夏　瑋,　沈艷紅,　付　迪,　張文清,　宛燕飛,　張　力

(1.華東理工大學(xué)上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237; 2.成都利爾藥業(yè)有限公司,成都 610083)

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核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽

夏瑋1,沈艷紅1,付迪1,張文清1,宛燕飛2,張力2

(1.華東理工大學(xué)上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237; 2.成都利爾藥業(yè)有限公司,成都 610083)

建立了核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽的方法,選擇異頭氫區(qū)(δ4.89～5.90)作為“指紋”鑒定區(qū),以甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品氫譜為參照?qǐng)D譜,將鑒定的樣品譜圖與其比較,采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的相似度,并對(duì)該方法的特異性、重復(fù)性及精密度進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)鑒定,9個(gè)不同批次的甘露聚糖肽樣品的鑒定結(jié)果均與標(biāo)準(zhǔn)圖譜一致,相似度均大于0.95,該方法具有很好的專屬性。核磁共振氫譜法用于甘露聚糖肽的定性鑒定,具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

核磁共振氫譜法; 甘露聚糖肽; 定性鑒定

甘露聚糖肽是中國首創(chuàng)的一種新型免疫促進(jìn)劑,原名多抗甲素(Polyactin A,PAA),是從健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號(hào)菌株經(jīng)深層培養(yǎng)、發(fā)酵提取而得到的一種糖肽類物質(zhì),具有抗血小板聚集、抗病毒、抗菌和抗呼吸系統(tǒng)感染等多種生物活性[1],臨床上被廣泛用于惡性腫瘤的輔助治療、白細(xì)胞減少癥和呼吸道反復(fù)感染等領(lǐng)域[2-4]。

核磁共振氫譜法是多糖組成和重復(fù)單元結(jié)構(gòu)鑒定的有效方法,在分析過程中無需對(duì)多糖進(jìn)行降解或者衍生,能分析不同多糖結(jié)構(gòu)之間的細(xì)微差異,也能顯現(xiàn)少量內(nèi)源性和外源性的污染物[5-6]。目前,核磁共振氫譜法被美國藥典[7]、歐洲藥典[8]、英國藥典[9]和中國藥典2010版[10]收錄,是歐洲藥典和WHO(World Health Organization)推薦的多糖質(zhì)量控制方法[11]。文獻(xiàn)[12]曾報(bào)道采用核磁共振氫譜法,選擇異頭氫區(qū)域定性鑒別細(xì)菌多糖,特異性和重現(xiàn)性都優(yōu)于之前使用的比色法,同時(shí)也適用于其他多糖試劑。

目前,甘露聚糖肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用化學(xué)顯色方法、紅外光譜法對(duì)其進(jìn)行鑒別,但這些鑒別方法專屬性均不強(qiáng),因此需建立一種專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的鑒別方法,以用于甘露聚糖肽的質(zhì)量控制。本文擬采用核磁共振氫譜法對(duì)甘露聚糖肽進(jìn)行定性鑒定,為其質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與儀器

甘露聚糖肽對(duì)照品(批號(hào):140652-200401,中國藥品生物制品檢驗(yàn)所),TSP (Trimethylsilyl-propionic)(氘代度98%,美國Sigma公司),重水(氘代度99.8%,北京希凱創(chuàng)新科技有限公司),甘露聚糖肽供試品(批號(hào):140401,140501,140502,131101,131102,110901,G100102,091202,成都利爾藥業(yè)有限公司),板藍(lán)根糖肽(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司),云芝糖肽(南京森貝伽生物科技有限公司),臘梅花多糖(實(shí)驗(yàn)室提取),葡甘露聚糖(純度>99%,西安瑞盈生物科技有限公司),半乳甘露聚糖(純度>99%,西安大豐收生物科技有限公司)。

DD2400-MR核磁共振儀(安捷倫科技有限公司),METTLER AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1溶液的配制

2.1.1TSP重水溶液的配制準(zhǔn)確稱取10 mg 氘代TSP(3-三甲基硅基丙酸鈉),溶于5 mL D2O中,配成2 g/L的TSP重水溶液。

2.1.2樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取甘露聚糖肽對(duì)照品及供試樣品各30 mg,加入0.5 mL 的D2O,超聲至完全溶解,加入10 μL 2 g/L的TSP重水溶液,超聲混合均勻,轉(zhuǎn)移至5 mm的核磁樣品管中。

