畢生雷，張成明，鄭世文，金洪波，吳　娟，魯　龍，張鵬飛

異養(yǎng)小球藻發(fā)酵與樹脂調(diào)節(jié)pH過程耦合工藝

畢生雷1，張成明2，3*，鄭世文1，金洪波1，吳娟1，魯龍1，張鵬飛1

（1.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司 車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473000；2.清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084；3.北京市生物燃料工程技術(shù)研究中心，北京 100084）

為了解除發(fā)酵產(chǎn)酸對異養(yǎng)小球藻正常生長的抑制，提出了異養(yǎng)小球藻發(fā)酵與樹脂調(diào)節(jié)pH過程耦合工藝?？疾炝颂砑訕渲N類、添加樹脂時(shí)間、樹脂添加量對發(fā)酵過程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵72 h添加8 g/L的凝膠樹脂Lx-300C能夠調(diào)節(jié)pH維持在中性，細(xì)胞數(shù)達(dá)到7.5×108個(gè)/mL，與空白組持平，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液干質(zhì)量比空白組高5.59%。樹脂能夠反復(fù)使用4次。

異養(yǎng)小球藻；樹脂；耦合

小球藻（Chlorella）分布廣泛，易于培養(yǎng)，不僅能夠利用光能自養(yǎng)，還可利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，生長速度快。小球藻在24h內(nèi)即可使生物量加倍，在指數(shù)生長期的生物量倍增時(shí)間一般為3.5 h［1］。小球藻細(xì)胞含油量＞50%，單位面積小球藻油脂的年產(chǎn)量比油料作物中產(chǎn)量最高的作物還要高7～23倍［2］，由于富含蛋白質(zhì)、維生素、脂質(zhì)和多糖已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、食品添加劑、美容、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域。小球藻蛋白品質(zhì)優(yōu)良，含有18種氨基酸（包括8種人體必需氨基酸），還含有較多的鐵、鋅、錳等礦物質(zhì)元素和廣泛的B族、VC、VE等維生素。據(jù)評估，20 g小球藻粉中維生素、礦物質(zhì)的含量相當(dāng)于1 kg蔬菜中維生素、礦物質(zhì)的含量。小球藻多糖及糖蛋白已被國外學(xué)者證明具有抗腫瘤活性、抗病原菌、抗病毒感染及增強(qiáng)免疫力等活性。基于小球藻眾多的優(yōu)良特性，其正成為近年來研究的熱點(diǎn)。

異養(yǎng)小球藻（heterotrophicChlorella）在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，對藻細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制。為了調(diào)節(jié)pH，通常在發(fā)酵過程中流加堿性溶液調(diào)節(jié)，一方面增加了物料消耗，另一方面酸堿中和后產(chǎn)生的鹽類導(dǎo)致藻細(xì)胞生長環(huán)境中滲透壓升高，不利于發(fā)酵過程運(yùn)行。樹脂在生物化工行業(yè)常被用于除鹽，近年來也有使用樹脂與發(fā)酵耦合獲得乳酸、香蘭素、赤霉素等產(chǎn)品的應(yīng)用［3-4］。樹脂調(diào)節(jié)pH的原理是樹脂顆粒上的活性基團(tuán)與發(fā)酵液中陰離子進(jìn)行交換，從而釋放出OH-與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的H+發(fā)生中和反應(yīng)，達(dá)到調(diào)節(jié)pH的目的。樹脂顆粒上的活性基團(tuán)與發(fā)酵液中陰離子的交換雖然具有吸附順序，但只要是陰離子即有可能被吸附。這就可能導(dǎo)致異養(yǎng)小球藻正常生長所需營養(yǎng)鹽缺失［7-8］。常見樹脂又分為大孔樹脂與凝膠樹脂，大孔樹脂因樹脂顆粒內(nèi)部多孔骨架結(jié)構(gòu)增大了比表面積從而具有較高的吸附性能和調(diào)節(jié)pH能力［9］。但這種特殊構(gòu)造也決定了必然有部分藻細(xì)胞和細(xì)微蛋白進(jìn)入到孔洞中，從而影響發(fā)酵結(jié)果。

