唐翠萍，吳　陽，周寒靜，張　濤△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.腫瘤科；2.心血管內(nèi)科　400016)

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康萊特注射液聯(lián)合紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的化療增效作用*

唐翠萍1，吳陽2，周寒靜1，張濤1△

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.腫瘤科；2.心血管內(nèi)科400016)

目的探討康萊特注射液(KLT)對(duì)紫杉醇(PTX)抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的增效作用及其相關(guān)機(jī)制。方法本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、Transwell法檢測(cè)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲能力，實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR、Western blot 分別檢測(cè)C-myc、CyclinD1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA和蛋白水平變化。結(jié)果PTX單藥能有效抑制人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲能力，降低C-myc、CyclinD1 和VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；KLT呈濃度依賴地增強(qiáng)PTX的作用，與PTX單獨(dú)用藥比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論KLT具有增強(qiáng)PTX抗乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的作用，此作用可能與下調(diào)C-myc、CyclinD1和VEGF的表達(dá)相關(guān)。

康萊特注射液；紫杉醇；乳腺腫瘤；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，已成為女性癌癥相關(guān)死亡的重要原因[1-2]。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是乳腺癌術(shù)后常用的輔助化療藥物，但因毒副作用大，使得部分患者難以耐受，同時(shí)有部分患者對(duì)其耐藥，使其療效局限，遠(yuǎn)期生存率未見明顯提高?？等R特注射液(Kanglaite injection,KLT)是從傳統(tǒng)中藥薏苡仁中提取的抗腫瘤細(xì)胞活性物質(zhì)，其注射液主要成分為注射用薏苡仁油，該藥同化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可提高一些腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，減少化療過程中的毒副反應(yīng)，其聯(lián)合用藥在肺癌的治療中已取得顯著進(jìn)展[3-4]，但在乳腺癌治療中的應(yīng)用，目前國內(nèi)外尚未見大量報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法、Transwell小室侵襲等方法，研究KLT聯(lián)合PTX對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的化療增效作用，并探討KLT能否增強(qiáng)PTX對(duì)人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖及侵襲能力的抑制作用，為進(jìn)一步尋找增強(qiáng)乳腺癌化療效果的治療方案提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料。

1　材料與方法

1.1主要材料及儀器人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞生物研究所)。紫杉醇注射液(四川太極制藥)，康萊特注射液(浙江康萊特藥業(yè))，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG(中杉金橋公司)，胰酶及DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司，中國)，紫外分光光度計(jì)(GE公司，美國)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)儀(Viagene公司，美國)，PCR擴(kuò)增儀(深圳黑馬公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)，Transwell小室(Millipore公司，美國)，倒置顯微鏡及正置顯微鏡(尼康公司，日本)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱中傳代培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，各設(shè)置A、B、C、D、E、F、G 7組，其中A組為對(duì)照組，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，B組為KLT(20 μg/mL)單藥組，C組為PTX(10 μg/mL)單藥組，D、E、F、G 各組在PTX(10 μg/mL)的基礎(chǔ)上，分別加入濃度為5、10、20、40 μL/mL的KLT，H組為KLT(10 μg/mL)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度為6×103個(gè)/孔，接種于96孔板，每孔200 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)5個(gè)空白對(duì)照孔(即調(diào)零孔，只加培養(yǎng)基而不加細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入含有各藥物的培養(yǎng)基200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入含20 μL MTT培養(yǎng)液200 μL培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解液，水平搖床震蕩10 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度值(A)值，以空白對(duì)照孔調(diào)零，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率(IR)，IR=[(1-實(shí)驗(yàn)組A570)/對(duì)照組A570]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1　　引物序列

GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

1.2.3Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)分組同1.2.2，各組細(xì)胞換用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，調(diào)整細(xì)胞濃度每毫升為2× 105個(gè)，每個(gè)侵襲小室預(yù)包被基質(zhì)膠，上室加入200 μL無血清細(xì)胞懸液(24孔板)，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，經(jīng)PBS漂洗后，取出小室，酶標(biāo)儀上測(cè)A570值，間接反映細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算各組IR。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。IR=[(1-實(shí)驗(yàn)組A570)/對(duì)照組A570]×100%。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測(cè)細(xì)胞C-myc、CyclinD1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)分4組，即對(duì)照組：加入等量PBS；KLT單藥組：根據(jù)1.2.2及1.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取KLT 10 μL/mL；PTX單獨(dú)給藥組：加入PTX 10 μg/mL；聯(lián)合用藥組：10 μg/mL PTX+10 μL/mL KLT。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 3× 105個(gè)/孔并接種于96孔板中，每孔加入培養(yǎng)基2 mL，過夜培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給藥。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%左右時(shí)，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，qRT-PCR法測(cè)定C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA水平。引物序列見表1。PCR反應(yīng)在BIO-RAD儀器內(nèi)進(jìn)行。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞C-myc、CyclinD1、VEGF蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4，經(jīng)分組給藥后培養(yǎng)48 h，常規(guī)提取總蛋白。二喹啉甲酸法(BCA法)測(cè)定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，100 ℃金屬浴加熱5 min，每孔加入40 μg蛋白，10% SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h，加C-myc、CyclinD1、VEGF一抗(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗置室溫下孵育2 h。ECL顯影。

2　結(jié)　　果

2.1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響MTT法結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞，D、E、F、G各組抑制率分別增加29.83%、63.86%、67.11%及72.39%；在MDA-MB-231細(xì)胞，其抑制率分別增加27.52%、51.82%、62.89%、69.85%。結(jié)果表明，KLT呈濃度依賴性的增強(qiáng)PTX對(duì)乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用。MCF-7和MDA-MB-231藥物作用48 h后抑制率見圖1。

2.2對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響與對(duì)照組相比，各處理組MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力均明顯抑制，其A值均明顯降低(P<0.05)。在MCF-7細(xì)胞，聯(lián)合用藥組抑制率分別增加90.76%、176.29%、229.74%及256.82%；在MDA-MB-231細(xì)胞，其抑制率分別增加100.64%、203.32%、242.82%及274.39%。各組A570值抑制率見表2?？等R特能增強(qiáng)PTX對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的抑制作用，且增強(qiáng)效應(yīng)與KLT濃度密切相關(guān)。根據(jù)2.1及2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，D、E、F、G組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，故選取E組進(jìn)行后續(xù)研究。

*:P<0.05，與C組比較。

圖1　　各組乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與C組比較；-：無數(shù)據(jù)。

2.3對(duì)乳腺癌細(xì)胞C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果(圖2)顯示：C組，C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA的表達(dá)在MCF-7細(xì)胞分別下調(diào)了85.32%，54.29%及92.68%，在MDA-MA-231細(xì)胞，分別下調(diào)了66.36%、62.04%及56.31%；E組，各組mRNA表達(dá)分別下調(diào)了47.30%、54.41%、41.38%、34.15%、38.46%、41.10%。KLT和PTX均能抑制乳腺癌細(xì)胞C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA的表達(dá)，且KLT明顯增強(qiáng)PTX的此作用。

a：P<0.05，與A組相比；b：P<0.05，與C組相比。

圖2各組對(duì)乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA表達(dá)的影響

A、C：乳腺癌MCF-7細(xì)胞，各蛋白水平變化；B、D：MDA-MB-231細(xì)胞，各蛋白水平變化；a：P<0.05，與A組相比；b：P<0.05，與C組相比。

圖3各組對(duì)乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、VEGF 蛋白水平表達(dá)的影響

2.4對(duì)乳腺癌細(xì)胞C-myc、CyclinD1、VEGF蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果(圖3)顯示：PTX能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞C-myc、CyclinD1、VEGF 蛋白的表達(dá)，在MCF-7(圖3A、C)及MDA-MA-231(圖3B、D)細(xì)胞中，各蛋白的表達(dá)均下調(diào)；E組與C組相比：各蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3　討　　論

