李 林，艾 陽，謝正露，曹 洋，張源淑

（南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院/農業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，南京 210095）

熱應激狀態(tài)下泌乳奶牛通過激活GHIGF-I軸增強糖異生變化

李 林，艾 陽，謝正露，曹 洋，張源淑

（南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院/農業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，南京 210095）

【目的】選取分娩1周后的泌乳期荷斯坦奶牛6頭，提前適應期1周后，正式飼喂從2013年6月29日至8月5日，總共35 d（5周），使泌乳奶牛處于熱應激狀態(tài)。進而檢測泌乳奶牛乳產量及乳蛋白含量，血液中生長激素（GH）、胰島素樣生長因子（IGF-I）、葡萄糖以及肝臟中熱休克蛋白70（HSP70）和糖異生作用的變化情況，擬從GH-IGF-I軸的角度闡明泌乳奶牛發(fā)生熱應激時對糖異生作用及乳品質下降的機制。為進一步揭示奶牛熱應激的發(fā)生機理及控制奶牛熱應激的發(fā)生提供理論依據。【方法】分別統(tǒng)計第1—5周泌乳奶牛的產奶量及分析乳蛋白含量，并采集泌乳奶牛頸靜脈血液和進行活體采取肝臟組織的方法，檢測血液中葡萄糖和GH、IGF-I的含量，采用實時熒光定量PCR （qRT-PCR）技術對奶牛肝臟組織中HSP70和糖異生的關鍵酶丙酮酸羧化酶（PC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）以及生長激素受體（GHR）、胰島素樣生長因子受體（IGFR）進行檢測?！窘Y果】在35 d的飼喂過程中，日間平均氣溫在32℃以上的持續(xù)時間達25 d，且最高溫度為38℃，高溫持續(xù)時間大于72 h，即此氣候條件下奶牛處于一個熱應激狀態(tài)。隨著泌乳奶牛熱應激程度的不斷加深，從第1周到第5周產奶量和乳蛋白含量都有不同程度的下降。通過比較第5周和第1周泌乳奶牛肝臟中HSP70的表達，發(fā)現第5周HSP70的表達量極顯著高于第1周。檢測血液中GH、IGF-I以及葡萄糖的含量，發(fā)現在第5周的時候其含量均高于第1周且差異顯著（P＜0.05）；檢測泌乳奶牛肝臟組織中PC和PEPCK的表達水平，發(fā)現第5周顯著高于第1周（P＜0.05）；通過檢測第5周與第1周肝臟組織中GH和IGF-I受體的表達水平，發(fā)現GHR和IGFR同樣上調，其中IGFR顯著上調（P ＜0.05）?！窘Y論】隨著泌乳奶牛熱應激的程度的不斷加深，血液中的葡萄糖含量顯著升高，其可能是由于垂體分泌的GH刺激肝臟產生更多的IGF-I，即通過GHIGF-I軸上調肝臟糖異生途徑關鍵酶的表達，使糖異生途徑處于激活狀態(tài)。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前體物被過多的用來進行糖異生作用，增加血液中葡萄糖含量，維持機體正常供能所致。

