張 慧，吳圣勇，李 娟，張璐璐，張林雅，雷仲仁

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

不同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)球孢白僵菌對(duì)西花薊馬毒力和產(chǎn)孢量的影響

張 慧，吳圣勇，李 娟，張璐璐，張林雅，雷仲仁

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】通過(guò)開展連續(xù)繼代培養(yǎng)對(duì)高毒菌株產(chǎn)孢和毒力的影響研究，獲得對(duì)西花薊馬（Frankliniella occidentalis）毒力和產(chǎn)孢量均高且穩(wěn)定的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株，進(jìn)一步提出有效防止菌株退化、優(yōu)良菌株保存和改良的方法與措施，為高效菌株的規(guī)?；a(chǎn)提供參考。【方法】室內(nèi)條件下，采用浸蟲法，用濃度為1×107個(gè)孢子/mL球孢白僵菌懸浮液處理西花薊馬初羽化成蟲，分別測(cè)定28株不同來(lái)源的菌株對(duì)西花薊馬的毒力；并將篩選出的4株高毒力菌株的分生孢子分別涂布于玉米瓊脂（CMA）培養(yǎng)基與SDAY培養(yǎng)基上，比較不同菌株以及不同培養(yǎng)基之間產(chǎn)孢量的差異，篩選出高產(chǎn)孢菌株與產(chǎn)孢培養(yǎng)基，以篩選得到的白僵菌菌株為初始菌株F0，把F0代球孢白僵菌分別接種于CMA培養(yǎng)基、添加蟬蛻的CMA培養(yǎng)基和添加西花薊馬蟲尸粉的CMA培養(yǎng)基，分別測(cè)定經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)基連續(xù)5代繼代培養(yǎng)得到的球孢白僵菌對(duì)西花薊馬成蟲的毒力，并測(cè)定產(chǎn)孢量。使用模型模擬分析球孢白僵菌菌株經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后培養(yǎng)代數(shù)與產(chǎn)孢量的關(guān)系，并對(duì)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的不同培養(yǎng)代數(shù)的白僵菌菌株的產(chǎn)孢量與其對(duì)西花薊馬的致死中時(shí)（LT50）進(jìn)行回歸分析，研究毒力與產(chǎn)孢量的相關(guān)關(guān)系?！窘Y(jié)果】經(jīng)過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定，處理5 d后，菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26對(duì)西花薊馬成蟲的校正累積死亡率均高于90%，LT50均在3 d內(nèi)，毒力顯著高于其他菌株；比較高毒力菌株在兩種產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)4株球孢白僵菌的產(chǎn)孢量存在顯著差異，菌株DZDC-9的產(chǎn)孢量顯著高于其他3株，4株菌株在CMA培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量均明顯高于SDAY培養(yǎng)基。隨著白僵菌菌株在CMA培養(yǎng)基上連續(xù)5代的繼代培養(yǎng)，菌株對(duì)西花薊馬成蟲的致病力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從第3代開始致病力顯著降低，而添加蟬蛻的CMA培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的不同培養(yǎng)代數(shù)的分生孢子對(duì)西花薊馬致病力則沒(méi)有顯著差異，添加西花薊馬蟲尸粉的CMA 培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的不同代數(shù)的分生孢子對(duì)西花薊馬致病力有一定的增強(qiáng)趨勢(shì)；通過(guò)模型可以發(fā)現(xiàn)單純以CMA培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌的產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)代數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)下降，而在培養(yǎng)基中添加蟬蛻或西花薊馬蟲尸粉白僵菌產(chǎn)孢量則隨培養(yǎng)代數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)上升，蟬蛻或西花薊馬蟲尸粉的添加對(duì)產(chǎn)孢量有一定的增強(qiáng)作用。白僵菌菌株產(chǎn)孢量與毒力存在一定正相關(guān)關(guān)系，產(chǎn)孢量相對(duì)較高的菌株對(duì)西花薊馬成蟲的致病力相對(duì)較高，致死中時(shí)短?！窘Y(jié)論】篩選得到一株對(duì)西花薊馬高效的白僵菌菌株 DZDC-9，產(chǎn)孢培養(yǎng)基中加入蟬蛻和西花薊馬蟲尸可以維持菌株生長(zhǎng)特性，延緩毒力退化趨勢(shì)；同一菌株的產(chǎn)孢量可以作為菌株毒力評(píng)價(jià)的一個(gè)指標(biāo)。

