未志勝，邵　理，楊金娟，冶?？?/p>

新疆昆侖雪菊多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)的初步鑒定

未志勝，邵理*，楊金娟，冶?？?/p>

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

以新疆昆侖雪菊為原料，采用超聲波輔助法提取雪菊多糖（KSCP），經(jīng)脫蛋白、脫色、透析、DEAE-52層析柱和SephadexG-100凝膠層析柱純化后，獲得兩個(gè)多糖組分（KSCP1和KSCP2）；將分離純化后的多糖組分經(jīng)紫外光譜分析法、凍融分析法、SephadexG-100凝膠柱層析法對(duì)其純度進(jìn)行鑒定；采用凝膠滲透色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）對(duì)KSCP分子質(zhì)量范圍和單糖組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明，KSCP1和KSCP2均為單一組分；KSCP1是由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖4種單糖組成，其摩爾比為10.53∶5.02∶4.96∶1，分子質(zhì)量范圍為8 200～8 700 u；KSCP2主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖3種單糖組成，其摩爾比為1∶2.78∶5.07，分子質(zhì)量范圍為6 100～6 500 u。

昆侖雪菊；多糖；純化；單糖組成；結(jié)構(gòu)

新疆昆侖雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）學(xué)名為雙色金雞菊、蛇目菊，菊科金雞菊屬一年生草本植物，是目前新疆唯一可以和雪蓮齊名、且具有特殊功效和藥用價(jià)值的高寒野生植物［1］。僅在每年八月綻放一次，花期短暫，生長(zhǎng)面積小，產(chǎn)量極低。隨著栽培技術(shù)的推廣，目前在新疆達(dá)坂城、皮山縣、策勒縣等地區(qū)均有廣泛種植［2］?，F(xiàn)如今，隨著保健意識(shí)的增強(qiáng)，消費(fèi)者對(duì)天然植物保健品的需求量越來(lái)越大，加之植物多糖雖然是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而形成，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類物質(zhì)，但具有提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抗衰老、抗病毒、抗氧化、降血脂、降血糖等多種生物活性［3］，因此植物多糖引起了許多學(xué)者的關(guān)注和研究。已有研究表明，菊花多糖具有良好的保健效果［4］，而新疆昆侖雪菊中多糖類含量約為13.86%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品種菊花［5］。

目前研究主要集中在昆侖雪菊的化學(xué)成分組成的探索和提取上，采用了不同方法提取了昆侖雪菊的黃酮類成分、揮發(fā)油、咖啡酸類成分、多糖、浸出物、微量元素和氨基酸等化學(xué)成分，測(cè)量出昆侖雪菊含有10種微量元素和17種氨基酸，而對(duì)昆侖雪菊多糖（Kunlun snow chrysanthemum polysaccharides，KSCP）的研究多局限于其多糖成分提取的最佳工藝優(yōu)化層面上，對(duì)于其單糖組成分析鮮有報(bào)道。YAMAZAKI S等［6］通過(guò)比較昆侖雪菊、金盞黃菊花和金盞紅菊花中總糖的含量得出如下結(jié)論：昆侖雪菊總糖含量為26.81%，高于其余兩種菊花。張彥麗等［7］不僅采用苯酚-硫酸法測(cè)得昆侖雪菊中多糖的含量為13.86%，還說(shuō)明了該方法測(cè)定昆侖雪菊多糖具有可靠性。邵理等［8］采用超聲波輔助提取法及響應(yīng)面優(yōu)化法得到了昆侖雪菊多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶60（g∶mL），提取時(shí)間53 min，提取溫度68℃，提取兩次，多糖得率為9.85%。曹志龍等［9］采用多糖糖腈乙酸酯衍生化及柱前衍生氣相色譜法對(duì)新疆金雞菊多糖進(jìn)行組成分分析以及確定最佳衍生化條件，結(jié)果表明，金雞菊粗多糖的單糖組成為：葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖，摩爾比為0.42∶2.51∶0.48∶0.83∶6.38∶2.07；糖腈乙酸酯衍生化最佳衍生化條件為10 mg樣品、吡啶0.5 mL、醋酸酐0.5 mL、90℃反應(yīng)30 min。敬思群等［10］采用超高壓技術(shù)提取金雞菊多糖，并結(jié)合紫外-可見(jiàn)光譜和紅外光譜對(duì)所得多糖進(jìn)行了分析，結(jié)果表明其多糖最佳提取條件為：壓力300 MPa，料液比1∶16（g∶mL），保壓時(shí)間4 min，pH值為9，多糖提取率可達(dá)到6.42%；在如上條件下超高壓技術(shù)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯影響。ZHENG Y等［11］從杭菊中得到兩種酸性多糖（F4、F5）并對(duì)其進(jìn)行了單糖組成分分析，結(jié)果表明F4是由阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖組成，其摩爾比為1.0∶6.8∶2.3；F5是由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為3.2∶4.3∶1∶1。

