陳　磊，趙祥穎，劉建軍，

坎皮納斯類芽孢桿菌木聚糖酶的純化以及酶學(xué)性質(zhì)

陳磊1，趙祥穎2，劉建軍1，2*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟南 250013；2.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東 濟南 250013）

采用硫酸銨鹽析、Sephadex G-50凝膠過濾、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析對坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7發(fā)酵液進行分離純化，獲得純化的木聚糖酶，純化倍數(shù)為26.36，酶活回收率為5.13%。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果為單一條帶，分子質(zhì)量為24.5 ku。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH值為8.0。K+、Fe2+對酶有激活作用，Zn2+、Cu2+對酶有強烈的抑制作用。以櫸木木聚糖為底物時，米氏常數(shù)Km=4.733 mg/mL，最大酶反應(yīng)速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。

坎皮納斯類芽孢桿菌；木聚糖酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

木聚糖（xylan）是由β-1，4木糖苷鍵連接起來的多聚糖，分子中含有許多葡萄糖醛酸、乙?；?、阿拉伯糖、阿魏酸、香豆酸等側(cè)鏈基團［1］。它是半纖維素中最主要的成分，在農(nóng)業(yè)上被當(dāng)作廢料而大量浪費［2］。木聚糖酶是降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱［3］，包括切β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等［4］。在木聚糖降解酶系中，β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶是使木聚糖完全水解最關(guān)鍵的酶，主要來源于細菌、真菌、放線菌等微生物［5］。目前，木聚糖酶在食品行業(yè)中引人注目的應(yīng)用是作為面包品質(zhì)改良劑［6］。在造紙行業(yè)中，堿性木聚糖酶可以提高紙漿的漂白率，并因此減少化學(xué)漂白劑的用量［7］。大多數(shù)木聚糖酶的分離純化采用多步非特異性方法，如粗沉淀之后，采用離子交換、凝膠層析、疏水層析等［8］。目前，國內(nèi)外對木聚糖酶的研究已有較多的報道，但對坎皮納斯類芽孢桿菌產(chǎn)木聚糖酶的分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)等方面的研究較少。本研究以一株坎皮納斯類芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，利用鹽析、凝膠色譜分離技術(shù)和離子柱層析技術(shù)對該菌發(fā)酵產(chǎn)生的木聚糖酶進行分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

坎皮納斯類芽孢桿菌（Paenibacillus campinasensis）xy-7：山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：木聚糖1%，酵母浸粉0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 8.0；121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木聚糖1%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.05%，KCl 0.08%，MgSO40.08%，pH 8.0；121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑

木聚糖（分析純）：美國Sigma公司；牛血清白蛋白（生化試劑）：南京奧多福尼生物科技有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準品（生化試劑）：寶生物工程（大連）有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SephadexG-50層析柱（2.5cm×20cm）、DEAESepharose Fast Flow層析柱（2.5 cm×20 cm）：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；ZN17-HD自動液相色譜分離層析儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1木聚糖酶活力測定

取0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入到1.9 mL用Tris-HCl緩沖液（pH8.0）配制的1%木聚糖溶液中，60℃反應(yīng)10 min，3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖（以木糖計）［9］。木聚糖酶活定義：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖（以木糖計）所需酶量定義為一個酶活力單位（IU/mL）。

木聚糖酶活、比酶活、酶回收率、純化倍數(shù)等計算公式，參照TSENG M J等［10］的方法。

1.3.2分析檢測［11-12］

蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法；木聚糖酶的純度測定采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法。

1.3.3木聚糖酶的分離

（1）粗酶液的制備

坎皮納斯類芽孢桿菌xy-7菌株在37℃、180 r/min、裝液量30 mL/250 mL條件下，培養(yǎng)24 h。所得發(fā)酵液離心（9 000 r/min、15 min）收集上清液，即為木糖酶粗酶液。

（2）硫酸銨分級沉淀［13］

取6支離心管，每支加入離心后粗酶液10 mL，分別加干燥研磨后的（NH4）2SO4至飽和度為0、20%、40%、60%、80%、100%。充分溶解后置于4℃環(huán)境中過夜，離心，測定沉淀中木聚糖酶活力及沉淀中蛋白質(zhì)含量，確定最佳鹽析區(qū)間。將蛋白沉淀用磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）復(fù)溶，離心（4℃、10 000 r/min、10 min）除去不溶沉淀。所得上清液用蒸餾水透析（截留分子質(zhì)量為8 000～14 000 u），濃縮。

1.3.4木聚糖酶的純化

（1）Sephadex G-50層析柱凝膠過濾

將濃縮后的木聚糖酶液取5 mL上樣于經(jīng)Tris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡的SephadexG-50層析柱（3.0cm×20cm），并用同一種緩沖液以3.0 mL/min的流速洗脫。根據(jù)波長280 nm處吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活性。將有酶活的峰收集，并濃縮。

（2）DEAE Sepharose Fast Flow離子層析

將濃縮后的酶液取5 mL上樣于經(jīng)Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡的DEAE Sepharose Fast Flow離子層析柱（2.5 cm×20 cm），并以2.5 mL/min流速，0～1 mol/L NaCl梯度洗脫。根據(jù)波長280 nm處吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活力。將有酶活的峰收集，濃縮。

