純化后，利用pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning kit(Invitrogen公司，美國(guó))將純化后的PCR產(chǎn)物插入真核表達(dá)載體中，所獲得的克隆經(jīng)測(cè)序及電泳驗(yàn)證準(zhǔn)確的載體命名為pcDNA-FOX3。

1.2.2重組蛋白FOX3的獲得載體pcDNA-FOX3轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(CRL-1573，北京鈞堯偉業(yè)生物科技有限公司)，有限稀釋，G418篩選，獲得單克隆。大量誘導(dǎo)表達(dá)生產(chǎn)，經(jīng)過(guò)純化，得到蛋白抗原用于免疫小鼠。

1.2.3動(dòng)物免疫及雜交瘤細(xì)胞的獲得

1.2.3.1動(dòng)物免疫將成功獲得的FOX3抗原與氫氧化鋁佐劑制成的混懸液免疫鼠齡為8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，然后分離免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞用于細(xì)胞融合。

1.2.3.2細(xì)胞融合和單抗篩選利用純化的FOX3抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在3只小鼠中免疫反應(yīng)最好的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋，分置于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待克隆生長(zhǎng)到全孔的1/6時(shí)，標(biāo)記單克隆及多克隆，培養(yǎng)10～14 d對(duì)單克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)。ELISA檢測(cè)后將OD值最高的單克隆再有限稀釋接入96孔板中如上法所述再次亞克隆，此過(guò)程重復(fù)數(shù)次，直至陽(yáng)性孔比率為100%，即認(rèn)為此為陽(yáng)性單克隆[3]。將篩選得到的陽(yáng)性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)按(1～2)×106/管進(jìn)行凍存。同時(shí)收集細(xì)胞用于腹水制備。

1.2.4腹腔積液制備和單克隆抗體檢測(cè)

1.2.4.1腹腔積液制備細(xì)胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹腔積液，細(xì)胞接種數(shù)量為5×106。接種10～14 d后收集腹腔積液。腹腔積液經(jīng)Protein G柱純化處理，濃縮后檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4.2免疫熒光染色小鼠的石蠟?zāi)X組織切片脫蠟到水后，0.3%甲醇雙氧水溶液(甲醇∶30%過(guò)氧化氫=9∶1)室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min。3次，然后用非免疫動(dòng)物小鼠的血清1∶50稀釋，孵育30 min，加入接種了雜交瘤細(xì)胞小鼠的腹腔積液稀釋為0.1 ng/mL后，標(biāo)本置于4 ℃過(guò)夜孵育，0.01 mol/L PBS洗滌5 min，3次，加入0.01 mol/L PBS稀釋的Alexa Fluor 594標(biāo)記的二抗(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))按體積比1∶1 000，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min，3次，10%丙三醇封片，熒光顯微鏡觀察，染色結(jié)果與從美國(guó)Millipore公司(美國(guó))購(gòu)買的抗體“鼠抗人神經(jīng)元特異核蛋白免疫組化單克隆抗體，MAB-0578”比較。

1.2.4.3免疫印跡檢測(cè)大鼠、小鼠和人的腦組織用蛋白質(zhì)裂解液(包括封閉液，洗滌液等購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)裂解后離心，按美國(guó)Bio-Rad公司的蛋白濃度測(cè)定試劑盒和上樣緩沖液處理后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后在搖床上用封閉液封閉30 min，接種了雜交瘤細(xì)胞小鼠的腹腔積液稀釋為0.04 ng/mL后4 ℃過(guò)夜孵育，洗滌液洗滌5 min，3次，加入抗體稀釋液稀釋的Alexa Fluor 594標(biāo)記的二抗(1∶2 500)室溫?fù)u床上孵育30 min，洗滌液洗滌5 min，3次，蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)(ChemiDocMP，Bio-Rad公司，美國(guó))檢測(cè)結(jié)果與MAB-0578比較。

2　結(jié)　　果

2.1基因克隆及抗體構(gòu)建基本情況根據(jù)FOX3 cDNA序列設(shè)計(jì)的特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳分析后可見1 200 bp左右的目的條帶，見圖1。PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后插入pcDNATM 3.3-TOPO TA載體中進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取15個(gè)克隆，分離質(zhì)粒，送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Pubmed上發(fā)表的FOX3 cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，得到1個(gè)克隆的序列與FOX3 cDNA序列完全一致，另外有兩個(gè)克隆的序列與FOX3 cDNA序列比對(duì)后，分別出現(xiàn)1個(gè)和2個(gè)無(wú)義突變，其余的12個(gè)克隆均出現(xiàn)突變。