本研究以昆侖雪菊為原料經(jīng)提取、分離純化得到昆侖雪菊多糖，并對(duì)其理化性質(zhì)及一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，為昆侖雪菊多糖的進(jìn)一步研究提供參考，也為昆侖雪菊產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新疆昆侖雪菊：西域金鋤生物工程有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、DEAE纖維素DE-52、Sephadex G-100：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)單糖、吡啶、鹽酸羥胺、醋酸酐、肌醇：北京頂國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶（≥6 000 U/mg）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：西安予輝儀器有限公司；UV-1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津國(guó)際貿(mào)易公司；HHS-216恒溫水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司；Neofuge-15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；ZXRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；KQ-200V DE雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1昆侖雪菊多糖提取、分離和純化［12-14］

昆侖雪菊→干燥→粉碎→脫脂處理→超聲波輔助提取→離心→取上清液→真空濃縮→醇沉（體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇）→冷凍干燥（-18℃）→昆侖雪菊粗多糖（KSCP）→蒸餾水溶解→木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法脫蛋白→脫色（HP-20樹(shù)脂）→濃縮（50℃）→透析（截留分子質(zhì)量8 000 u）→冷凍干燥（-18℃）→蒸餾水溶解→DEAE-52纖維素柱層析柱→透析（截留分子質(zhì)量8 000 u）→濃縮（50℃）→冷凍干燥（-18℃）→Sephadex G-100柱層析→真空干燥→不同級(jí)分的KSCP

1.3.2 KSCP純度鑒定

KSCP純度鑒定分別采用紫外光譜掃描、凍融法和Sephadex G-100凝膠柱層析法進(jìn)行分析。將KSCP配制成水溶液，紫外光譜分析法掃描波長(zhǎng)為200～400 nm；凍融法則是將KSCP溶液，冷凍過(guò)夜，室溫自融，1 000 r/min離心20 min，觀察其現(xiàn)象，判斷該多糖是否為純多糖。

1.3.3 KSCP相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用凝膠柱層析測(cè)定KSCP多糖分子質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取一定標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列T10、T40、T70、T500，配制成質(zhì)量濃度為5.0mg/mL溶液，然后依次上柱（SephadexG-100凝膠柱），上樣量均為0.5mL，同時(shí)以0.1mol/LNaCl溶液以0.5mL/min進(jìn)行洗脫，采用自動(dòng)部分收集器按1管/2 min進(jìn)行收集。用苯酚-硫酸法跟蹤測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的出峰情況，得到各洗脫液體積Ve，而外水體積V0則由已知分子質(zhì)量的藍(lán)色葡聚糖T-2000的洗脫液體積求得，柱床體積Vt在試驗(yàn)前已測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為分配系數(shù)K，縱坐標(biāo)為lgMw，其中Mw為標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子質(zhì)量，分配系數(shù)K計(jì)算的公式如下：

將分離純化得到的不同級(jí)別多糖KSCP組分均配成質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL溶液，按上述方法進(jìn)行操作，依據(jù)制備獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同級(jí)別KSCP相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.4 KSCP單糖組成分析［15-16］