所得的濃縮液取5 mL上樣于經(jīng)Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱（2.5 cm×20 cm），并以2.5 mL/min流速，0～1 mol/L NaCl梯度洗脫。根據(jù)波長280 nm條件下吸光度值的變化開始收集樣品，每管6 mL，按照1.3.1方法檢測木聚糖酶活力。將有酶活的峰收集，濃縮。

1.3.5木聚糖酶的分子質(zhì)量測定

采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法。遷移率計算公式、標準蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對數(shù)和遷移率的標準曲線、木聚糖酶分子質(zhì)量計算，參照張蕾等［11］的方法。

1.3.6木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

（1）木聚糖酶最適反應(yīng)溫度

分別在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴條件下進行酶解反應(yīng)并測定酶活力，以酶活力最高者為100%計算相對酶活力，重復(fù)3次，取平均值。

（2）木聚糖酶的最適pH

采用pH值為6.0、6.5、7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）配制底物，pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的Tris-HCl緩沖液配制底物和稀釋酶液，在60℃條件下分別用不同pH值的木聚糖底物進行酶解，并按上述方法測定酶活力。以酶活力最高者為100%計算相對酶活力，重復(fù)3次，取平均值。

（3）金屬離子對酶活的影響

將金屬離子（Zn2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、K+）分別加入到木聚糖酶的反應(yīng)體系中，使金屬離子終濃度為5 mmol/L，在60℃條件下按正常酶活體系測定酶活力。為了排除陰離子的影響，除了Ca2+、K+的陰離子為Cl-，其余為SO42-。以未處理酶液的酶活力為100%計算相對酶活力，重復(fù)3次，取平均值。

（4）木聚糖酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm

根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，測定底物濃度不同時酶的活力，然后計算出在不同濃度時的反應(yīng)速率，取雙倒數(shù)得到回歸方程，求出木聚糖酶米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm。

（5）木聚糖酶的專一性

將1%的木聚糖、羧甲基纖維素、淀粉、蔗糖作為底物，在60℃條件下按正常酶活體系測定酶活力，以木聚糖底物的酶活力為100%計算相對酶活。

2　結(jié)果與分析

2.1木聚糖酶分離

在不同（NH4）2SO4飽和度條件下，硫酸銨分級鹽析結(jié)果見圖1。

圖1　木聚糖酶分段鹽析純度和回收率Fig.1 Purity and recovery rate of xylanase by fractional salting out

由圖1可知，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度＞80%時，沉淀中酶的比酶活和回收率很低，說明主要為雜蛋白。所以綜合比酶活和酶活回收率兩個因素考慮，本實驗選擇（NH4）2SO4飽和度60%為最適鹽析條件。

2.2木聚糖酶純化

SephadexG-50層析凝膠過濾、pH=8.0DEAESepharose Fast Flow離子交換層析、pH=9.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析，洗脫曲線分別見圖2～圖4。

圖2　Sephadex G-50凝膠層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線Fig.2 Elution curve of xylanase purified by Sephadex G-50 gel chromatography column

由圖2可知，經(jīng)過SephadexG-50凝膠層析過濾分離出兩個蛋白峰，有酶活力的是第一個峰。Sephadex G-50凝膠過濾分離范圍為1.5～30ku，適用于小分子蛋白分離、脫鹽。由圖3可知，經(jīng)過pH=8.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析分離出3個峰，其中有兩個峰有酶活，第一個峰有較高酶活，第二個峰酶活較低不具備研究價值。由圖4可知，經(jīng)過pH=9.0 DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析分離出3個峰，第二個峰有酶活。

圖3　DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線（pH=8.0）Fig.3 Elution curve of xylanase purified by DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchanged chromatography column（pH=8.0）

圖4　DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析柱純化木聚糖酶洗脫曲線Fig.4 Elution curve of xylanase purified by DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchanged chromatography column（pH=9.0）

木聚糖酶純化倍數(shù)和比酶活見表1。根據(jù)鄒永龍等［14］的研究表明，具有木聚糖降解酶活性的各個組分如內(nèi)切木聚糖酶、木聚糖苷酶等參與木聚糖降解為木糖單體同時存在時，它們之間的協(xié)同作用可能使實驗過程中測得的酶活力值高于實際值，致使酶活力的回收率偏低，這在酶分離純化的初期表現(xiàn)得很明顯。

表1　木聚糖酶純化結(jié)果Table 1 Purification results of xylanase

由表1可知，經(jīng)過鹽析、G-50凝膠過濾、兩次離子交換層析后，純化倍數(shù)是26.36，酶活回收率為5.13%，比酶活提高至4 631.3 IU/mg。雖然在實驗中也檢測到其他具有木聚糖水解活性的組分，但由于酶活較低，不具備研究意義，所以只是鑒定了其中的一個具有較高活性的組分，致使酶活力的回收率比較低。