2.2NMR測(cè)試條件

1H-NMR的共振頻率為400 MHz,采樣參數(shù)如下:脈沖序列(seqfil) s2pul,掃描次數(shù)(ct) 64,空掃次數(shù)(ss) 0,譜寬(sw) 8 012.8 Hz,脈沖角度(pw) 45,采樣時(shí)間(at) 2.556 s,接收增益(gain) 10,測(cè)試溫度(temp) 30 ℃,弛豫延遲時(shí)間(d1) 1.0 s,窗函數(shù)線寬因子(lb) 0 Hz。

2.3核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽

參照細(xì)菌多糖核磁鑒定方法[12],測(cè)定甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜,將特征鑒別區(qū)譜圖峰型和峰位移值與甘露聚糖肽對(duì)照品譜圖進(jìn)行比對(duì),譜圖相似度的測(cè)定采用相關(guān)系數(shù)法[13],采用Microsoft EXCEL軟件來分析所選定光譜區(qū)的數(shù)據(jù),將供試品譜圖的Y軸坐標(biāo)與對(duì)照品圖譜的Y軸坐標(biāo)進(jìn)行比較,計(jì)算相關(guān)系數(shù)r,如果r>0.95,認(rèn)為兩者結(jié)構(gòu)一致; 反之,則認(rèn)為是未知樣品。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1特異性分別按2.1節(jié)中的樣品溶液制備方法及2.2節(jié)中的核磁條件測(cè)定葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖以及市售的其他種類多糖及糖肽類物質(zhì)(板藍(lán)根糖肽、云芝糖肽、臘梅花多糖),與甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)譜圖的峰型和譜峰位移值比對(duì),并計(jì)算相似度,評(píng)價(jià)該方法的特異性。

2.4.2重復(fù)性對(duì)同一批次的甘露聚糖肽供試品,按2.1節(jié)中的樣品溶液制備方法平行制備三份溶液,按2.2節(jié)中的核磁測(cè)定條件測(cè)試,與甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)譜圖的峰型和譜峰位移值比對(duì),并計(jì)算相似度,評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

2.4.3精密度在不同日期的同一時(shí)間,在2.2節(jié)中的核磁測(cè)試條件下,對(duì)同一甘露聚糖肽供試品進(jìn)行測(cè)試,與甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)譜圖的峰型和譜峰位移值比對(duì),并計(jì)算相似度,評(píng)價(jià)該方法的精密度。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1鑒定區(qū)域的選擇

甘露聚糖肽主要由甘露糖組成,還含有少量葡萄糖及氨基酸(4%～6%)。糖鏈主鏈由1,6-甘露糖殘基構(gòu)成,支鏈由1,2-,1,3-和末端連接的甘露糖殘基構(gòu)成,在1,2,6-甘露糖殘基的O-2位形成分支點(diǎn)。圖1示出了30 ℃時(shí)甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR圖譜,譜圖信號(hào)主要集中在δ3.20～5.80之間,分為兩個(gè)區(qū)域:(1) 異頭氫區(qū),δ5.80～4.40;(2) 環(huán)質(zhì)子區(qū),δ4.40～3.20。根據(jù)參考文獻(xiàn)[14],可將大部分信號(hào)進(jìn)行歸屬,其中,δ:5.29,5.14,5.12,5.08,5.04,4.90分別為1,2-、1,3-、1,2,6-、1,2,6-1-和1,6-連接甘露糖殘基的異頭氫信號(hào)。

圖1　甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR譜圖(30 ℃)Fig.1　1H-NMR spectrum of mannatide standard(30 ℃)