用序列完全正確的克隆轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，G418篩選后經(jīng)PCR和免疫熒光檢測(cè)，能夠被Neun抗體識(shí)別的細(xì)胞克隆擴(kuò)增后分離蛋白，然后用耦聯(lián)有Neun抗體的磁珠進(jìn)行純化，洗脫后濃縮，得到的重組蛋白FOX3進(jìn)行動(dòng)物免疫。免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)融合后，進(jìn)行篩選，得到了12個(gè)克??；該12個(gè)克隆的細(xì)胞擴(kuò)增后對(duì)雌性BALB/c健康小鼠進(jìn)行腹腔接種，10～14 d后收集腹腔積液、純化、濃縮，得到的樣品用于后續(xù)的免疫熒光和免疫印跡。

M：Marker;S：樣本。

圖1FOX3全長(zhǎng)cDNA PCR擴(kuò)增

2.2免疫熒光檢測(cè)結(jié)果上述篩選得到的12個(gè)克隆經(jīng)免疫熒光染色檢測(cè)，有兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的腹腔積液(含單克隆抗體)，其染色結(jié)果與MAB-0578完全一致，見圖2，均主要表現(xiàn)為細(xì)胞核陽(yáng)性，其余克隆表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性，稱為陰性克隆。

A：鼠抗人神經(jīng)元特異核蛋白免疫組化單克隆抗體；B：陰性克隆，細(xì)胞質(zhì)著色；C：陽(yáng)性克隆，主要在細(xì)胞核著色。

圖2免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果(×200)

2.3免疫印跡檢測(cè)結(jié)果經(jīng)免疫熒光篩選，可以識(shí)別大鼠、小鼠和人神經(jīng)組織的神經(jīng)元的產(chǎn)生腹腔積液的兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆，本研究選擇1個(gè)克隆對(duì)大鼠、小鼠和人神經(jīng)組織提取物進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，其結(jié)果與MAB-0578完全一致，見圖3。

A:構(gòu)建的抗體為1抗；B:MAB-0578的抗體為1抗；M:Marker。

圖3腦組織蛋白提取物免疫印跡檢測(cè)

3　討　　論

mAb A60抗體可以識(shí)別所有脊椎動(dòng)物神經(jīng)元特異的核蛋白NeuN，已在神經(jīng)科學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞研究領(lǐng)域以及臨床病理診斷中得到廣泛應(yīng)用[4-5]。但是由于該抗體是通過(guò)腦組織蛋白提取物免疫動(dòng)物獲得的，因此無(wú)法得到該基因的核酸序列，使得依賴于基因核酸序列的相關(guān)研究受到一定的限制。

2009年Kim等[2]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：Fox3陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的蛋白能夠完全被NeuN抗體識(shí)別，另外Fox3的siRNA轉(zhuǎn)染可以抑制NeuN在神經(jīng)干細(xì)胞上的表達(dá)，從而認(rèn)為NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3，但是二者是否完全一致還有待探討[6]。雖然FOX3轉(zhuǎn)染和FOX3沉默均可以用Neun抗體進(jìn)行檢測(cè)并得到了期望的結(jié)果，但是兩者之間還有可能為上下游關(guān)系，也就是說(shuō)存在這樣的情況：基因FOX3的表達(dá)與否可以調(diào)控Neun的表達(dá)。因此為了確定FOX3和Neun為同一個(gè)基因，本研究以FOX3基因的cDNA序列為起點(diǎn)，經(jīng)過(guò)一系列的分子生物學(xué)操作，構(gòu)建FOX3抗體，然后與商業(yè)化的Neun抗體進(jìn)行比較性研究。

抗體的構(gòu)建包括單克隆抗體和多克隆抗體，但是前提必須能夠獲得抗原分子。在本研究中，由于Neun的基因序列未知，無(wú)法獲得Neun抗原分子，因此只能夠根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]： NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3，但是商品化的FOX3抗原仍然無(wú)法獲得，然而Fox3基因的序列可以從pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，并且該cDNA序列預(yù)期編碼的蛋白質(zhì)大小與Neun相似。因此，本研究通過(guò)分子生物學(xué)的方法，把Fox3 cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，插入載體中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)過(guò)篩選等，獲得了抗原，該抗原可以被Neun抗體識(shí)別。然后用FOX3重組蛋白免疫小鼠，得到可以產(chǎn)生FOX3抗體的脾細(xì)胞。為了保留脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力以及獲得無(wú)限增殖的能力，把脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，這樣獲得的雜交瘤細(xì)胞保留了產(chǎn)生抗體的能力和無(wú)限增殖的能力。經(jīng)過(guò)一系列的篩選，初步篩選準(zhǔn)確的雜交瘤細(xì)胞克隆腹腔接種后獲得腹腔積液。利用免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)，本研究所構(gòu)建的單克隆抗體與商品化的抗體一致。