泌乳奶牛；熱應激；GHIGF-I軸；生長激素（GH）；糖異生作用

0 引言

【研究意義】隨著全球氣候溫室效應的不斷加劇及高集中化的動物生產方式，熱應激對動物生產造成了嚴重的不利影響，其作為機體處于濕熱環(huán)境下的一種非特異性反應，當氣溫高于 32℃或溫濕指數（temperature-humidity index， THI）高于72時動物就會發(fā)生熱應激反應［1-2］。目前，熱應激已經成為中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中重要的疾病之一。熱應激不僅會導致奶牛生產性能和繁殖能力降低，還能引起一些血液激素及熱休克蛋白70（HSP70）濃度的變化。【前人研究進展】宋代軍等［3］通過對不同泌乳階段奶牛生產性能、HSP70濃度的研究，發(fā)現熱應激時各泌乳階段奶牛的產奶量均顯著低于非熱應激期，且隨著熱應激時間的延長，各泌乳階段奶牛的產奶量有逐漸降低的趨勢，并且在泌乳前、中、后期奶牛血清HSP70濃度在熱應激期時均明顯高于非熱應激期。也有研究報道，當動物機體處于熱應激狀態(tài)時，其下丘腦-垂體-腎上腺軸會變得異?；钴S，并且使促生長激素釋放激素（GHRH）、生長激素（GH）等激素的含量升高，進而促進糖原、脂肪分解和糖異生過程［4］。艾陽等［5］通過研究夏季飼養(yǎng)的泌乳奶牛，發(fā)現當奶牛處于南京這種高溫梅雨季節(jié)狀態(tài)下時，可引起泌乳奶牛發(fā)生熱應激反應，表現為乳產量和乳品質下降。GH是參與反芻動物泌乳和合成代謝的重要激素，在動物體內，GH通過與其受體結合發(fā)揮作用，具有維持體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和免疫等生理功能。研究發(fā)現，GH可以通過促進腺泡的發(fā)育，維持泌乳量［6］，其還可以刺激肝臟合成分泌大量的胰島素樣生長因子（IGF-I）［7-8］。并且有研究發(fā)現血液中IGF-I含量與泌乳量呈正相關［9］。糖異生是指由非糖物質轉化為葡萄糖或糖原的過程，其過程主要發(fā)生在肝細胞中，其中丙酮酸羧化酶（PC）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是調控糖異生的關鍵酶。有學者提出泌乳奶牛糖異生過程會受到 GH-IGF-I的調節(jié)，當發(fā)生熱應激時血液中 GH、IGF-I水平升高并且會上調肝臟的糖異生途徑［10］。【本研究切入點】目前，國內外對奶牛熱應激機理的研究已有大量的文獻報道，并且對生產性能方面也做了大量的研究，表明其會降低泌乳奶牛的乳產量及乳品質，但在糖異生調控方面的機理報道相對較少?！緮M解決的關鍵問題】本試驗以早期泌乳奶牛為研究對象，經過南京夏季6月—8月高溫高濕氣候條件下飼喂。比較研究不同時期泌乳奶牛乳產量、乳蛋白含量，血液中激素水平以及糖異生關鍵酶指標的變化，擬從 GH-IGF-I軸的角度闡明泌乳奶牛發(fā)生熱應激時對糖異生作用及乳品質下降的機制。為進一步揭示奶牛熱應激的發(fā)生機理及控制奶牛熱應激的發(fā)生提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器

SN-695型智能放免γ測量儀（上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠）；RT-6000型酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。MIKRO-22R型高速冷凍離心機（德國Andreas Hettich GmbH8 CO.KG產品）；組織勻漿器（瑞士 Kinematica AG）；核酸濃度測定儀（德國Eppendorf Biophotometer），MyiQ2 Real-time PCR 儀（Bio Rad，美國）等。

SYBR Green 熒光酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）；P101型RNA反轉錄試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）。生長激素放射免疫分析試劑盒（北方生物技術研究所，北京）；胰島素樣生長因子-1ELISA試劑盒（中國朗頓生物科技有限公司，上海）。

1.2試驗動物與處理

分娩一周后的早期泌乳期荷斯坦奶牛6頭（體重（490±7）kg），飼養(yǎng)于南京農業(yè)大學江浦畜牧獸醫(yī)實驗站（北緯32°93′，東經119°82′）。適應期1周后，對奶牛進行試驗飼料飼喂，飼喂時間從2013年6月 29日至2013年8月5日南京暑熱期間，試驗周期為35 d（共5周）。采用Cornell-Penn-Miner System（NRC 2001）設計基礎日糧，飼料配方及具體營養(yǎng)成分見表1。6頭奶牛均飼養(yǎng)于開放式牛舍，期間自由飲水，每日飼喂3次的同時擠奶（時間為早4：00，中午12：00和晚18：00），并記錄每日產奶量。

表1　日糧營養(yǎng)成分Table 1 The formulation of dietary （%）

1.3氣溫測定

試驗期間每日氣溫紀錄采用室溫檢測儀，于上午10：00和下午6：00 進行2次測定，2次氣溫平均值記為每天日間氣溫，試驗期間日間氣溫介于26—38℃之間。

1.4產奶量和乳成分測定

試驗期間每天在奶牛進食后采用自動擠奶機進行擠奶，早、中、晚共3次并分別稱重，總和即為每日產奶量。期間每周五采集全天乳樣，按體積4∶3∶3將早、中、晚奶樣混合加入200 μL飽和重鉻酸鉀作為全天乳樣，送至南京衛(wèi)崗乳業(yè)檢測中心進行乳成分檢測。