西花薊馬；球孢白僵菌；繼代培養(yǎng)；毒力；產(chǎn)孢量

0 引言

【研究意義】西花薊馬（Frankliniella occidentalis）屬纓翅目（Thysanoptera）薊馬科（Thripidae）花薊馬屬（Frankliniella），是蔬菜、花卉和棉花上的重要害蟲［1-2］，其在中國(guó)的潛在適生區(qū)多達(dá)28個(gè)?。?-4］。西花薊馬除了直接取食危害寄主植物外，還可以傳播番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）、鳳仙花壞死病毒（Impatiens necrotic spot virus，INSV）和番茄褪綠病毒（Tomato chlorotic spot virus，TCSV）等多種植物病毒［5］，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致作物絕產(chǎn)。由于西花薊馬蟲體小，善于隱蔽，對(duì)多種殺蟲劑易產(chǎn)生抗性［6-7］，難以防治［8］，有必要開發(fā)對(duì)西花薊馬高效安全的可持續(xù)防治方式。球孢白僵菌（Beauveria bassiana，簡(jiǎn)稱白僵菌），是目前應(yīng)用最廣泛的蟲生真菌，寄主范圍廣，對(duì)環(huán)境安全，對(duì)人畜無(wú)害且不殺傷天敵，在田間使用可以循環(huán)擴(kuò)散發(fā)揮侵染作用。在防治中應(yīng)用的白僵菌菌種主要來(lái)源于野外采集自然直接分離篩選的特定菌株，在人工培養(yǎng)基上，球孢白僵菌在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，菌株易發(fā)生變異，導(dǎo)致產(chǎn)孢量和對(duì)害蟲的致病性等性狀發(fā)生改變［9-11］。因此，篩選對(duì)西花薊馬高效的球孢白僵菌菌株，并提出一個(gè)有效的穩(wěn)定菌株毒力和產(chǎn)孢能力的方法，對(duì)菌株保存、改良和規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】JACOBSON等研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌等昆蟲病原真菌對(duì)西花薊馬有較好的防治效果［12-13］；SAFAVI等［14］研究認(rèn)為人工培養(yǎng)的白僵菌菌株的毒力穩(wěn)定性是白僵菌大規(guī)模生產(chǎn)及保證市售商品和田間使用的白僵菌產(chǎn)品質(zhì)量一致性的重要指標(biāo)。而異核現(xiàn)象造成的變異和線粒體基因組的異質(zhì)性或突變會(huì)造成白僵菌生產(chǎn)菌株在繼代培養(yǎng)中的退化，溫度、光照及培養(yǎng)基含水量等因素都能誘發(fā)或加劇變異的發(fā)生［15-17］；唐曉慶等研究認(rèn)為碳源、氮源及少量微量元素是白僵菌正常生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。白僵菌在培養(yǎng)過(guò)程中，如果營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足，容易衰老退化，出現(xiàn)菌落局變、菌苔生長(zhǎng)瘠薄或是菌絲徒長(zhǎng)的現(xiàn)象，導(dǎo)致分生孢子產(chǎn)率下降，從而影響球孢白僵菌對(duì)害蟲的致病力［15，18］；樊美珍等［19］研究認(rèn)為不同營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的球孢白僵菌其產(chǎn)孢水平有所不同，適宜的營(yíng)養(yǎng)條件會(huì)促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，提高其殺蟲活性；JAMES［20］研究認(rèn)為氮源是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)、氨基酸及核酸的重要成分，豐富的氮源不僅有利于白僵菌孢子的萌發(fā)，而且可以促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)并能增加菌苔厚度；SHAH等［21］研究發(fā)現(xiàn)不同白僵菌菌株有一定的寄主?；?，毒力也有一定差異，白僵菌菌株如果長(zhǎng)期侵染一種昆蟲，便能提高對(duì)該昆蟲的毒力，且從人工培養(yǎng)基上獲取的綠僵菌分生孢子的侵染相關(guān)基因的表達(dá)量顯著低于從蟲尸上獲取的分生孢子的相關(guān)基因的表達(dá)量；FURLANETO等［22］也認(rèn)為可以通過(guò)定期人工定向分離培養(yǎng)穩(wěn)定甚至提高綠僵菌菌株的毒力特性；ANSARI等［23］報(bào)道培養(yǎng)基會(huì)影響昆蟲病原真菌的特性，不同產(chǎn)孢培養(yǎng)基上綠僵菌在分生孢子毒性和產(chǎn)孢量方面有顯著差異；李會(huì)平等［24］把白僵菌菌株反復(fù)接種于桑天牛（Apriona germari）幼蟲蟲體，提高了白僵菌對(duì)桑天牛幼蟲的侵染力，而通過(guò)普通沙式培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的白僵菌對(duì)桑天牛幼蟲的侵染力下降；關(guān)兵兵等［25］研究證明白僵菌在蟬蛻誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量顯著高于PDA培養(yǎng)基，且產(chǎn)孢相關(guān)蛋白和其他蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)白僵菌繼代培養(yǎng)影響的研究主要是對(duì)產(chǎn)孢量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，沒(méi)有對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行有效擬合和分析。雖然利用白僵菌防治西花薊馬的研究報(bào)道較多，但已報(bào)道的對(duì)西花薊馬高效菌株的篩選僅局限于對(duì)原始菌株分生孢子的室內(nèi)毒力測(cè)定，關(guān)于繼代培養(yǎng)過(guò)程中菌株產(chǎn)孢量和毒力的變化及對(duì)西花薊馬具有高致病力的球孢白僵菌的復(fù)壯研究鮮有報(bào)道。目前對(duì)菌株復(fù)壯主要是人工定向培養(yǎng)，但人工定向分離培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，且西花薊馬蟲體較小，難以分離，極易污染，難以穩(wěn)定菌株毒性，影響了菌株的大規(guī)模生產(chǎn)和在西花薊馬田間防治中的應(yīng)用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)測(cè)定野外采集分離得到的28株球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的毒力，篩選出高毒力菌株，進(jìn)一步對(duì)高毒力菌株進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選和產(chǎn)孢量的比較，篩選出接種產(chǎn)孢培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)菌株；對(duì)該菌株在添加西花薊馬蟲尸粉與蟬蛻的培養(yǎng)基上連續(xù)5代繼代培養(yǎng)，測(cè)定不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的白僵菌菌株產(chǎn)孢量與毒力變化，并進(jìn)行曲線擬合和相關(guān)性分析。以期明確連續(xù)繼代培養(yǎng)與菌株毒力和產(chǎn)孢的關(guān)系，并評(píng)估蟬蛻和西花薊馬蟲尸的誘導(dǎo)是否可以穩(wěn)定高毒菌株的毒力和產(chǎn)孢量。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2015年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1供試菌株