（1）標(biāo)樣及樣品的制備

內(nèi)標(biāo)（肌醇六乙酸酯）的制作：準(zhǔn)確稱取鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）2.25 g，肌醇1.5 g于三口瓶中，再分別量取1.5 mL吡啶和22.5 mL醋酸酐，混勻后，置于90℃水浴中攪拌2 h，待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入冰水使肌醇六乙酸酯析出，過(guò)濾，用20 mL水反復(fù)洗滌兩次，100℃條件下烘干備用。稱取100 mg肌醇六乙酸酯，三氯甲烷溶解至100 mL，制得內(nèi)標(biāo)液待用。

標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化：分別精確稱取10.0 mg各標(biāo)準(zhǔn)單糖（L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-核糖）于有標(biāo)記的試管中。分別加入10.0 mg鹽酸羥胺，1.0 mL吡啶，振蕩溶解后于90℃水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入醋酸酐1.0 mL，90℃水浴30 min后，N2吹干，加入甲醇1 mL，反復(fù)3次吹干，加入三氯甲烷1 mL，過(guò)濾后用于氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析。

多糖水解與衍生化：分別稱取不同級(jí)別的KSCP各10mg于安瓿管中，加入4 mol/L三氟乙酸3 mL，封管后于120℃水解3 h，進(jìn)行完全酸水解，反應(yīng)完成后用N2吹干。按照上述標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化方法處理，過(guò)濾后，待測(cè)。

（2）GC-MS分析

氣相色譜條件：采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm），柱溫采用程序升溫方式，即初始溫度40℃，以5℃/min升溫至90℃，再以10℃/min升溫至230℃，保留7min，載氣為氦氣（He），流速為0.9 mL/min，1 μL進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI），電子能量70eV，離子源溫度：250℃，接口溫度：200℃。

定性和定量分析：采用單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.5核磁共振分析

準(zhǔn)確稱取KSCP2 20.0 mg溶于0.5 mL的重水（D2O）中，400 MHz核磁共振儀測(cè)定13C-NMR譜。

1.3.6 KSCP理化性質(zhì)的測(cè)定

（1）溶解性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取不同級(jí)別的KSCP 10.0 mg，置于分別裝有蒸餾水、丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、正丁醇小燒杯中，必要時(shí)采取超聲波輔助處理，觀察各燒杯中多糖的溶解狀態(tài)。

（2）顯色反應(yīng)

將不同級(jí)別的KSCP配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，分別進(jìn)行碘-碘化鉀（I2-KI）顏色反應(yīng)、硫酸-苯酚反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)和三氯化鐵反應(yīng)，觀察其顏色變化情況。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析處理，每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行。

2　結(jié)果與分析

2.1 KSCP的提取分離

干燥后的新疆昆侖雪菊經(jīng)脫脂、超聲輔助浸提、乙醇沉淀后得KSCP，經(jīng)木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法脫蛋白、HP-20樹(shù)脂脫色后，透析，冷凍干燥得紅棕色KSCP粗多糖。

2.1.1 DEAE-52纖維素柱層析

經(jīng)脫蛋白、脫色、脫鹽處理后的KSCP，經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析，洗脫曲線見(jiàn)圖1。

圖1　DEAE-52層析柱純化昆侖雪菊多糖洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Kunlun chrysanthemum polysaccharides purified by DEAE-52 chromatographic column

由圖1可知，昆侖雪菊多糖通過(guò)DEAE-52層析柱分離到兩個(gè)多糖級(jí)分，分別命名為KSCP1、KSCP2。其中，由蒸餾水洗脫，經(jīng)收集、透析、真空冷凍干燥所得到的級(jí)分為KSCP1，由0.2 mol/LNaCl洗脫，經(jīng)收集、透析、真空冷凍干燥所得到的級(jí)分為KSCP2，且KSCP2的含量高于KSCP1。將得到的2個(gè)初步純化產(chǎn)品KSCP1和KSCP2用Sephadex G-100凝膠層析柱進(jìn)一步純化。