從低場(chǎng)至高場(chǎng),甘露聚糖肽1H-NMR譜中每個(gè)信號(hào)均可作為甘露聚糖肽鑒定的數(shù)據(jù)來源,但異頭氫區(qū)信號(hào)與其他信號(hào)相比,重疊干擾少,分辨率高,而且該區(qū)域譜峰化學(xué)位移、峰形與糖鏈重復(fù)單元中不同連接方式糖殘基的異頭質(zhì)子一一對(duì)應(yīng)。因此,選擇異頭氫區(qū)域作為甘露聚糖肽定性鑒定的指紋鑒定區(qū)域。在異頭氫區(qū)右側(cè),HDO峰很高,會(huì)影響鑒定結(jié)果,因此鑒定區(qū)右端(高場(chǎng))選擇不能小于4.89,多糖的異頭氫信號(hào)δ的選擇一般不會(huì)超過5.70,鑒定區(qū)左端(低場(chǎng))界限設(shè)定為5.90。

3.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.2.1定標(biāo)物的選擇理想的定標(biāo)物要求化學(xué)惰性、易溶于溶劑、定標(biāo)物譜圖信號(hào)對(duì)樣品信號(hào)不產(chǎn)生干擾。NMR實(shí)驗(yàn)所用定標(biāo)物一般有TMS(四甲基硅烷)、DSS (3-三甲基硅基丙磺酸鈉鹽)、TSP (3-三甲基硅基丙酸鈉)等[15]。TMS不溶于水,而甘露聚糖肽樣品由于極性較大,易溶于水,必須采用重水作為溶劑,因此可采用DSS或TSP作為定標(biāo)物。但DSS結(jié)構(gòu)中有3個(gè)亞甲基在1H-NMR譜中均有強(qiáng)信號(hào)出現(xiàn),且為多重峰,可能與樣品中的信號(hào)相干擾。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇氘代TSP為定標(biāo)物。

3.2.2測(cè)試溫度的選擇由于甘露聚糖肽中1,6-連接的甘露糖殘基含量很低,其異頭氫信號(hào)(圖2中D峰)很弱。又因其化學(xué)位移與水峰很接近,導(dǎo)致在常溫(25 ℃)下以肩峰形式出現(xiàn)在溶劑峰的左側(cè)。因此,考慮采用升高溫度的方式將溶劑峰移向高場(chǎng),如圖2所示。隨著溫度的升高,溶劑峰移向高場(chǎng),而1,6-連接的甘露糖殘基異頭氫信號(hào)化學(xué)位移改變很小,但溫度升高也對(duì)核磁探頭的壽命有一定影響。當(dāng)溫度升至30 ℃,1,6-連接的糖殘基異頭氫信號(hào)已基本與水峰分離,因此,綜合考慮各因素的影響,將測(cè)定溫度設(shè)為30 ℃。

3.2.3樣品濃度的選擇核磁共振的信號(hào)強(qiáng)度與所測(cè)定物質(zhì)的含量直接相關(guān),質(zhì)量濃度越高,信號(hào)相對(duì)越強(qiáng); 反之,噪聲相對(duì)越強(qiáng)。樣品濃度的選擇要考慮樣品溶液的溶解性、流動(dòng)性和譜圖的信噪比等,要求樣品在達(dá)到良好信噪比的情況下,也具備良好的溶解性及流動(dòng)性。在30 ℃、采樣64次情況下,考察不同濃度的甘露聚糖肽對(duì)照品的δ5.29峰的信噪比(表1)和樣品溶液的均勻性(目測(cè))。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L時(shí),譜圖信噪比良好,繼續(xù)增大濃度會(huì)導(dǎo)致樣品的溶解性和流動(dòng)性較差,增加前處理及勻場(chǎng)的困難,故選擇60 g/L的質(zhì)量濃度作為樣品測(cè)試濃度。

圖2　核磁測(cè)試溫度的考察Fig.2　1H-NMR spectra of mannatide at different temperatures

3.2.4掃描次數(shù)的選擇為保證良好的信噪比,在30 ℃、采樣64次情況下,對(duì)掃描次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,考察掃描8、16、32、64、128次,δ5.29處譜峰信噪比的變化,結(jié)果見表2。綜合考慮儀器的時(shí)間效率、信噪比等因素,將樣品測(cè)定的掃描次數(shù)定為64次。