從被感染白僵菌的溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）和亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）上分離得到的 28株球孢白僵菌菌株，斜面保存于4℃，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜害蟲組提供。試驗(yàn)時(shí)，取斜面上保存的菌株，用接種環(huán)蘸取適量孢子粉，接種于CMA產(chǎn)孢培養(yǎng)基，于26℃恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-9240A）光周期L∶D=12 h∶12 h培養(yǎng)7 d，活化備用。各菌株分離蟲體和地理來(lái)源見表1。

1.2供試蟲源

西花薊馬于 2014 年采自北京市門頭溝碧琨蔬菜種植中心，已在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用蛇豆（Trichosanthes anguina）飼養(yǎng)多代。飼養(yǎng)溫度為（26±1）℃，相對(duì)濕度為60%，光周期L∶D=14 h∶10 h。選用生長(zhǎng)一致的初羽化成蟲供試驗(yàn)所用。

1.3供試培養(yǎng)基和試劑

CMA培養(yǎng)基：玉米粉20 g·L-1、麥麩10 g·L-1、蛋白胨 5 g·L-1、KH2PO43 g·L-1、NH4NO31 g·L-1、MgSO4·7H2O 1 g·L-1、瓊脂15 g·L-1；SDAY培養(yǎng)基：葡萄糖40 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1；添加蟬蛻的CMA培養(yǎng)基：在CMA產(chǎn)孢培養(yǎng)基中添加5 g·L-1的蟬蛻粉，配制帶有蟬蛻成分的產(chǎn)孢培養(yǎng)基；添加西花薊馬蟲尸粉的CMA培養(yǎng)基：在CMA產(chǎn)孢培養(yǎng)基中分別添加5 g·L-1的西花薊馬蟲尸粉，配制帶有西花薊馬蟲尸成分的產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