本研究擬將吸附樹脂添加至異養(yǎng)小球藻發(fā)酵系統(tǒng)，使小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)與有機(jī)酸脫除的過程相耦合，并對耦合發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

異養(yǎng)小球藻（heterotrophicChlorella）：清華大學(xué)生命科學(xué)院。

酵母粉：安琪酵母有限公司；葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。大孔樹脂LSI-010和凝膠樹脂Lx-300C：西安藍(lán)曉科技有限公司。

搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉3 g/L，磷酸二氫鉀0.075 g/L，硫酸鎂0.075 g/L，氯化鈣0.025 g/L，磷酸氫二鉀0.175g/L，硫酸亞鐵3g/L，硫酸鋅0.022g/L，氯化錳0.181g/L，鉬酸鈉0.004 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

ZWF-111恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；Axioplan 2 imaging E生物顯微鏡：德國卡爾蔡司公司；FiveEasy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（FE20）：美國梅特勒-托利多公司。

1.3方法

1.3.1搖瓶培養(yǎng)

平板上的藻細(xì)胞單菌落接入搖瓶，200 r/min、28℃條件下培養(yǎng)7 d，種子培養(yǎng)合格時(shí)種子液中應(yīng)無菌、發(fā)酵液干質(zhì)量＞10 g/L。

搖瓶試驗(yàn)采用2 L搖瓶發(fā)酵，裝液量50%。培養(yǎng)條件：溫度28℃、轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.3.2樹脂預(yù)處理和添加方法［5］

取樹脂分別用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇充分浸泡，去除殘余惰性致孔劑，再用蒸餾水反復(fù)洗滌至溶液中無明顯乙醇?xì)馕稌r(shí)為止，使用4%NaOH溶液浸泡樹脂2 h，過程中不斷振蕩，然后使用蒸餾水反復(fù)洗滌至溶液呈中性，經(jīng)110℃、20 min滅菌，備用。

1.3.3實(shí)驗(yàn)方法

樹脂種類與添加時(shí)間實(shí)驗(yàn)：分別在發(fā)酵0、24 h、48 h、72 h時(shí)，取出搖瓶，在無菌操作臺準(zhǔn)確稱量4 g/L的Lx300C、Lsi010濕樹脂添加到搖瓶中，然后每天取樣檢測分析發(fā)酵液pH、細(xì)胞數(shù)。

樹脂添加量實(shí)驗(yàn)：發(fā)酵72 h時(shí)，取出搖瓶，在無菌操作臺準(zhǔn)確稱量4 g/L、8 g/L、10 g/L的Lx-300C濕樹脂添加到搖瓶中，然后每天取樣檢測分析發(fā)酵液pH、細(xì)胞數(shù)。

樹脂使用情況實(shí)驗(yàn)：發(fā)酵結(jié)束后，停止搖床，將搖瓶取出并靜置10 min，取搖瓶底部混合物涂片鏡檢。

1.3.4分析方法

葡萄糖含量：采用高效液相色譜法測定；pH：使用臺式pH計(jì)直接測定；細(xì)胞數(shù)：采用血球板計(jì)數(shù)；發(fā)酵液干質(zhì)量測定：取10 mL發(fā)酵液，離心后棄上清液，加蒸餾水至10 mL，再次離心，100℃條件下烘干藻泥，然后計(jì)算發(fā)酵液干質(zhì)量。

發(fā)酵液干質(zhì)量計(jì)算公式［6］：

2　結(jié)果與分析

2.1樹脂種類與添加時(shí)間的影響

2.1.1接種時(shí)添加樹脂

圖1　接種時(shí)添加樹脂對發(fā)酵液pH（A）、細(xì)胞數(shù)（B）的影響Fig.1 Effect of adding resin on pH（A）and cell number（B）of fermentation broth at the time of inoculation

由圖1（A）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中能夠維持中性的發(fā)酵環(huán)境，而未添加樹脂的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中pH一直下降，最低達(dá)到4左右。較低的pH對普通的微生物發(fā)酵或有不利的影響［10］。由圖1（B）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)均比空白組低，其中添加凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比空白組低44.44%，而添加大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比空白組低66.67%。這說明在接種時(shí)添加樹脂，雖然能夠?qū)l(fā)酵過程中的pH維持到中性，但樹脂中的孔洞可能吸附部分細(xì)胞，對細(xì)胞數(shù)的增殖產(chǎn)生不利影響，細(xì)胞數(shù)增長過慢，不利于獲得良好的發(fā)酵結(jié)果［11］。