木聚糖酶SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖5。由圖5可知，1號泳道說明鹽析后的酶液中含有大量雜蛋白；2號泳道說明Sephadex G-50凝膠層析過濾后的酶液也含有大量雜蛋白；3號泳道說明經(jīng)過pH 8.0離子層析后只含有3條蛋白帶，4號泳道說明經(jīng)過pH 9.0離子層析后只含有1條蛋白帶。結(jié)果表明，純化后只有一條木聚糖酶電泳條帶，說明該酶為單肽鏈結(jié)構(gòu)蛋白。按照1.3.5節(jié)方法計算出胞外木聚糖酶相對分子質(zhì)量為24.5 ku。

圖5　木聚糖酶粗酶和純化后的電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of crude and purified xylanase

2.2木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1木聚糖酶最適反應(yīng)溫度

在不同溫度下測定木聚糖酶的酶活力，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，隨著溫度的增加，酶活呈上升趨勢，在溫度為60℃時達到最高峰，隨后開始下降，因此，最適溫度為60℃。在溫度為45～65℃時可保持80%以上的相對酶活，說明該酶具有很好的耐熱性，具有工業(yè)化潛力。例如，在面包制作方面，使用中溫木聚糖酶能使面包體積最大增加量為30%，而耐熱木聚糖酶可使面包增大40%～60%［16］。

圖6　木聚糖酶最適反應(yīng)溫度Fig.6 Optimal reaction temperature of xylanase

2.2.2木聚糖酶的最適pH

在不同pH值下測定木聚糖酶的酶活力，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，隨著pH的增加，酶活呈上升趨勢，在pH值為8.0時達到最高峰，隨后開始下降；在pH值為6.5～8.5可保持85%以上的相對酶活；當(dāng)pH＜6.5或＞8.5時相對酶活急劇下降。pH值為10.0時，相對酶活為22.5%。因此，木聚糖酶的最適pH值為8.0。根據(jù)孫振濤等［15］的研究，粗酶液的最適pH值在7.0左右，這是由于粗酶液含有多種降解木聚糖的酶，如內(nèi)切木聚糖酶、木聚糖苷酶等，這些酶影響最適pH的測定。

圖7　木聚糖酶最適pH值Fig.7 Optimal pH of xylanase

2.2.3金屬離子對酶活的影響

表2　不同金屬離子對木聚糖酶活性的影響Table 2 Effects of different metal ions on xylanase activity

由表2可知，K+、Fe2+對木聚糖酶有明顯激活作用。Zn2+、Cu2+對木聚糖酶有強烈的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+使木聚糖酶活性有不同程度下降。

2.2.4木聚糖酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm

圖8　木聚糖酶的米氏常數(shù)雙倒數(shù)曲線Fig.8 Lineweaver-Burk plot of Kmof xylanase

據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法得出1/V（y）與1/［S］（x）呈線性關(guān)系，結(jié)果見圖8。直線方程為y=163.1x+34.46（相關(guān)系數(shù)R2=0.998），從而得出米氏常數(shù)Km=4.733 mg/mL，最大酶反應(yīng)速率Vm=315.85 μmol/（min·mg）。

2.2.5底物專一性

由表3可知，該木聚糖酶對羧甲基纖維素、淀粉、蔗糖均沒有酶活力，具有良好的專一性，在生物漂白方面有很大潛力［17］。

表3　木聚糖酶的底物專一性Table 3 Substrate specificity of xylanase

3　結(jié)論

本實驗采用硫酸銨沉淀法、Sephadex G-50凝膠層析柱過濾、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析純化出較高純度的木聚糖酶，純化倍數(shù)為26.36，酶活回收率為5.13%，分子質(zhì)量為24.5 ku。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH值為8.0。該酶具有很好的耐堿性和耐熱性，以及底物專一性。

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Purification and enzymatic properties of xylanase fromPaenibacillus campinasensis

CHEN Lei1，ZHAO Xiangying2，LIU Jianjun1，2*
（1.College of Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250013，China；2.Food&Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province，Jinan 250013，China）

The fermentation liquid ofPaenibacillus campinasensisxy-7 was separated and purified by ammonium sulfate salting-out，Sephadex G-50 gel filtration and DEAE Sepharose Fast Flow ion-exchange column chromatography.The purified xylanase was obtained，the purification multiple was 26.36 and recovery rate of the enzyme was 5.13%.The electrophoresis result of SDS-PAGE was single band and mass of molecule was 24.5 ku.The results of enzymatic property showed that the optimal reaction temperature of xylanase was 60℃and the optimal pH was 8.0.The enzyme could be activated by Fe2+and K+，but inhibited by Zn2+and Cu2+.With beech xylan as substrate，the Kmwas 4.733 mg/ml and the Vmwas 315.85 μmol/（min·mg）.

Paenibacillus campinasensis；xylanase；separation and purification；enzymatic properties

Q814.1

0254-5071（2016）07-0064-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.014

2016-02-23

山東省自主創(chuàng)新專項（201422cx02602）

陳磊（1990-），男，碩士研究生，研究方向為生化反應(yīng)工程。

劉建軍（1962-），男，研究員，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)利用。