試驗(yàn)所用蛋白胨購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司（凈含量250 g，國(guó)產(chǎn)），葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（500 g分析純，國(guó)產(chǎn)），KH2PO4、NH4NO3和 MgSO4·7H2O購(gòu)自北京化工廠（凈含量500 g分析純，國(guó)產(chǎn)），吐溫-80購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（500 g化學(xué)純，國(guó)產(chǎn)），瓊脂粉為北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，麥麩和玉米粉為市售，蟬蛻粉購(gòu)自北京同仁堂藥店，西花薊馬蟲尸粉為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的健康西花薊馬成蟲磨碎得到。

1.4高毒力球孢白僵菌的篩選

測(cè)定已活化白僵菌菌株的孢子萌發(fā)率，萌發(fā)率在90%以上的菌株可用于菌株篩選試驗(yàn)。將各菌株分生孢子分別加入 0.05%的吐溫-80溶液中配制成1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，對(duì)生長(zhǎng)一致的西花薊馬初羽化成蟲采用浸蟲法進(jìn)行毒力測(cè)定。

1.5高產(chǎn)孢菌株和產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選

把篩選得到的高毒力球孢白僵菌分生孢子分別涂布于SDAY和CMA培養(yǎng)基，比較不同白僵菌以及不同培養(yǎng)基之間產(chǎn)孢量的差異，篩選高產(chǎn)孢菌株與產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

表1　不同菌株分離蟲體及地理來(lái)源Table 1 The geographical origin and host of different strains

1.6不同培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)

把篩選出的對(duì)西花薊馬成蟲有高致病力且產(chǎn)孢量高的白僵菌菌株（DZDC-9）定義為原始菌株F0代，F(xiàn)0代分別接種于CMA培養(yǎng)基獲得F1代，F(xiàn)1代再接種于CMA培養(yǎng)基獲得F2代，以此類推共得到5代（F1—F5）。同樣的方法，把F0代球孢白僵菌分別接種于添加蟬蛻的 CMA培養(yǎng)基和添加西花薊馬蟲尸粉的CMA培養(yǎng)基，獲得C1—C5代和X1—X5代球孢白僵菌，分別對(duì)經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)得到的 F1—F5、C1—C5和 X1—X5代球孢白僵菌對(duì)西花薊馬成蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，并測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.7球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的室內(nèi)毒力測(cè)定

用恒定CO2氣流將西花薊馬麻醉，隨后將其倒入配制好的孢子懸浮液中，浸泡5 s，倒于濾紙上，并吸去多余孢子懸浮液，然后用軟毛刷將試蟲挑入已放入一根蛇豆的養(yǎng)蟲管（高20 cm，直徑3 cm）中，每個(gè)養(yǎng)蟲管接蟲20頭，用紗布封口。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，以0.05%吐溫-80溶液作為對(duì)照。放入溫度為（26±1）℃，相對(duì)濕度為60%，光周期L∶D=14 h∶10 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察西花薊馬的死亡情況，記錄死亡數(shù)，并將死亡的成蟲挑出，置于底部鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，若長(zhǎng)出白色菌絲或孢子則為有效侵染致死，連續(xù)觀察5 d［26］。

為了確定沉降到西花薊馬體表的分生孢子數(shù)，將西花薊馬浸于濃度為1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液中，5 s后挑取10只西花薊馬放在濾紙上，并吸干多余液體，然后放入含有20 mL滅菌0.05%吐溫-80的50 mL錐形瓶中，并放入搖床中，125 r/min振蕩，使孢子從西花薊馬體表洗脫，2 h后吸取100 μL液體并均勻涂抹于CMA培養(yǎng)基上，于（26±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后計(jì)數(shù)平板上成菌落數(shù)（CFU），粗略作為西花薊馬體表的孢子數(shù)［27］。

1.8球孢白僵菌產(chǎn)孢量測(cè)定

將球孢白僵菌的分生孢子配制成 1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，取1 mL涂布于培養(yǎng)基，置于溫度為（26±1）℃，相對(duì)濕度為60%，光周期L∶D= 14 h∶10 h的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，待培養(yǎng)基中長(zhǎng)出淡黃色孢子粉時(shí)，用直徑3.5 mm的打孔器在平板中央到邊緣1/2處打下孢子，將打下的孢子放入內(nèi)含10 mL 0.05%吐溫-80溶液的15 mL離心管中，渦旋振蕩均勻，吸取適量溶液置于血球計(jì)數(shù)板上，靜置1 min后計(jì)數(shù)，換算成每cm2所含分生孢子數(shù)量。每板分別取3處打下菌落塊，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)平板作為重復(fù)。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用POLO軟件計(jì)算白僵菌對(duì)西花薊馬的致死中時(shí)（LT50），用Abbott公式計(jì)算校正累積死亡率，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Tukey’s（HSD）顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1對(duì)西花薊馬高毒力白僵菌菌株的篩選