2.1.2發(fā)酵24 h時(shí)添加樹脂

由圖2（A）可知，空白組發(fā)酵過程中pH一直下降，最低降至4左右。而添加了大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH迅速達(dá)到最大值6.4，之后雖然緩慢下降，但未低于6。而添加了凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH一直緩慢上升，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高6.5。發(fā)酵24 h時(shí)添加兩種樹脂均能夠在發(fā)酵過程中維持pH呈現(xiàn)中性。由圖2（B）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)均比空白組低，其中添加凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比空白組低57.14%，而添加大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比空白組低64.29%。這說明在發(fā)酵24 h時(shí)添加樹脂，雖然能夠?qū)l(fā)酵過程中的pH維持到中性，卻由于樹脂本身的特性對細(xì)胞數(shù)的增殖產(chǎn)生不利影響，不利于獲得良好的發(fā)酵結(jié)果［12］。由于在添加樹脂時(shí)已經(jīng)發(fā)酵24 h，所以各個(gè)試驗(yàn)組的終了細(xì)胞數(shù)均比發(fā)酵開始時(shí)添加要好。

圖2　發(fā)酵24 h時(shí)添加樹脂對發(fā)酵液pH（A）、細(xì)胞數(shù)（B）的影響Fig.2 Effect of adding resin on the pH（A）and cell number（B）of fermentation broth in the fermentation of 24 h

2.1.3發(fā)酵48 h時(shí)添加樹脂

由圖3（A）可知，未添加樹脂的空白組發(fā)酵過程中pH一直下降，最低降到4左右。而添加了大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH達(dá)到最大值4.8，之后雖然緩慢下降，但未低于4.5。而添加了凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH一直緩慢上升，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高5.5。發(fā)酵48 h時(shí)添加兩種樹脂均能夠在發(fā)酵過程中維持pH優(yōu)于空白組，添加凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組，仍然能夠維持發(fā)酵過程中pH呈中性。由圖3（B）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)均比空白組低，其中添加凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)僅比空白組低6.67%，而添加大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)比空白組低53.33%。這說明在發(fā)酵48 h時(shí)添加凝脂樹脂Lx-300，不僅能夠?qū)l(fā)酵過程中的pH維持到中性，而且對細(xì)胞數(shù)的增殖產(chǎn)生的不利的影響已經(jīng)極低。而在發(fā)酵48 h添加大孔樹脂Lsi-010，仍然對發(fā)酵過程產(chǎn)生不利影響。

圖3　發(fā)酵48 h時(shí)添加樹脂對發(fā)酵液pH（A）、細(xì)胞數(shù)（B）的影響Fig.3 Effect of adding resin on the pH（A）and cell number（B）of fermentation broth in the fermentation of 48 h

2.1.4發(fā)酵72 h時(shí)添加樹脂

圖4　發(fā)酵72 h時(shí)添加樹脂對發(fā)酵液pH（A）、細(xì)胞數(shù)（B）的影響Fig.4 Effect of adding resin on the pH（A）and cell number（B）of fermentation broth in the fermentation of 72 h

由圖4（A）可知，未添加樹脂的空白組發(fā)酵過程中pH一直下降，最低降到3.8左右。添加了大孔樹脂Lsi-010的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH達(dá)到最大值4.8，之后雖然緩慢下降，但未低于4.5。添加了凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組，在添加24 h后pH一直緩慢上升，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最高5.2。發(fā)酵72 h時(shí)添加兩種樹脂均能夠在發(fā)酵過程中維持pH優(yōu)于空白組。由圖4（B）可知，添加了大孔樹脂Lsin-010的試驗(yàn)組在發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)比空白組低28.57%，而添加凝膠樹脂Lx-300C的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)與空白組不相上下，甚至略高。