Wnt/β-catenin相關(guān)信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、代謝及干細(xì)胞的維持中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，在多種腫瘤細(xì)胞中異常激活，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等。研究發(fā)現(xiàn)，C-myc、CyclinD1、VEGF為Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮其調(diào)控細(xì)胞活力、增殖、遷移、侵襲、血管形成及形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵下游因子[5-7]，其過表達(dá)與Wnt/β-catenint信號(hào)通路異常激活有關(guān)。C-myc及CyclinD1作為原癌基因，參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期，并與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；而VEGF是一種高特異性的血管內(nèi)皮分裂素，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、分化及誘導(dǎo)血管發(fā)生的作用，其與惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有重要關(guān)聯(lián)。因此，C-myc、CyclinD1及VEGF可能是抗腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的重要靶點(diǎn)[8-9]。PTX為紅豆杉屬植物中結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一種次生代謝產(chǎn)物，目前廣泛應(yīng)用于乳腺癌的輔助治療和挽救治療[10]，其抗腫瘤作用除與其作用于細(xì)胞周期有關(guān)外，還與細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如抑制核因子-κB(NF-κB)/κB-a 及Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT、Transwell法觀察PTX對(duì)其增殖、侵襲的影響，結(jié)果顯示PTX能顯著抑制MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、侵襲能力。qRT-PCR和Western blot 結(jié)果顯示，PTX能明顯降低乳腺癌細(xì)胞中C-myc、CyclinD1、VEGF的表達(dá)，提示PTX抗乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的能力可能與作用于Wnt/β-catenin相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，PTX耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重[13]，為此，尋求新的聯(lián)合用藥方案，提高乳腺癌療效，越來越受到重視。KLT是中藥薏苡仁中提取的活性成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和提高機(jī)體免疫能力等作用[14]，能較強(qiáng)地抑制和殺傷多種腫瘤細(xì)胞，除作用于細(xì)胞周期外，還可活化一些促凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其作為一種高效的輔助藥能增強(qiáng)多種化療藥的抗腫瘤作用，包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管形成，調(diào)控腫瘤耐藥基因和信號(hào)通路[15]。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究了KLT對(duì)PTX抗乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的增效作用。結(jié)果顯示，不同濃度的KLT聯(lián)合PTX作用48 h后，細(xì)胞增殖侵襲能力與PTX單獨(dú)給藥組相比抑制率明顯增加，在KLT濃度小于10 μL/mL時(shí)，其抑制效果與KLT濃度呈正相關(guān)，KLT濃度大于10 μL/mL時(shí)，其抑制效率未見明顯增加。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，KLT能明顯增強(qiáng)PTX對(duì)乳腺癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因C-myc、CyclinD1、VEGF mRNA和蛋白水平的下調(diào)作用。

目前乳腺癌治療仍采用以外科手術(shù)為主的包括化療、放療、分子靶向治療及內(nèi)分泌治療的綜合治療模式，但效果不甚理想。包括KLT在內(nèi)的多種中藥被證實(shí)具有增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物敏感性的功能，從而使化療藥更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KLT與化療藥物PTX聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)PTX抗乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的能力，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中C-myc、CyclinD1、VEGF的表達(dá)相關(guān)。但本研究?jī)H檢測(cè)了用藥前后C-myc、CyclinD1、VEGF的表達(dá)，對(duì)其信號(hào)通路的深入研究可通過阻斷劑進(jìn)一步阻滯Wnt/β-catenin信號(hào)通路來觀察KLT聯(lián)合PTX對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及C-myc、CyclinD1、VEGF表達(dá)的變化情況。

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The chemosensitization effect of Kanglaite injection combined with Paclitaxel in human breast cancer cells*

TangCuiping1,WuYang2,ZhouHanjing1,ZhangTao1△

(1.DepartmentofOncology;2.DepartmentofCardiovascular,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo explore the anti-proliferation and anti-invasion effects of Kanglaite injection(KLT) in combination with Paclitaxel(PTX) on human breast cancer cell and to investigate the mechanism of the chemosensitization effect.MethodsMTT and Transwell assays were used to detect the inhibitory rate of proliferation and invasion of MCF-7 and MDA-MB-231 cells,qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of C-myc,CyclinD1,VEGF mRNA and their protein levels.ResultsThe study showed that treatment with PTX alone could significantly inhibit the proliferation and invasion of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines,lower the expression of C-myc,CyclinD1 and VEGF in both mRNA and protein levels,compared with the control group (P<0.05);KLT dramatically strengthened the effect of PTX in a concentration-dependent manner,compared with PTX alone (P<0.05).ConclusionThe result shows that KLT could enhance the anti-proliferation and anit-invasion effects of PTX on human breast cancer cells,which could have relationship with down-regulating the expression of C-myc,CyclinD1 and VEGF.

Kanglaite injection;Paclitaxel;breast neoplasms;cell proliferation;neoplasm invasivenss

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.008

國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目[國衛(wèi)辦醫(yī)函(2013)544號(hào)]；重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(cstc2012jjA10138)。作者簡(jiǎn)介：唐翠萍(1991-)，在讀碩士，主要從事腫瘤綜合治療方面的研究?！?/p>

,Tel:13708311156；E-mail:tumorzzt@163.com。

R730.53

A

1671-8348(2016)24-3336-04

2016-02-18

2016-06-27)