表1　樣品濃度的考察結(jié)果

表2　掃描次數(shù)對(duì)信噪比的影響

3.2.5弛豫延遲時(shí)間的選擇在30 ℃、采樣64次情況下,考察不同弛豫延遲時(shí)間(1、2、5、10 s)對(duì)δ5.29處峰信噪比的影響,結(jié)果見表3?？梢?弛豫延遲時(shí)間對(duì)δ5.29處譜峰信噪比影響不大,考慮儀器測(cè)試的時(shí)間效率,將弛豫延遲時(shí)間設(shè)定為1 s。

表3　弛豫延遲時(shí)間對(duì)信噪比的影響

3.3甘露聚糖肽的定性鑒定

在上述優(yōu)化條件下,測(cè)定9個(gè)不同批次的甘露聚糖肽樣品(2009～2014年生產(chǎn))的1H-NMR譜(圖3),參照細(xì)菌多糖核磁鑒定方法,選擇圖譜上 (δ4.9～6.0)區(qū)為特征鑒別區(qū),與甘露聚糖肽對(duì)照品核磁譜圖峰型和峰位移值進(jìn)行比對(duì),并采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的相似度,具體計(jì)算方法如下:將對(duì)照品及供試品的1H-NMR譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為ASCII形式的XY數(shù)據(jù)文件(其中X為化學(xué)位移,Y為信號(hào)強(qiáng)度),采用Microsoft EXCEL軟件來分析所選定光譜區(qū)的數(shù)據(jù),將光譜文件的Y軸坐標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的Y軸坐標(biāo)進(jìn)行比較,計(jì)算相關(guān)系數(shù)r。如果計(jì)算所得的樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜峰型和峰位移值一致,并且兩者間相關(guān)系數(shù)大于0.95,則可認(rèn)為鑒定的樣品與對(duì)照樣品結(jié)構(gòu)一致; 反之,測(cè)試樣品與對(duì)照品結(jié)構(gòu)不一致,譜圖相似性結(jié)果如表4。可以看出,9個(gè)不同批次的甘露聚糖肽供試品的核磁譜圖與對(duì)照品譜圖峰型及峰位移值幾乎完全一致,相關(guān)系數(shù)均大于0.96,說明該方法可以定性鑒別甘露聚糖肽樣品。

3.4方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1特異性為了驗(yàn)證方法的專屬性,在相同條件下測(cè)定了與甘露聚糖肽組成類似的葡甘露聚糖及半乳甘露聚糖的核磁譜圖(圖4)。葡甘露聚糖的單糖組成同甘露聚糖肽相似,也是由葡萄糖和甘露糖兩種單糖組成,但連接方式目前認(rèn)為是由葡萄糖和甘露糖通過β-1,4-吡喃糖苷鍵結(jié)合的雜多糖,在主鏈甘露糖C3位上存在著通過β-1,3鍵結(jié)合的支鏈結(jié)構(gòu)[16]; 半乳甘露聚糖是由半乳糖和甘露糖構(gòu)成的雜多糖,與甘露聚糖肽類似,糖鏈主鏈也是由甘露糖組成,但其結(jié)構(gòu)是由β-1,4-D-甘露糖構(gòu)成的主鏈上,通過α-1,6-糖苷鍵連接有單個(gè)的D-半乳糖分支[17]。可以看出,由于連接方式的差異,導(dǎo)致兩種甘露聚糖異頭氫區(qū)域的信號(hào)與甘露聚糖肽信號(hào)差異很大,兩者與甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)r僅有-0.280 1,-0.157 9(遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.95),可見,該方法具有很強(qiáng)的特異性。

表4　供試品與對(duì)照品譜圖的相似度

1-Mannatide standard; 2-091202 (for oral);3-110901 (for oral);4-G100102 (for oral);5-131101 (for injection);6-131102 (for oral);7-131102 (for injection);8-140401 (for injection);9-140501(for injection);10-140502(for injection)

圖3甘露聚糖肽供試品1H-NMR疊加譜圖

(截取δ4.9 ～ 6.0區(qū)域)

Fig.3Overlay1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ4.9～6.0) of the tested mannatide