2.1.2 Sephadex G-100凝膠柱層析

由DEAE-52層析柱分離出來(lái)的KSCP1、KSCP2兩多糖級(jí)分，分別經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析柱，以苯酚硫酸法跟蹤洗脫液，并測(cè)得其吸光度值，洗脫曲線分別見(jiàn)圖2。

圖2　Sephadex G-100層析住純化KSCP1（A）及KSCP2（B）洗脫曲線Fig.2 Elution curve of KSCP1（A）and KSCP2（B）purified by Sephadex G-100 chromatographic column

由圖2可知，洗脫曲線均出現(xiàn)單一狹窄的對(duì)稱峰，由此說(shuō)明均為單一級(jí)分，收集出峰對(duì)應(yīng)管洗脫液，經(jīng)濃縮、透析、真空冷凍干燥，備用。

2.2 KSCP純度鑒定

2.2.1紫外光譜法分析

圖3　昆侖雪菊多糖紫外光譜掃描結(jié)果Fig.3 Ultraviolet spectrum scan results of Kunlun chrysanthemum polysaccharides

由圖3可知，在波長(zhǎng)260nm和280nm處均未出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明經(jīng)DEAE-52纖維素和Sephadex G-25凝膠柱層析獲得后的KSCP1、KSCP2中均不含有核酸和蛋白等雜質(zhì)。

2.2.2凍融法

取出冷凍過(guò)夜的KSCP1、KSCP2溶液，室溫自融，經(jīng)10 000 r/min離心20 min，觀察發(fā)現(xiàn)KSCP1、KSCP2離心管底部均無(wú)沉淀產(chǎn)生，溶液顏色為透明淡黃色，且與離心前顏色一樣，由此確定KSCP1、KSCP2均為單一組分。

2.2.3理化性質(zhì)測(cè)定

KSCP1、KSCP2均為白色絮狀物，經(jīng)溶解性測(cè)定發(fā)現(xiàn)KSCP1和KSCP2易溶于蒸餾水，不溶于丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、正丁醇等有機(jī)溶劑；經(jīng)碘-碘化鉀（I2-KI）顏色反應(yīng)，溶液沒(méi)有產(chǎn)生藍(lán)色現(xiàn)象，說(shuō)明KSCP1、KSCP2不含淀粉；觀察硫酸-苯酚反應(yīng)溶液，均顯橙黃色，存在糖類物質(zhì)；考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)和三氯化鐵反應(yīng)均為陰性（溶液沒(méi)變色），再次證實(shí)KSCP1、KSCP2不含蛋白質(zhì)、核酸和酚類等物質(zhì)。

2.3 KSCP相對(duì)分子質(zhì)量

由標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-5.94118x-5.95962，相關(guān)系數(shù)R2=0.99684。結(jié)果表明，分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值（lgMw）與分配系數(shù)（K）具有良好的線性關(guān)系，可以用于多糖分子質(zhì)量的測(cè)定。

圖4　多糖分子質(zhì)量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of polysaccharide molecular mass

多糖KSCP1、KSCP2經(jīng)3次平行試驗(yàn)后得到：KSCP1的分子質(zhì)量范圍為8 200～8 700 u，KSCP2分子質(zhì)量范圍為6 100～6 500 u。

2.4 KSCP各級(jí)分單糖組成分析

目前常用的多糖衍生化有三甲基硅醚衍生化、糖腈乙酸酯衍生化和糖醇乙酸酯衍生化，其中三甲基硅醚衍生化易產(chǎn)生較多的異構(gòu)峰，糖醇乙酸酯衍生化的操作過(guò)程較復(fù)雜，糖腈乙酸酯衍生化的操作雖相對(duì)復(fù)雜，但每個(gè)單糖都可以產(chǎn)生單一的色譜峰［17-18］。實(shí)驗(yàn)采用糖腈乙酸酯衍生化，各標(biāo)準(zhǔn)單糖及多糖不同級(jí)分GC-MS分析總離子流色譜圖見(jiàn)圖5所示。