通過(guò)計(jì)數(shù)平板上成菌落數(shù)可知，試驗(yàn)用的西花薊馬在濃度為1×107個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液中浸泡5 s后其體表的孢子數(shù)約為（3.76±0.08）×103個(gè)孢子/頭，由于分生孢子無(wú)法全部洗脫，該測(cè)定結(jié)果會(huì)略小于實(shí)際孢子數(shù)。經(jīng)過(guò)室內(nèi)毒力測(cè)定，在1×107個(gè)孢子/mL的接種濃度下，各白僵菌菌株對(duì)西花薊馬成蟲均表現(xiàn)出一定的致病力，以第5天的校正累積死亡率作為菌株毒力比較的指標(biāo)，可以看出不同菌株校正累積死亡率差異顯著（F=11.290，df=27，83；P＜0.01），其中菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26對(duì)西花薊馬第5天的校正累積死亡率均在90%以上。不同菌株對(duì)西花薊馬成蟲的致病力差異顯著（F=85.509，df=27，83；P＜0.01），LT50在2—6 d（圖1），均明顯低于對(duì)照（10.25±1.16）d，其中菌株 DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8和SZ-26對(duì)西花薊馬的LT50在3 d以內(nèi)。綜合考慮 LT50和校正累積死亡率，菌株DZDC-9、GZGY-5、WLMQ1-8、SZ-26對(duì)西花薊馬致病較快、致病力較強(qiáng)，顯著優(yōu)于其他菌株。

圖1　28株球孢白僵菌對(duì)西花薊馬成蟲致死中時(shí)和第5天校正累積死亡率Fig. 1 LT50and corrected cumulative mortality of 5 days post treatment of 28 strains against adult F. occidentalis in the laboratory

2.2高毒力球孢白僵菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量

在兩種產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，4株球孢白僵菌的產(chǎn)孢量均存在顯著差異（CMA培養(yǎng)基：F=334.457，df=2，8；P＜0.01；SDAY培養(yǎng)基：F=212.586，df=2，8；P＜0.01），但無(wú)論采用哪種產(chǎn)孢培養(yǎng)基，菌株 DZDC-9的產(chǎn)孢量均顯著高于其他3株。對(duì)于同一菌株，采用不同產(chǎn)孢培養(yǎng)基在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行產(chǎn)孢量測(cè)定，結(jié)果顯示4株菌株在CMA培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量均明顯高于SDAY培養(yǎng)基，所以選擇CMA培養(yǎng)基為接種產(chǎn)孢培養(yǎng)基，菌株DZDC-9為繼代培養(yǎng)菌株（圖2）。

表2　不同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌菌株對(duì)西花薊馬成蟲LT50的影響Table 2 LT50of different generations of continuous subculture of B. bassiana growing on different culture media against adult F. occidentalis

圖 2 4株對(duì)西花薊馬高毒力的球孢白僵菌在 CMA和 SDAY產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量Fig. 2 Conidial production of 4 highly virulent strains against adult F. occidentalis growing on SDAY and CMA media

2.3不同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)的白僵菌菌株對(duì)西花薊馬的毒力

各不同培養(yǎng)代數(shù)白僵菌菌株對(duì)西花薊馬均表現(xiàn)出較好的致病效果。經(jīng)過(guò)CMA培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的各菌株不同培養(yǎng)代數(shù)對(duì)西花薊馬的致病力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，從第 3代開始致病力顯著降低， LT50由第1代的2.55 d上升至第5代的 3.40 d，延長(zhǎng)33.33%；西花薊馬的校正累積死亡率也由第1代的93.62%降至第5代的65.96%；添加蟬蛻的CMA培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的各菌株不同培養(yǎng)代數(shù)對(duì)西花薊馬的致病力則沒(méi)有顯著差異；而添加西花薊馬蟲尸粉的 CMA 培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的各菌株不同培養(yǎng)代數(shù)對(duì)西花薊馬的致病力有一定的增強(qiáng)趨勢(shì)，LT50由第1代的2.80 d降至第5代的2.36 d，降低15.7%，對(duì)西花薊馬的校正累積死亡率沒(méi)有變化（表2、表3）。

