陸　齊，顧青青#，張　劍，徐海霞，沈　靂

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇南通 226001;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032)

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姜黃素納米粒促進(jìn)藥物支架植入后內(nèi)皮功能恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究*

陸齊1，顧青青1#，張劍1，徐海霞1，沈靂2△

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇南通 226001;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032)

目的探討姜黃素納米粒在促進(jìn)藥物支架植入后內(nèi)皮功能恢復(fù)的可行性。方法雷帕霉素支架植入后以每周2次的頻率靜脈注射姜黃素納米粒，于4周后評(píng)價(jià)內(nèi)皮功能。結(jié)果4周后聯(lián)用姜黃素納米粒的支架組內(nèi)皮功能明顯優(yōu)于不使用姜黃素納米粒的支架組。結(jié)論姜黃素納米粒可顯著提高支架植入后內(nèi)皮功能的恢復(fù)速度，有望降低藥物支架不良事件的發(fā)生率。

姜黃素；納米粒；支架；內(nèi)皮

姜黃素為姜科植物的根莖中提取的多酚類二酮化合物。近年來研究表明，姜黃素具有顯著的抑制平滑肌細(xì)胞增殖、抗血栓、抗炎、抗氧化、降血脂等功效[1-3]，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的心血管候選藥物。但口服姜黃素存在嚴(yán)重的肝首過效應(yīng)，因此系統(tǒng)生物利用度極低(<1%)[4]，難以充分發(fā)揮其生物活性。注射給藥是提高姜黃素藥效的主要措施，但姜黃素幾乎不溶于水，且極易被肝臟代謝，即使采用常規(guī)增溶技術(shù)制成注射劑仍然難以保持有效的血藥濃度[5-6]。

本研究以具有良好的生物相容性的可降解高分子甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物為載體材料，采用納米乳化技術(shù)成功制備了姜黃素納米粒。該納米粒在血液中具有較高的穩(wěn)定性，可維持較長時(shí)間姜黃素的緩釋。支架植入后注射姜黃素納米?？捎行Т龠M(jìn)支架部位內(nèi)皮功能的恢復(fù)，有望提高藥物支架使用的安全性。

1　材料與方法

1.1材料姜黃素，純度大于99%，美國Sigma公司；甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(mPEG5000-PLA17000)由本實(shí)驗(yàn)室自制，相對(duì)分子質(zhì)量為5 000～17 000，相對(duì)分子質(zhì)量分布系數(shù)PDI=1.6；吐溫80，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雷帕霉素洗脫支架(SES)由北京美中雙合醫(yī)療器械有限公司提供，規(guī)格3 mm×17 mm，含雷帕霉素150 μg，涂層材料為可降解高分子聚乳酸。

1.2方法

1.2.1姜黃素納米粒的制備按質(zhì)量比1∶5稱取姜黃素和mPEG5000-PLA17000，用二氯甲烷溶解制成溶液，吐溫80用超純水溶解后配置成0.2%溶液。均質(zhì)器中以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌吐溫80水溶液，勻速滴加含有高分子和姜黃素的二氯甲烷溶液，滴加完成后繼續(xù)攪拌乳化5 min。乳化結(jié)束后，于室溫下緩慢攪拌揮發(fā)溶劑24 h后用450 nm孔徑的PVDF濾膜過濾后凍干得到姜黃素納米粒凍干粉，凍干粉加注射用水復(fù)溶后動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定納米粒粒徑分布，高效液相色譜測(cè)定載藥量和藥物包封率。

1.2.2大鼠藥代動(dòng)力學(xué)6只雄性SD大鼠分成兩組，每組3只。分別經(jīng)尾靜脈給予溶劑型姜黃素(DMSO溶液，10 mg/mL)和姜黃素納米粒懸浮液(2 mg/mL)，給藥劑量為25 mg/kg。于不同時(shí)間點(diǎn)眼窩采血后3 000 r/min 離心后取上清用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法在425 nm處測(cè)定姜黃素血漿濃度(檢測(cè)限為1 ng/mL)，繪制藥時(shí)曲線。

1.2.3支架植入健康小型豬共9只，體質(zhì)量25～30 kg，將雷帕霉素洗脫支架隨機(jī)植入小型豬的左前降支、回旋支和(或)右冠狀動(dòng)脈，選擇無明顯迂曲、血管直徑符合要求的血管段，在每只豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)隨機(jī)植入2～3枚支架(視符合植入條件的血管數(shù)而定)，共25枚支架。植入完畢后將動(dòng)物分為3個(gè)組，每組3只動(dòng)物：(1)雷帕霉素支架組(共8枚支架，A組)；(2)雷帕霉素支架+2.5 mg/kg姜黃素納米粒(SES+2.5 mg/kg姜黃素，共8枚支架，B組)，(3)雷帕霉素支架+10 mg/kg姜黃素納米粒(SES+10.0 mg/kg姜黃素，共9枚支架，C組)。姜黃素納米粒給藥方式為靜脈注射，每周2次。

1.2.4內(nèi)皮功能評(píng)價(jià)支架植入前和植入4周時(shí)經(jīng)導(dǎo)管于冠狀動(dòng)脈開口處注射乙酰膽堿60 μg，每次注射前后做冠狀動(dòng)脈造影比較用藥前后的支架外遠(yuǎn)段血管(5 mm)的收縮率變化[通過計(jì)算機(jī)定量分析系統(tǒng)(QCA)計(jì)算]。然后處死動(dòng)物并取出支架段血管，剪開支架并用掃描電鏡觀察支架表面內(nèi)皮化情況。

2　結(jié)　　果

2.1姜黃素納米粒的制備姜黃素納米粒凍干粉加入注射用水即可快速復(fù)溶，形成帶有明顯乳光的黃色液體，見圖1，動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定納米粒的平均粒徑為98 nm，見圖2，粒徑分布系數(shù)為0.24。高效液相色譜測(cè)定載藥量為17%，藥物包封率在95%以上。

圖1　　姜黃素納米粒凍干粉、復(fù)溶后溶液外觀

圖2　　動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定粒徑分布

2.2大鼠藥代實(shí)驗(yàn)相同注射劑量下，姜黃素溶液組4 h后血藥濃度已降為3.8 ng/mL，5 h血藥濃度已經(jīng)低于儀器檢測(cè)限(1 ng/mL)，表現(xiàn)出非?？斓捏w內(nèi)代謝速度；而姜黃素納米粒組10 h后血藥濃度依然保持在100 ng/mL以上，藥物半衰期顯著延長，見圖3。

圖3　姜黃素溶液和姜黃素納米粒血藥濃度-時(shí)間變化曲線

2.3內(nèi)皮功能評(píng)價(jià)3組支架4周時(shí)支架表面內(nèi)皮化情況如圖4所示。從圖上可以看出，4周時(shí)支架表面均被內(nèi)皮細(xì)胞完全覆蓋，但B、C組支架表面內(nèi)皮細(xì)胞排列更緊密，細(xì)胞從外形看更為鋪展，細(xì)胞輪廓也更為清晰，顯示其成熟度較高。

在支架植入前，血管的收縮率大約在15%～20%，SES支架植入4周時(shí)，支架遠(yuǎn)段血管收縮率達(dá)到了40%左右，明顯高于支架植入前(P<0.05)，說明雷帕霉素支架的植入會(huì)顯著影響內(nèi)皮的功能。在雷帕霉素支架植入后配合靜脈注射姜黃素納米粒，結(jié)果顯示B、C組遠(yuǎn)段血管的收縮率均在20%左右，明顯低于A組(P<0.05)，但B、C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖4　　支架內(nèi)皮掃描電鏡(×300)

a:P<0.05，與同組支架植入前比較；b:P<0.05，與支架植入4周時(shí)A組比較。

圖5植入4周后支架遠(yuǎn)段血管收縮率(60 μg乙酰膽堿)

3　討　　論

作為一種天然的多酚類物質(zhì)，姜黃素已在大量的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎、抗氧化、降血脂、抗血栓等特殊功效，而且其本身對(duì)人體無毒無害，因此被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的心血管候選藥物。但姜黃素一直不能真正成為藥物主要面臨的問題是其極低的水溶性及快速的體內(nèi)代謝速度，由此造成其生物利用度不到1%。采用高分子納米技術(shù)可從根本上解決上述兩個(gè)問題。本研究中采用具有良好生物相容性和可降解性的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物為載體高分子，通過納米乳化技術(shù)制備的姜黃素納米粒。該方法具有制備方法工藝簡單、工藝的可重復(fù)性好、藥物包封率高等優(yōu)點(diǎn)。該納米粒載藥量在15%以上，藥物的包封率在95%以上，姜黃素的溶解度可達(dá)到5 mg/mL以上，完全可滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求。

本研究中的高分子聚合物mPEG-PLA兩嵌段的相對(duì)分子質(zhì)量為5000～17000，由于疏水鏈相對(duì)分子質(zhì)量較大，在形成納米粒以后疏水鏈之間形成牢固的纏繞，從而使納米粒在體內(nèi)表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性。大鼠藥代實(shí)驗(yàn)表明姜黃素納米粒能顯著降低姜黃素在體內(nèi)的清除速度，顯著提高了血藥濃度并延長藥物的半衰期。納米粒的藥時(shí)曲線下面積(AUC)較姜黃素的DMSO溶液提高了10倍以上，從而使姜黃素的生物利用度大大提高。關(guān)于姜黃素納米粒如何通過血液循環(huán)達(dá)到支架部位并持續(xù)釋放攜帶藥物發(fā)揮生物活性的機(jī)制，本研究認(rèn)為和腫瘤的增強(qiáng)滲透效應(yīng)(enhancedpermeabilityandretentioneffect，EPR效應(yīng))類似。由于腫瘤部位血管生長迅速，外

膜細(xì)胞缺乏，基底膜變形，淋巴管道匯流系統(tǒng)缺損，大量血管滲透性調(diào)節(jié)劑(緩激肽、血管內(nèi)皮生長因子、一氧化氮、前列腺素和基質(zhì)金屬蛋白酶等)生成。這些生理特征有利于迅速增長的腫瘤組織獲取大量營養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，這也導(dǎo)致了腫瘤血管滲透性的增加[7]。因此，一般粒徑在10～500納米范圍內(nèi)的納米粒子對(duì)腫瘤內(nèi)皮具有較強(qiáng)的選擇滲透性。在支架擴(kuò)張過程中內(nèi)皮遭到損傷，由此大大提高了納米粒子對(duì)支架部位內(nèi)皮的選擇滲透能力。本研究中制備的姜黃素納米粒的平均粒徑在98 nm，正好符合這一機(jī)制。在姜黃素納米粒子滲透進(jìn)入支架血管壁后，藥物隨著高分子的降解緩慢釋放，持續(xù)發(fā)揮生物活性。因此，本研究中雖然姜黃素的用藥頻率僅僅為每周2次，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果依然體現(xiàn)了明顯的藥效，這很可能和藥物的長時(shí)間緩釋有關(guān)。

[1]Aggarwal BB,Harikumar KB.Potential therapeutic effects of curcumin,the anti-inflammatory agent,against neurodegenerative,cardiovascular,pulmonary,metabolic,autoimmune and neoplastic diseases[J].Int J Biochem Cell Biol,2009,41(1):40-59.

[2]任玲，王進(jìn)，唐家駒，等．含姜黃素的(丙交酯-乙交酯)共聚物薄膜對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響[J]．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2008，25(4)：874-878．

[3]唐家駒，王進(jìn)，潘長江，等．姜黃素/聚乳酸-乙醇酸共聚物復(fù)合薄膜的制備及抗凝血研究[J]．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2008，25(1)：113-116．

[4]Anand P,Kunnumakkara AB,Newman RA.Bioavailability of curcumin:problems and promises[J].Mol Pharm,2007,4(6):807-818.

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Experimental study on the effect of curcumin nanoparticles on endothelial function recovery after drug-eluting stent implantation*

LuQi1，GuQingqing1#,ZhangJian1，XuHaixia1，ShenLi2△

(1.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity，Nantong，Jiangsu226001，China；2.DepartmentofCardiology,ZhongshanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity，Shanghai200032,China)

ObjectiveTo investigate the feasibility of the effect of curcumin nanoparticles on endothelial function recovery after drug-eluting stent implantation.MethodsCurcumin nanoparticles were administrated intravenously after stent implantation twice a week and endothelium function was evaluated after 4 weeks.Results4 weeks later,the endothelial function of the stent group with the use of curcumin nanoparticles was significantly better than that of the stent group without the use of curcumin nanoparticles.ConclusionThe recovery rate of endothelial function after stent implantation can be significantly improved by using curcumin,which is expected to reduce the incidence of adverse events of drug stent.

curcumin;nanoparticle;stent;endothelium

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.007

2015年南通市科技局民生示范推廣項(xiàng)目(MS32015030)。作者簡介：陸齊(1973-),博士,副主任醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科工作。#共同第一作者：顧青青(1982-)，博士，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科方面的研究?！?/p>

，E-mail:nt_sunny@163.com。

R318.08

A

1671-8348(2016)24-3334-02

2016-03-05

2016-05-11)