1.5血液樣品的采集及葡萄糖含量檢測

分別于第1天和第35天對泌乳奶牛進行頸靜脈采血。采用真空抗凝管于奶牛進食2 h后收集其頸靜脈血液，以3 000 r/min離心15 min，取上清。并將收集的頸靜脈血漿樣品送至南京軍區(qū)總醫(yī)院血液科檢測葡萄糖的含量。

1.6血液中GH、IGF-I含量的測定

1.6.1血液中GH含量測定 通過125I-GH放射免疫分析藥盒測定泌乳奶牛血液中GH的含量（測定范圍1—50 ng·mL-1；靈敏度≤0.5 ng·mL-1，精密度：批內變異系數＜10%，批間變異系數＜15%，一抗為兔抗），測定方法嚴格按照試劑盒說明書進行。SN-695型智能放免γ-測量儀檢測計算出血液中GH的含量。

1.6.2血液中IGF-I含量測定 采用ELISA法檢測，按試劑盒說明書進行操作（精密度：批內變異系數＜9%，批間變異系數＜11%）。以空白孔調零，450 nm波長處依次測定各孔的吸光度值（OD值），并計算出血液中IGF-I的含量。

1.7肝臟組織樣品的采集

在采集血液樣品時對奶牛肝臟進行活體穿刺采樣。兩次采集的肝臟組織樣品均先用預冷的生理鹽水清洗 3次，然后迅速置于液氮中凍存，最后轉到-80℃保存待測。

1.8肝臟中相關蛋白基因mRNA表達檢測

1.8.1總RNA的提取及反轉錄 取80 mg左右的肝臟組織樣本，勻漿機徹底勻漿后采用Trizol抽提法提取總RNA。紫外比色法測定所提取RNA的濃度及純度。選取A260/A280在1.8—2.0之間的總RNA，兩步法進行反轉錄，得到cDNA。

1.8.2引物設計及合成 根據 GenBank上牛的HSP70、GHR、IGFR、PC、PEPCK及GADPH的基因序列由Primer Premier 5軟件自行設計（序列見表2），由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。

表2　Real-time PCR所用引物序列及參數Table 2 The primers sequence and parameters for real-time PCR

圖1　試驗期間每日平均氣溫Fig. 1 Average daily temperature during the experiment

1.8.3肝臟中相關蛋白Real-time PCR檢測 對上述cDNA進一步采用Real-time PCR Sybr Green染料法對相關蛋白基因進行相對定量分析。反應在 MyiQ2 Real-time PCR儀上進行，20 μL定量反應體系中包括，熒光酶SYBR-Green 10 μL，10 pmol·μL-1基因引物2 μL，cDNA 模板2 μL，滅菌水6 μL。以最小的Ct值和最高的熒光值及溶解曲線不出現非特異性峰為標準，分別優(yōu)化退火溫度、引物濃度。主反應條件為：95℃變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品至少做3個重復，GADPH作為內參基因。

1.9數據統(tǒng)計及分析

采用SPSS16.0軟件進行獨立樣本t檢驗。結果以平均數±標準誤表示，組間差異用t檢驗，判斷有無顯著性差異。

2 結果

2.1試驗期間氣溫變化

由圖1可知，經過前期的適應期后，從第1天開始，日間平均氣溫劇烈上升，總體保持在32℃以上，在35 d（共5周）的試驗期中，日間平均氣溫32℃以上持續(xù)時間達25 d，占試驗總天數的68.5%。整個試驗期間最高溫度為38℃，共計2 d。

2.2熱應激對肝臟中HSP70 基因表達的影響

通過檢測第 1周和第 5周泌乳奶牛肝臟中HSP70基因的表達，結果如圖2。由圖2可知在第5周的時候奶牛肝臟內 HSP70 基因表達量顯著高于第1周。

2.3熱應激對泌乳奶牛乳產量及乳蛋白含量的影響

由圖3可知，從第1周開始，日平均產奶量呈現出一個下降趨勢，到第4周的時候日平均產奶量達到最低，第5周的時候有所上升，但乳產量隨著試驗期間溫度的升高總體呈下降趨勢。日間乳蛋白平均含量在 1—5周內隨著溫度的升高也呈現出總體的下降趨勢。

2.4熱應激對血液中葡萄糖及相關激素的影響

通過檢測泌乳奶牛血液中葡萄糖、GH、IGF-I激素的含量，結果見表3。由表3可知第5周時奶牛由于發(fā)生熱應激作用血液中葡萄糖、GH和IGF-I含量均高于第1周，且差異顯著。