2.4不同繼代培養(yǎng)的白僵菌菌株產(chǎn)孢量變化

將菌株DZDC-9在3種培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)5代，對(duì)于每種培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量和培養(yǎng)代數(shù)擬合曲線 y= a ln（x）+b，y代表產(chǎn)孢量（108個(gè)孢子/cm2），x代表培養(yǎng)代數(shù)；a與b為建模參數(shù)。菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)代數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)或下降趨勢(shì)（圖 3），在CMA培養(yǎng)基中菌株產(chǎn)孢量與繼代培養(yǎng)代數(shù)符合模型y = -1.657ln（x）+8.0222（R2=0.9456）。隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加呈現(xiàn)一定下降趨勢(shì)，而當(dāng)在CMA培養(yǎng)基中添加0.5%蟬蛻或0.5%西花薊馬蟲尸粉時(shí)，菌株產(chǎn)孢量與繼代培養(yǎng)代數(shù)符合模型y=1.1574ln（x）+10.58（R2= 0.9972）與y=1.1364ln（x） +10.232（R2=0.9846）。產(chǎn)孢量則隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定。菌株DZDC-9繼代培養(yǎng)之后，產(chǎn)孢量能很好地?cái)M合方程 y=aln（x）+b，其 R2均＞0.94。對(duì)相同培養(yǎng)代數(shù)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株產(chǎn)孢量進(jìn)行方差分析（表4），可見在CMA培養(yǎng)基中添加0.5%蟬蛻或者 0.5%西花薊馬蟲尸粉對(duì)白僵菌產(chǎn)孢量沒(méi)有顯著性差異，但明顯高于菌株在 CMA培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量。

表3　不同培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌對(duì)西花薊馬成蟲死亡率的影響Table 3 Corrected cumulative mortality of different generations of continuous subculture of B. bassiana growing on different culture media against adult F. occidentalis

表4　球孢白僵菌菌株在不同培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)5代產(chǎn)孢量的變化Table 4 Conidial production of the 1st to 5th generations of continuous subculture of strain DZDC-9 on different media

2.5產(chǎn)孢量與毒力相關(guān)性分析

將不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的不同培養(yǎng)代數(shù)白僵菌菌株產(chǎn)孢量與其對(duì)西花薊馬的LT50進(jìn)行回歸分析，擬合曲線如圖4所示，y=-0.831ln（x）+4.6694，y代表LT50，x代表產(chǎn)孢量（1×108個(gè)孢子/cm2），相關(guān)系數(shù)為0.7206；產(chǎn)孢量與毒力存在一定的相關(guān)性，產(chǎn)孢量相對(duì)較高的菌株對(duì)西花薊馬成蟲的致病力相對(duì)較高，LT50值相對(duì)較小，因此，對(duì)于同一菌株可以根據(jù)其產(chǎn)孢量的變化判斷其在不同培養(yǎng)條件下相對(duì)毒力的變化。

圖3　球孢白僵菌DZDC-9在不同培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)與產(chǎn)孢量的關(guān)系Fig. 3 Relationship between subcultures and conidial production of B. bassiana strain DZDC-9 obtained from different media

圖4　球孢白僵菌DZDC-9產(chǎn)孢量與致病性的相關(guān)性Fig. 4 Relationship between virulence against adult F. occidentalis and conidial production of B. bassiana strain DZDC-9