Neun抗原主要分布在神經(jīng)元的細(xì)胞核內(nèi)，而在本研究構(gòu)建的克隆中，免疫組化染色時(shí)部分克隆表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，認(rèn)定為陰性克隆，只有在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的才確定為陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆在免疫印跡檢測(cè)中，與Mullen等的報(bào)道的結(jié)果一致：有(46～48)×103兩條帶，因此可以確定由FOX3基因的cDNA序列構(gòu)建的抗體與商品化的Neun抗體為同一抗體，也就是說(shuō)Neun與FOX3基因?yàn)橥换??；騈eun(或者FOX3)在各種神經(jīng)腫瘤中的表達(dá)特性預(yù)示著該抗體可以在病理診斷中發(fā)揮作用[6-8]，但是本研究構(gòu)建的抗體經(jīng)過(guò)一系列的檢測(cè)才能夠在臨床病理診斷中應(yīng)用。另外，文獻(xiàn)介紹Neun在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化、神經(jīng)元的功能等方面具有重要作用[9-11]。通過(guò)本研究，確定了Neun基因與FOX3基因?yàn)橥粋€(gè)基因，為后續(xù)的研究提供了相關(guān)的信息。在引起神經(jīng)元死亡的缺血性中風(fēng)中，NeuN作為判斷神經(jīng)元是否“健康”以及治療后療效檢測(cè)的指標(biāo)[12]。對(duì)缺血90 min然后再灌流小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間的灌流，在TTC染色還未能夠檢測(cè)到皮質(zhì)損傷時(shí)，NeuN的表達(dá)就已經(jīng)發(fā)生改變[13-14]。甲氟磷酸異己酯或氰戊菊酯(一種神經(jīng)毒劑)暴露，神經(jīng)元上NeuN的表達(dá)也發(fā)生改變[15]。因此需要通過(guò)大量的研究以闡明Neun在神經(jīng)元的發(fā)育等方面的功能。

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Construction of the monoclonal antibody of neuron-specific nuclear protein*

WangLihong1,ZhangXiangna1,WangNannan1,HuangJin1,YangBaiwan1,LiXing1,WangGuangming2△

(1.Grade2012，ClinicalMedicineofClinicalCollege,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China；2.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China)

ObjectiveTo construct the monoclonal antibody of anti-Neun basis on the sequence of FOX3 cDNA published on Pubmed.MethodsThe specific primers were designed basis on the sequence of FOX3 cDNA which was amplified with RT-PCR,then the PCR product was inserted into pcDNATM3.3-TOPO TA to get the eukaryotic expression vector FOX3.The splenocyte from mice which were immunized with the protein of FOX3 was merged with SP2/0 cell line to gain hybridoma cell.The hybridoma cell was transplanted into the abdominal cavity of mice and the abdominal dropsy through selecting was collected and used into immunofluorescence staining and immunoblotting.ResultsThere were two specific bands from (46-48)×103through immunoblotting and positive cells through immunofluorescence staining.ConclusionThe antibody anti-Neun from the FOX3 cDNA sequence was showed the same information from the commercialized Neun antibody,through checking with immunofluorescence staining and immunoblotting.The gene Neun was as same as to gene FOX3.

neuron-specific nuclear protein;FOX3;monoclonal antibody

·技術(shù)與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.027

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360206)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金(2014HB025)；云南省創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃建設(shè)項(xiàng)目(S-CXCY-2014-6)；大理學(xué)院博士科研基金資助項(xiàng)目(KYBS201207)。作者簡(jiǎn)介：王麗紅(1993-)，本科，主要從事神經(jīng)生物學(xué)的研究?！?/p>

，Tel：18313159589；Email：gmwang1991@hotmail.com。

R737.3； R361.3

A

1671-8348(2016)24-3393-03

2016-02-17

2016-04-29)