圖5　單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）、KSCP1（B）和KSCP2（C）GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of monosaccharide standards（A），KSCP1（B）and KSCP2（C）analysis by GC-MS

由圖5可知，將多糖KSCP1、KSCP2的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)單糖色譜圖保留時(shí)間進(jìn)行比較［19-20］，發(fā)現(xiàn)除了阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖衍生物外，還存在未知的色譜峰，分析其原因可能是單糖在衍生化過(guò)程中生成了α-型和β-型吡喃和呋喃異構(gòu)體。KSCP1經(jīng)完全水解、糖腈乙酸酯衍生后經(jīng)GC-MS分析得色譜圖見(jiàn)圖5B，將其與標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC-MS色譜圖對(duì)照（見(jiàn)圖5A）可知，KSCP1主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖組成，僅含少量的甘露糖和半乳糖，主要組成單糖摩爾比為10.53∶5.02∶4.96∶1；KSCP2經(jīng)完全水解、糖腈乙酸酯衍生后經(jīng)GC-MS分析得色譜圖見(jiàn)圖5C，將其與標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC-MS色譜圖對(duì)照（見(jiàn)圖5A）可知，KSCP2主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，少量的核糖及甘露糖，主要組成單糖摩爾比為1∶2.78∶5.07。

3　結(jié)論

采用超聲波輔助熱水浸提-醇沉法獲得的昆侖雪菊多糖，經(jīng)脫蛋白、脫色、透析、DEAE-52層析柱和Sephadex G-100凝膠層析柱純化，得到兩多糖級(jí)分KSCP1和KSCP2，結(jié)合紫外光譜分析法、凍融分析法、Sephadex G-100凝膠柱層析法對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，表明KSCP1和KSCP2均為單一組分，不含有蛋白質(zhì)、核酸和酚類等物質(zhì)。采用凝膠柱層析和GC-MS對(duì)KSCP相對(duì)分子質(zhì)量和單糖組成進(jìn)行分析，其中KSCP1分子量范圍為8 200～8 700 u，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖4種單糖以摩爾比為10.53∶5.02∶4.96∶1組成；KSCP2分子質(zhì)量范圍為6 100～6 500 u，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖3種單糖以摩爾比為1∶2.78∶5.07組成。

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Separation and purification of polysaccharides from Kunlun snow chrysanthemum in Xinjiang and preliminary identification of its structure

WEI Zhisheng，SHAO Li*，YANG Jinjuan，YE Fujun
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Using Kunlun snow chrysanthemum in Xinjiang as the raw material，snow chrysanthemum polysaccharides（KSCP）were extracted by ultrasonic-assisted method.The extracts were purified by deproteinization，decoloration，dialysis，DEAE-52 chromatography column and SephadexG-100 gel chromatography column，and two polysaccharide components（KSCP1 and KSCP2）were obtained.The purity of polysaccharide components were identified by ultraviolet spectrum analysis，freezing and thawing method and SephadexG-100 gel column chromatography.Meanwhile，the range of KSCP molecular mass and monosaccharide composition were analyzed by gel permeation chromatography（GPC）and GC-MS.The results showed that KSCP1 and KSCP2 were both single composition.KSCP1 was composed of four kinds of monosaccharide including glucose，arabinose，galactose and xylose，the molar ratio was 10.53∶5.02∶4.96∶1，and the range of molecular mass was 8 200-8 700 u.KSCP2 was composed of three kinds of monosaccharide including glucose，arabinose and galactose，the molar ratio was 1∶2.78∶5.07，and the range of molecular mass was 6 100-6 500 u.

Kunlun snow chrysanthemum；polysaccharides；purification；monosaccharide compositions；structure

TS210.1

0254-5071（2016）07-0074-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.016

2016-03-11

未志勝（1992-），男，本科生，研究方向?yàn)楣δ苁称放c食品配料。

邵理（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苁称贰?/p>