3 討論

白僵菌作為一種生防真菌，在農(nóng)業(yè)害蟲防治中具有重要的地位，白僵菌菌株在繼代培養(yǎng)中會(huì)出現(xiàn)菌株變異和退化現(xiàn)象，高毒力菌種選育和毒力穩(wěn)定性保持是白僵菌生物防治應(yīng)用的前提，但如何能夠長(zhǎng)久地維持其毒力和產(chǎn)孢能力則是白僵菌在應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)。經(jīng)過(guò)篩選得到4株對(duì)西花薊馬有高毒力的菌株，通過(guò)對(duì)這 4株高毒力菌株產(chǎn)孢量比較發(fā)現(xiàn)，菌株DZDC-9的產(chǎn)孢量顯著高于其他3株，各不同高毒力菌株在CMA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量顯著高于SDAY培養(yǎng)基，這與張璐璐等［28］在白僵菌大規(guī)模生產(chǎn)中的結(jié)果類似。通過(guò)對(duì)白僵菌菌株的繼代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用CMA培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的白僵菌分生孢子對(duì)西花薊馬的毒力和產(chǎn)孢量均呈下降趨勢(shì)，且從第3代開始呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，而當(dāng)在CMA培養(yǎng)基中添加適量的蟬蛻或者西花薊馬蟲尸粉時(shí)則能增加產(chǎn)孢量，穩(wěn)定白僵菌菌株毒力。菌株發(fā)生變異的主要原因是菌株本身遺傳物質(zhì)改變。菌株不同基因型核比例受環(huán)境條件尤其是培養(yǎng)條件的影響，張志光等［29］研究發(fā)現(xiàn)自然界中的白僵菌是以異核形式存在的，但是異核體不穩(wěn)定，可以通過(guò)人工培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法改變異核體內(nèi)核的比例；蔡國(guó)貴等［18］研究發(fā)現(xiàn)白僵菌菌株在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)則容易變異，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加松毛蟲和木毒蛾蟲尸粉時(shí)則可以有效控制白僵菌對(duì)松毛蟲和木毒蛾的毒力退化。不同培養(yǎng)基通過(guò)影響白僵菌菌株酶的表達(dá)水平引起菌株毒力的變化，李會(huì)平等［30］研究發(fā)現(xiàn)白僵菌菌株產(chǎn)酶能力與其對(duì)桑天牛幼蟲的毒力呈正相關(guān)關(guān)系，而培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件會(huì)影響白僵菌菌株的產(chǎn)酶能力。經(jīng)過(guò)添加蟬蛻和西花薊馬蟲尸粉繼代培養(yǎng)得到的孢子粉的毒力能夠穩(wěn)定遺傳并略有增強(qiáng)，這可能是由于昆蟲表皮成分中含有能夠誘導(dǎo)水解酶產(chǎn)生的特殊基質(zhì)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)提高了白僵菌菌株的產(chǎn)酶能力，進(jìn)而增強(qiáng)了菌株毒力。

本研究通過(guò)模型直觀模擬了CMA培養(yǎng)基與添加蟬蛻、西花薊馬蟲尸的CMA培養(yǎng)基上，球孢白僵菌菌株DZDC-9經(jīng)過(guò)連續(xù)5代繼代培養(yǎng)產(chǎn)孢量和培養(yǎng)代數(shù)的相關(guān)關(guān)系，并對(duì)相同代數(shù)的不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。通過(guò)模型可以發(fā)現(xiàn)添加蟬蛻或西花薊馬蟲尸粉的培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)得到的白僵菌對(duì)西花薊馬的產(chǎn)孢量和毒力有一定的增強(qiáng)作用。單純以 CMA培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌產(chǎn)孢量隨培養(yǎng)代數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)下降，而在培養(yǎng)基中添加蟬蛻或西花薊馬蟲尸粉白僵菌產(chǎn)孢量則隨培養(yǎng)代數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)上升，已有報(bào)道表明蟬蛻等可以誘導(dǎo)白僵菌產(chǎn)孢相關(guān)蛋白的表達(dá)［31］，從而提高白僵菌菌株的產(chǎn)孢量。蟬蛻和西花薊馬的蟲尸粉中含有大量的幾丁質(zhì)，可以促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生，而其中蘊(yùn)含的磷脂與蛋黃素可以促進(jìn)分生孢子的萌發(fā)，有利于球孢白僵菌的有效侵染，穩(wěn)定甚至增強(qiáng)菌株毒性［32］。經(jīng)過(guò)西花薊馬蟲尸粉培養(yǎng)得到的白僵菌孢子粉對(duì)西花薊馬的毒力略高于經(jīng)過(guò)蟬蛻培養(yǎng)得到的孢子粉對(duì)西花薊馬的毒力。胡景江等［33］通過(guò)研究白僵菌胞外蛋白酶與其毒力的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加蟲尸粉后白僵菌產(chǎn)酶水平提高。這可能是白僵菌經(jīng)過(guò)西花薊馬蟲尸粉培養(yǎng)后對(duì)西花薊馬的?；愿鼜?qiáng)，同時(shí)西花薊馬蟲尸內(nèi)含有更多的蛋白質(zhì)和某些特殊營(yíng)養(yǎng)成分更適合白僵菌的生長(zhǎng)（或刺激蛋白酶合成所需），有利于菌株的復(fù)壯。因此，可在培養(yǎng)基中添加適量的蟲尸粉和蟬蛻粉，以提高菌株的活力，但培養(yǎng)基中蟲尸粉和蟬蛻粉的含量還有待于進(jìn)一步研究。本研究在室內(nèi)條件下對(duì)其他 3株高效球孢白僵菌菌株 SZ-26、WLMQ-1-8、GZGY-5進(jìn)行連續(xù)5代繼代培養(yǎng)，采用相同方法對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)壯，結(jié)果也顯示連續(xù)復(fù)壯5代后，蟲尸粉和蟬蛻粉復(fù)壯法菌株產(chǎn)孢和毒力恢復(fù)效果最好。綜合考慮，在產(chǎn)孢培養(yǎng)基中添加適量的蟲尸粉和蟬蛻粉對(duì)退化菌株的產(chǎn)孢和毒力恢復(fù)效果較好且有很好的穩(wěn)定性。