通過樹脂種類和添加時(shí)間對發(fā)酵過程的影響，可以得到結(jié)論，在發(fā)酵72 h時(shí)添加凝脂樹脂Lx-300C，不僅能夠?qū)⒄{(diào)節(jié)pH，還能保持發(fā)酵過程的正常穩(wěn)定進(jìn)行。雖然在更晚的時(shí)間段內(nèi)添加大孔樹脂也可能能夠達(dá)到與發(fā)酵72 h添加凝脂樹脂的效果，但從整個(gè)試驗(yàn)過程來看，添加大孔樹脂通常會(huì)導(dǎo)致pH在添加后的24 h內(nèi)有10%～30%的劇烈波動(dòng)，可能會(huì)對發(fā)酵過程產(chǎn)生不利影響。添加時(shí)間越晚，發(fā)酵產(chǎn)酸越多，藻細(xì)胞代謝產(chǎn)物也可能會(huì)抵制發(fā)酵過程的正常開展。而且大孔樹脂本身所具有的多孔骨架會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)部，從而也影響了發(fā)酵過程的正常運(yùn)行和發(fā)酵結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此確定在發(fā)酵72 h時(shí)添加凝膠樹脂Lx-300C。

2.2樹脂添加量的影響

圖5　樹脂添加量對發(fā)酵液pH（A）、細(xì)胞數(shù)（B）的影響Fig.5 Effect of resin addition on pH（A）and cell number（B）of fermentation broth

樹脂在吸附過量離子后會(huì)達(dá)到飽和，從而會(huì)喪失對離子的吸附能力，需要再生。在2.1的試驗(yàn)過程中，在接種時(shí)添加凝膠樹脂能夠使發(fā)酵過程中pH一直維持在中性左右，而隨著樹脂添加時(shí)間的推遲，添加凝膠樹脂雖然能夠使發(fā)酵過程中pH高于空白組，但已經(jīng)不能維持到中性，特別是在發(fā)酵72 h時(shí)添加僅使pH提高了0.6。說明添加量不足影響了樹脂調(diào)節(jié)pH的效果。

由圖5（A）可知，添加大孔樹脂后，發(fā)酵液中pH均呈現(xiàn)快速增加態(tài)勢，各添加量均能使pH維持在5以上。添加10 g/L與添加8 g/L的試驗(yàn)組發(fā)酵過程中pH和發(fā)酵結(jié)束后pH并沒有太大的差距。而添加4 g/L樹脂的試驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束后較添加10 g/L與添加8 g/L的試驗(yàn)組分別低了6.79%和4.37%。由圖5（B）可知，未添加樹脂的空白組在發(fā)酵進(jìn)入72 h后細(xì)胞數(shù)增長陷入停滯，而添加樹脂的試驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)持續(xù)增長，可能是由于添加樹脂的試驗(yàn)組細(xì)胞生長未受到pH抑制所造成的。添加10 g/L與添加8 g/L的試驗(yàn)組發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)和發(fā)酵結(jié)束后細(xì)胞數(shù)并沒有太大的差距。而添加4 g/L的試驗(yàn)組不論是過程中細(xì)胞數(shù)還是發(fā)酵結(jié)束后細(xì)胞數(shù)均低于其他兩個(gè)試驗(yàn)組。這可能跟該試驗(yàn)組調(diào)節(jié)pH偏低所致。

圖6　樹脂添加量對發(fā)酵液干質(zhì)量（A）、葡萄糖含量（B）的影響Fig.6 Effect of resin addition on dry mass（A）and glucose concentration（B）of fermentation broth

由圖6（A）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液干質(zhì)量高于空白組，有助于產(chǎn)量的提高?？赡苁怯捎跇渲搅瞬糠执x產(chǎn)物解除了小球藻生長的抑制。由圖6（B）可知，添加樹脂的試驗(yàn)組消耗葡萄糖速率相差不大，而空白組則較快消耗完畢。結(jié)合其發(fā)酵液干質(zhì)量變化趨勢，可能是異養(yǎng)小球藻在較低的pH環(huán)境下產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物較多，從而影響了藻細(xì)胞發(fā)酵液干質(zhì)量的增長。這也說明了在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)pH的必要性。