2.5熱應激對糖異生關鍵酶基因表達的影響

通過檢測第1周和第5周泌乳奶牛肝臟糖異生關鍵酶基因的表達含量（圖4）。由圖4可知第5周時奶牛肝臟組織中PC和PEPCK 的mRNA表達均高于第1周，且差異顯著。

圖2　肝臟中HSP70 mRNA的表達變化Fig. 2 Changes of HSP70 mRNA expression in liver （n=6）

圖3　泌乳奶牛乳產量及乳蛋白含量Fig. 3 Lactation cows milk yield and milk protein content （n=6）

圖4　肝臟中PC和PEPCK mRNA的表達變化Fig. 4 Changes of PC and PEPCK mRNA expressionin liver （n=6）

圖5　肝臟中GHR和IGFR mRNA的表達變化Fig. 5 Change of GHR and IGFR mRNA expression in liver （n=6）

2.6熱應激對肝臟中GHR和IGFR 基因表達的影響

通過檢測第1周和第5周泌乳奶牛肝臟中GHR、IGFR 基因的表（圖5）。圖5可知，隨著奶牛熱應激的發(fā)生，在第5周的時候肝臟內GHR 、IGFR表達均高于第1周，且IGFR顯著高于第1周。

表3　血液中相關生化指標Table 3 Blood biochemical indices （n=6）

3 討論

通常當溫度超過耐熱溫度時奶牛就會發(fā)生熱應激現象，并且隨著溫度的升高奶牛也越易發(fā)生熱應激［11］。但也有研究發(fā)現，奶牛的熱應激一般除了環(huán)境因素外，還會受到其他因素的影響，包括其自身的泌乳狀態(tài)［12］、管理方式［13］、飼養(yǎng)條件［14］等。目前，按照THI的計算公式：THI=0.81Td+（0.99Td-14.3）RH+ 46.3，若以濕度為0作前提，當溫度達到32℃時，THI最低值為72；這一數值即為奶牛發(fā)生熱應激的最低THI。本試驗通過對南京地區(qū)夏季6月至8月氣溫條件進行了監(jiān)測，得出整個試驗期間牛舍的溫度數據，結果發(fā)現，在35 d的試驗期中，日間平均氣溫在32℃以上的持續(xù)時間達25 d，且最高溫度為38℃。高溫持續(xù)時間遠遠超過72 h，即此氣候條件下奶牛處于一個熱應激狀態(tài)。在熱應激條件下，機體內分泌機能紊亂，直接影響奶牛的泌乳性能導致產奶量下降。李建國［15］研究發(fā)現，當發(fā)生熱應激時，泌乳前、中、后期奶牛的產奶量分別降低了 19.3%、15.88%、13.83%。RAVAGNOLO等［16］報道，當THI＞72時，THI每升高 1個單位，奶牛的產奶量降低0.2 kg。本試驗中，通過統(tǒng)計5周的產奶量，發(fā)現隨著熱應激時間的延長，其產奶量及乳蛋白含量都有不同程度的下降，與前人的研究一致。

HSP70是一種重要的分子伴侶，ALDERMAN等［17］報道，HSP70與環(huán)境溫濕變化密切相關，在生物熱耐受中起著主要作用。當環(huán)境變化產生應激時，產生的 HSP70可以增強細胞對下一次有害損傷的耐受程度，維持細胞的正常生理功能代謝，提高細胞生存率［18-19］。陳強［20］等報道，熱應激狀態(tài)時，奶牛體內HSP70基因的表達量會增加。本試驗中，HSP70基因表達量在第5周時極顯著高于第1周。結果提示，隨著奶牛熱應激時間的增長，泌乳奶牛對熱應激過程抵抗損失的能力也更強。

有研究認為，血液中的代謝產物對機體生理狀況變化十分敏感，可以反映動物機體的代謝變化和組織的生理功能［21］。奶牛作為一種反芻動物，其血液中葡萄糖無法由食物獲取，主要來源于肝臟內的糖異生活動。SCHARF［22］等報道急性熱應激可以影響奶牛糖代謝并升高血液中葡萄糖含量，彌補熱應激時的能量不足。同樣也有研究發(fā)現當熱應激發(fā)生時，泌乳奶牛很難從食物中獲得足夠的能量，必須通過糖異生作用生成葡萄糖，并且這些由多糖直接分解產生的葡萄糖會直接用于泌乳［23-24］。本試驗中，隨著熱應激時間的延長，第5周奶牛血液中葡萄糖濃度顯著高于第1周，并且在第5周時奶牛肝臟組織中糖異生關鍵酶PC和PEPCK與第1周相比表達均顯著上調，提示熱應激通過上調糖異生作用增加了血液中葡萄糖的含量。