李農(nóng)昌等［34］對(duì)不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下得到的白僵菌孢子粉進(jìn)行產(chǎn)孢量和毒力的比較，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)孢量與毒力之間存在相關(guān)性。本研究對(duì)白僵菌菌株產(chǎn)孢量與毒力進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢量與毒力之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系。同一菌株產(chǎn)孢量可以作為菌株毒力篩選評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)西花薊馬有高毒力的白僵菌菌株的篩選和連續(xù)繼代培養(yǎng)，篩選出一株對(duì)西花薊馬高毒力的菌株DZDC-9，通過(guò)曲線模擬對(duì)球孢白僵菌繼代培養(yǎng)與菌株產(chǎn)孢量和毒力進(jìn)行了相關(guān)分析，產(chǎn)孢培養(yǎng)基中加入蟬蛻和西花薊馬蟲尸粉能夠維持菌株產(chǎn)孢特性，延緩毒力退化趨勢(shì)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Influence of Subculture on Virulence to Frankliniella occidentalis and Conidial Production of the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana

ZHANG Hui， WU Sheng-yong， LI Juan， ZHANG Lu-lu， ZHANG Lin-ya， LEI Zhong-ren
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193）

【Objective】The objective of this study is to assess the capability of the Beauveria bassiana against Frankliniella occidentalis in the field， and explore the influence of subculture on virulence and conidial production of the B. bassiana， propose an effective method for preventing the retrogression during successive subculture， and provide a basis for the large-scale production technology of B. bassiana. 【Method】 The virulence of 28 fungal strains to adult F. occidentalis was evaluated by soaking method with B. bassiana concentration of 1×107conidia/mL in the laboratory. The adults were dipped for 5 s in the conidial suspension. Conidial production of the 4 high virulent strains was measured on corn meal agar （CMA） medium and sabouraud dextrose agar yeast （SDAY） medium， screening high conidial production strain and spore production medium by comparing conidial production of different strains on different media. Subsequently， strain DZDC-9 was subcultured on three media （CMA medium， CMA medium with cicada exuviae， and CMA medium with F. occidentalis cadaver powder） to compare its virulence and conidial production over five subcultures. The relationship between conidial production and virulence was analyzed. 【Result】Among 28 strains of entomopathogenic fungi B. bassiana tested for virulence against F. occidentalis in laboratory bioassays， strains DZDC-9， GZGY-5，WLMQ1-8 and SZ-26 were found as the most potent. The corrected cumulative mortalities were over 90% after 5 days， and LT50＜3 d. Conidial production obtained from the CMA medium of each strain was higher than from SDAY medium， and strain DZDC-9 had the higher conidial production among the four strains. The results demonstrated that the virulence of strain DZDC-9 declined with successive subculture. However， when the strain was subcultured on the CMA medium with 0.5% cicada exuviae or 0.5% F. occidentalis cadaver powder as an additive， the virulence increased with successive subculture. Conidial production was not significantly different between the same generation subculture on CMA medium with cicada exuviae and CMA medium with F. occidentalis cadaver powder， but they were significantly greater than conidial production obtained from CMA medium. A positive correlation was found between sporulation and virulence of B. bassiana conidia under different media and culture conditions. 【Conclusion】The potential of B. bassiana strain DZDC-9 for the control of F. occidentalis was studied， and proposed an effective method for stabilizing the virulence and sporulation of B. bassiana. Conidial production could be used as an indicator for virulence evaluation.

Frankliniella occidentalis； Beauveria bassiana； subculture； virulence； conidial production

2016-03-28；接受日期：2016-05-20

國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25-B-07）、韭菜安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究及科技示范基地建設(shè)（Z151100001215009）聯(lián)系方式：張慧，E-mail：huizhang0926@sina.com。通信作者雷仲仁，Tel：010-62815930；E-mail：leizhr@sina.com