此外,在相同測(cè)定條件下,對(duì)市售的幾種其他多糖及糖肽類產(chǎn)品進(jìn)行了核磁測(cè)定(圖5)。結(jié)果表明,幾種樣品在異頭氫區(qū)域峰型及峰位移值與甘露聚糖肽對(duì)照品譜圖差別更大,臘梅花粗多糖、云芝糖肽、板藍(lán)根糖肽的譜圖與甘露聚糖肽對(duì)照品譜圖的相關(guān)系數(shù)r分別只有0.560 4,0.045 7,-0.039 8(遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.95),進(jìn)一步說明該方法具有很高的特異性。

圖4　甘露聚糖肽(1)、葡甘露聚糖(2)和半乳甘露聚糖(3)的1H-NMR譜疊加圖(截取δ 4.9～6.0區(qū)域)Fig.4　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),gluco- mannan(2) and galactomannan(3)

3.4.2重復(fù)性3份平行制備的甘露聚糖肽供試品溶液譜圖如圖6所示。可以看出,3個(gè)樣品譜圖各特征質(zhì)子化學(xué)位移和峰型均一致,和對(duì)照品之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.990 9,0.991 3,0.997 6,可見該方法具有較好的重復(fù)性。

3.4.3精密度同一甘露聚糖肽供試品于不同日期同一時(shí)間下測(cè)定,結(jié)果如圖7所示。各譜圖特征質(zhì)子化學(xué)位移和峰型均一致,和甘露聚糖肽對(duì)照品之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.991 1,0.994 8,0.990 5,可見該方法具有較高的日間精密度。

圖5　甘露聚糖肽(1)、板藍(lán)根糖肽(2)、云芝糖肽(3)和臘梅花 多糖(4)的1H-NMR疊加譜圖(截取δ 4.9～6.0區(qū))Fig.5　Overlay 1H-NMR spectra of the selected spectral region (δ 4.9～6.0) of mannatide(1),radix isatidis glyco- peptide(2),polysaccharopeptide(3),wintersweet flower polysaccharide (4)

圖6　三份平行制備的甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜圖 (截取δ 4.9～6.0區(qū))Fig.6　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of three parallel mannatide

圖7　甘露聚糖肽供試品不同日期檢測(cè)三次的1H-NMR譜圖 (截取δ 4.9～6.0區(qū))Fig.7　Overlay 1H-NMR spectra (δ 4.9～6.0) of mannatide tested at three different days

4　結(jié)　論

采用核磁共振氫譜法定性鑒定甘露聚糖肽,以甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的1H-NMR譜作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜,以異頭氫區(qū)作為特性鑒定的光譜區(qū),將供試品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜峰型及峰位移值對(duì)比,采用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算選定光譜區(qū)的相似度。結(jié)果表明,該方法具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、精密度高等優(yōu)點(diǎn),可以解決目前甘露聚糖肽現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別方法專屬性不強(qiáng)的問題,可為甘露聚糖肽的質(zhì)量控制提供更好的手段。需要說明的是,如果樣品純度比較差,所含雜質(zhì)在異頭氫區(qū)域也會(huì)出峰,則會(huì)對(duì)甘露聚糖肽的鑒定產(chǎn)生干擾。因此該方法只適合純度比較高的樣品。

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Identification of Mannatide by1H-NMR

XIA Wei1,SHEN Yan-hong1,FU Di1,ZHANG Wen-qing1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.Ltd,Chengdu 610083,China)

1H-NMR method was established for identification of mannatide:A portion of the anomeric region of each spectrum (δ4.89～5.90) was selected as the “fingerprint” identification region.The tested samples spectra were compared with the standard reference spectrum of mannatide,using correlation coefficient to calculate the similarity.The specificity,repeatability and precision of this method were investigated.There was no significant difference between the tested samples spectra and reference spectrum,and the similarity was greater than 0.95.Methodological evaluation showed the specificity of1H-NMR identification method was satisfactory.The1H-NMR method established in this assay was simple,reproducible and specific,which was suitable for identification of mannatide.

1H-NMR; mannatide; identification

1006-3080(2016)04-0508-05

10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.04.011

2015-12-17

夏瑋(1976-),女,江蘇鹽城人,副教授,博士,研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的分離與分析。E-mail:xiawei1999@ecust.edu.cn

通信聯(lián)系人：張文清,E-mail:zhwqing @ecust.edu.cn

R927.11

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