綜合考慮，添加10 g/L樹脂與添加8 g/L樹脂的試驗(yàn)組發(fā)酵并沒有太大的差距，從考慮節(jié)省樹脂使用成本的角度出發(fā)，選用添加8 g/L樹脂，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液干質(zhì)量比空白組高5.59%。

2.3樹脂使用情況

發(fā)酵結(jié)束后，停止通風(fēng)和攪拌，由于樹脂顆粒比重較大，很快會(huì)沉降到發(fā)酵罐底部，通過放出底部發(fā)酵液，然后再過濾收集樹脂。樹脂再生以后能夠重復(fù)使用。

各種離子交換樹脂都有一定的溫度耐受范圍，溫度過高或過低都會(huì)對樹脂造成不利的影響，如溫度過低會(huì)導(dǎo)致樹脂凍裂、溫度過高會(huì)導(dǎo)致樹脂分解等。由于小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程可能被雜菌污染，在添加樹脂時(shí)需要將樹脂進(jìn)行滅菌以后再添加。這就要求樹脂需要承受較高的滅菌溫度［13］。有研究表明，80℃以下都對樹脂使用沒有太大影響［14］，但離子交換樹脂使用的最適吸附溫度范圍為10～60℃。

圖7　使用1次（A）、4次（B）、5次（C）后的樹脂顆粒Fig.7 Resin particles after utilization of one time（A），four times（B）and five times（C）

由圖7可知，第1次使用凝膠樹脂開展耦合工藝研究后，樹脂顆粒完整，樹脂顆粒內(nèi)部沒有藻細(xì)胞存在；反復(fù)使用4次后的樹脂內(nèi)部出現(xiàn)了數(shù)個(gè)小亮點(diǎn)（含油藻細(xì)胞）；反復(fù)使用5次后的樹脂不僅樹脂內(nèi)部出現(xiàn)了數(shù)個(gè)小亮點(diǎn)（含油藻細(xì)胞），而且還出現(xiàn)裂縫，且說明反復(fù)使用5次以后會(huì)對樹脂造成不利的影響。

3　結(jié)論

在異養(yǎng)小球藻發(fā)酵過程中使用凝膠樹脂Lx-300C能夠有效的調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中pH，添加樹脂與小球藻發(fā)酵液干質(zhì)量的增加呈現(xiàn)正相關(guān)［15］。在小球藻培養(yǎng)72 h時(shí)添加8 g/L樹脂，不會(huì)對小球藻正常發(fā)酵產(chǎn)生不利影響。此結(jié)果為異養(yǎng)小球藻培養(yǎng)工藝改良奠定了基礎(chǔ)。

反復(fù)使用5次后，凝膠樹脂顆粒出現(xiàn)了裂縫，且樹脂顆粒內(nèi)部出現(xiàn)了藻細(xì)胞，說明現(xiàn)有樹脂品種不耐高溫，在反復(fù)殺菌的過程中受到了損害，需要在以后的試驗(yàn)中尋找更適合的樹脂。

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Coupling technology of heterotrophicChlorellasp.fermentation and resin adjusting pH process

BI Shenglei1，ZHANG Chengming2，3*，ZHENG Shiwen1，JIN Hongbo1，WU Juan1，LU Long1，ZHANG Pengfei1
（1.State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology，Henan Tianguan Group Co.，Ltd.，Nanyang 473000，China；2.Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 100084，China；3.Beijing Engineering Research Center of Biofuels，Beijing 100084，China）

In order to remove the fermentation acid on the inhibition of normal growth of heterotrophicChlorellasp.，the coupling technology of heterotrophic chlorella fermentation and resin adjusting pH process was put forward.The effects of addition of resin varieties，adding time and adding amount on the fermentation process were investigated.It was found that adding the resin Lx-300C by 8 g/L could regulate the pH in neutral，the number of cells reached 7.5×108cell/ml，which was the same as that of the blank group.After fermentation，the weight of the fermentation broth was 5.59%higher than that of the blank group，the resin can be used repeatedly for four times.

heterotrophicChlorella；resin；coupling

TQ320.64

0254-5071（2016）07-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.012

2016-03-01

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃（2011BAD14B05）

畢生雷（1981-），男，工程師，碩士，主要從事生物化工方面的工作。

張成明（1983-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源。