1993年BAUMAN等［25］發(fā)現，當給泌乳奶牛注射GH時，肝臟糖異生作用明顯增強，并且血液中葡萄糖濃度也相應上升，推測糖異生的關鍵酶可能會受到GH的影響。吳文旋等［26］研究發(fā)現，當動物受到外源GH刺激時，肝細胞IGF-I的合成增加，使外周循環(huán)血液中IGF-I的含量也顯著增加，提示GH在肝細胞的作用與IGF-I密切相關。RHOADS等［27］提出，熱應激發(fā)生時GH會作用于肝細胞產生IGF-I，后者能夠促進PC和PEPCK的表達，進而激活糖異生途徑。本試驗發(fā)現，第5周與第1周相比奶牛血液中GH、IGF-I以及葡萄糖水平顯著升高，并且結合上述研究中肝臟糖異生關鍵酶表達量的顯著上調。說明隨著熱應激程度的加深，可能是通過GHIGF-I軸，激活了肝臟的糖異生途徑，增加了血液中葡萄糖的含量。

4 結論

在給泌乳奶牛制造熱應激模型的狀態(tài)下，會造成乳產量下降，而血液中葡萄糖含量顯著上調，激素GH、IGF-I含量也顯著上升，肝臟糖異生作用也明顯升高，提示血液中葡萄糖含量的升高可能是通過GHIGF-I軸，進而激活肝臟的糖異生作用來發(fā)揮效應的。而乳中乳蛋白含量的下降可能是由于其前體物被過多的用來進行糖異生的轉化，進而合成的葡萄糖為機體正常供能所致，但其機制有待進一步研究。

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（責任編輯 林鑒非）

Lactating Dairy Cows Under Heat Stress Enhanced Gluconeogenesis by Activating the GHIGF-I Axis

LI Lin， AI Yang， XIE Zheng-lu， CAO Yang， ZHANG Yuan-shu
（Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry of the Ministry of Agriculture/College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095）

【Objective】Six Holstein cows in early lactation after delivery were chosen to be in heat stress，which were fed 35 days from June 29 in 2013 for detecting milk yield and protein content， growth hormone （GH）， insulin like growth factor-I（IGF-I），glucose and liver heat shock protein 70 （HSP70） and gluconeogenesis change in blood to illuminate glucose gluconeogenesis and milk quality decline mechanism when lactating dairy in heat stress from the GHIGF-I axis angle and further revealing the cows heat stress mechanism and control of dairy cows heat stress.【Method】Glucose and GH， and IGF-I contents in blood were detected bycollecting jugular venous blood and in vivo taking liver tissue， furthermore milk yield and protein content in lactating cows were counted and analyzed， respectively， before fifth week. In addition， HSP70， PC， PEPCK， GHR， and IGFR were detected by qRT-PCR. 【Result】Dairy cows were in heat stress when the average daytime temperature above 32℃ lasted for 25 days and the highest temperature 38℃ lasted for more than 72 h continuously during 35 days feeding period. The milk yield and protein content generally showed a decline with the degree of heat stress in lactating dairy cows deepening from the first week to the fifth week. The expression of HSP70 in the fifth week was significantly higher than that in the first week， so were the expression of PC and PEPCK and GHR and IGFR in liver tissues （P＜0.05） through detecting their contents.【Conclusion】Blood glucose was significantly increased， in the period of study which may be due to the secretion of pituitary GH stimulates the liver to produce more IGF-I，namely through GHIGF-I axis up-regulation of hepatic gluconeogenesis pathway key enzyme expression， gluconeogenesis way was activated with the degree of heat stress in lactating dairy cows deepening. Milk protein content decline may be caused by its precursors was too much for gluconeogenesis to make levels of glucose increase in blood to maintain body’s normal energy supply.

lactaing dairy cows； heat stress； GHIGF-I axis；growth hormones （GH）； gluconeogenesis

2015-11-13；接受日期：2016-06-02

國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目（“973”計劃）（2011CB100802）

聯系方式：李林，E-mail：614107822@qq.com。通信作者張源淑，E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn