劉茂林，劉義明，徐 飛，張道康，黃慧麗，李 浛，李秀波

（1中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所/國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081；2北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100107）

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法

劉茂林1，劉義明1，徐 飛1，張道康1，黃慧麗1，李 浛2，李秀波1

（1中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所/國家飼料藥物基準實驗室，北京 100081；2北京市獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100107）

【目的】參考硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標準，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，建立專屬性強、靈敏度高、快速簡便的方法，可有效的分析硫酸頭孢喹肟乳房注入劑的有關(guān)物質(zhì)，為制劑的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供依據(jù)?！痉椒ā績x器方法按照硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標準要求，色譜條件：流動相為高氯酸鈉緩沖溶液（精密稱取NaClO4·H2O 3.45g于1 000 mL水溶解，加入磷酸12 mL，乙腈115 mL，三乙胺調(diào)pH3.6），流速為1 mL·min-1，檢測波長為270 nm，進樣量為20 μL。采用高效液相色譜法（HPLC）峰面積歸一化法計算硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）中有關(guān)物質(zhì)的檢測限及其濃度；考察該檢查方法精密度及儀器精密度；考察樣品主成分及有關(guān)物質(zhì)的穩(wěn)定性及線性相關(guān)性；對樣品以適當條件的破壞后對該方法進行專屬性考察，例如使用0.2 mol·L-1HCl溶液、0.2 mol·L-1NaOH溶液對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進行4 h的破壞；使用10% H2O2溶液對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進行30 min的破壞；以及90℃高溫對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑進行1 h的破壞。對比樣品破壞前后主成分峰面積的降解程度，有關(guān)物質(zhì)含量的變化程度，主成分峰與雜峰之間及有關(guān)物質(zhì)峰與雜質(zhì)峰之間的分離度，以及雜質(zhì)峰個數(shù)的變化等主要參數(shù)。并對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）三批樣品中的有關(guān)物質(zhì)含量進行測定?！窘Y(jié)果】硫酸頭孢喹肟乳房注入劑經(jīng)過一系列的梯度稀釋后，當樣品主成分濃度為7.5 μg·mL-1時，有關(guān)物質(zhì)的信噪比≥3，按HPLC峰面積歸一化法計算，有關(guān)物質(zhì)濃度為0.05 μg·mL-1；100 μg·mL-1濃度樣品進樣精密度RSD達到0.8%，方法精密度RSD達到0.6%；主成分在7.5—300 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，按HPLC峰面積歸一化法計算，有關(guān)物質(zhì)濃度范圍為0.05—2 μg·mL-1，有關(guān)物質(zhì)濃度對峰面積線性回歸分析方程為y = 45935x-130.03，相關(guān)系數(shù)r=1。硫酸頭孢喹肟乳房注入劑在一定時間內(nèi)在強酸、強堿、氧化、高溫破壞條件下均有降解，以破壞前樣品主成分含量為100%計，使用10% H2O2溶液對制劑進行30 min的氧化破壞后主成分含量降解達30%左右，在90℃高溫下對制劑進行1 h的高溫破壞后主成分含量降解達20%左右，使用0.2 mol·L-1HCl溶液和0.2 mol·L-1NaOH溶液對制劑進行4 h的酸、堿破壞后主成分含量降解均在10%左右。破壞前后主成分峰與有關(guān)物質(zhì)峰的保留時間均未發(fā)生變化，主峰與雜峰以及雜峰與雜峰之間分離度均大于 1.5，雜質(zhì)峰含量發(fā)生變化，雜質(zhì)數(shù)量破壞后均有增加。對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）三批制劑有關(guān)物質(zhì)含量進行檢測后，按HPLC面積歸一化法計算顯示有關(guān)物質(zhì)峰面積均未超過主峰峰面積的 2%，符合獸藥質(zhì)量標準的規(guī)定。【結(jié)論】硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢測方法簡便易行，專屬性強，靈敏度好，精密度高，可應(yīng)用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的考察。

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑；有關(guān)物質(zhì)；HPLC法

0 引言

【研究意義】國家飼料藥物基準實驗室自主研發(fā)了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期），主要應(yīng)用于干乳期奶牛乳房炎的預(yù)防和治療，并已獲得國家新獸藥證書（2015新獸藥證字-62號）。在硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標準基礎(chǔ)上，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，該方法靈敏度高，專屬性強，可用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測。【前人研究進展】 頭孢喹肟（cefquinome），是20世紀80年代由德國赫斯特公司（Hoechst AG）研發(fā)的第一個動物專用第四代頭孢菌素類抗生素，商品名為克百特（Cobactan）［1］，具有廣譜抗菌、生物效價高、適于非腸道給藥、低毒低殘留、對β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定等優(yōu)勢［2-3］，目前已經(jīng)被歐盟獸用藥品委員會（CVMP）批準用于預(yù)防和治療由敏感菌引起的家畜呼吸道感染、奶牛乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎［4］。頭孢喹肟分子式為C23H24N6O5S2，化學名為（6R-7R）-7-［ （2-氨基-4一噻唑基）-2-（甲氧亞氨基）乙酰氨基］-3-［（5，6，7，8-四氫喹啉甲基）甲氧］-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)［4.2.0］辛-2-烯-2-甲酸，分子量為528.60。頭孢喹肟的合成路線主要有 3種［5-9］，均由5，6，7，8-四氫喹啉，又名2，3-環(huán)己基吡啶（2， 3 - cyclohexyl pyridine）合成而來。5，6，7，8-四氫喹啉既是頭孢喹肟的合成前體，也可以在特殊作用力下由頭孢喹肟裂解而來。藥物中的雜質(zhì)是指存在于藥物中，但化學結(jié)構(gòu)與藥物不一樣的任何一種成分，其中與藥物結(jié)構(gòu)類似或具淵源的雜質(zhì)又稱為有關(guān)物質(zhì)［10-11］。雜質(zhì)的活性藥物成分可能對藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和靶動物的安全性產(chǎn)生較大的影響［12-13］。因此進行藥物或制劑中有關(guān)物質(zhì)的測定，對于提高化學的合成過程和優(yōu)化藥物制劑工藝，減少甚至消除此類雜質(zhì)是至關(guān)重要的［14］。硫酸頭孢喹肟注射液質(zhì)量標準中規(guī)定，5，6，7，8-四氫喹啉為硫酸頭孢喹肟的單個有關(guān)物質(zhì)。四氫喹啉衍生物如1，2，3，4-四氫喹啉或者其他衍生物均勻良好的抗癌、抗抑郁活性［15-16］，而單體5，6，7，8-四氫喹啉的化學性質(zhì)和藥理學性質(zhì)卻沒有相關(guān)研究報道。近年來，隨著色譜、光譜技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的聯(lián)用技術(shù)被運用于藥物質(zhì)量控制，通常藥品中有關(guān)物質(zhì)含量相對較低［17］，高效液相色譜法（HPLC）具備檢測限較低、靈敏度較高的優(yōu)勢，在有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)已知的情況下被廣泛用于開發(fā)高效分離，簡便可靠的雜質(zhì)測定方法［18］。MUSTAKHUSEN等［19］在確證 U-高尿酸血癥治療藥的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)時，使用了LC-MS/MS、NMR以及IR技術(shù)，推測了其有關(guān)物質(zhì)的生成路徑。SATYANARAYANA等［20］在鑒別度他雄胺原料中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)時，也采用了HPLC、IR、NMR、MS技術(shù)。ALIREZA 等［21］利用X-粉末衍射（PXRD）、差示掃描熱法（DSC）考察了阿莫西林原料藥的純度，并使用HPLC法對原料藥的有關(guān)物質(zhì)進行驗證。【本研究切入點】目前硫酸頭孢喹肟上市的產(chǎn)品主要有國外的英特威國際有限公司的硫酸頭孢喹肟注射液（（2011）外獸藥證字20號），國內(nèi)批準產(chǎn)品劑型也以注射劑或粉劑為主，而且目前國內(nèi)外對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的研究尚不深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性，即通過給予研究對象極端或劇烈的條件，觀察新生成的雜質(zhì)來考察其降解產(chǎn)物，這也是目前有關(guān)物質(zhì)研究工作的重點［22-24］。本試驗著重開展了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢查方法的專屬性研究，既在一定破壞條件下，使藥物主成分降解控制在 10%—30%以內(nèi)［10，25］，同時考察有關(guān)物質(zhì)的含量、分離度、雜質(zhì)數(shù)量變化等重要參數(shù)。

1 材料與方法

試驗于2014年11月1日在中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所國家飼料藥物基準實驗室開展。

1.1儀器

高效液相色譜儀，Waters e2695 （UV2998）；分析天平，Sartorius CPA225D；離心機，Thermo Fisher；超聲儀，KQ-300DE；酸度計，Sartorius PB-21。

1.2試劑

頭孢喹肟標準品（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0312406，含量82.6%）；硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）（中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，批號：20141104，20141105，20141106）；高氯酸鈉、磷酸均為分析純；乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3色譜條件及樣品處理方法

色譜條件參考硫酸頭孢喹肟注射液質(zhì)量標準［26］，流動相為高氯酸鈉緩沖液（精密稱取 3.45 g溶于1 000 mL水中，加乙腈115 mL和磷酸12 mL，三乙胺調(diào)pH=3.6）；流速為1 mL·min-1；檢測波長為270 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。本試驗采用的色譜柱為Waters Sunfire C18150 mm×4.6 mm 5 μm。

硫酸頭孢喹肟乳房注入劑處理方法：精密稱取硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量（約相當于頭孢喹肟12.5 mg）置50 mL離心管中，加流動相25 mL溶解，渦旋2 min，水浴超聲20 min，4 000 r/min離心5 min，取下層溶液20 μL，過0.45 μm濾膜，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍。

1.4檢測限考察

稱取一定量的硫酸頭孢喹肟標準品，甲醇溶解，流動相稀釋成一系列濃度的標準工作溶液，按1.3項下的色譜條件采用HPLC峰面積歸一化法計算硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測限及其濃度，以s/n ≥3的最小樣品濃度為最低檢測限。

1.5精密度考察

1.5.1進樣精密度 精密稱取批號為20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動相溶解成濃度為100 μg·mL-1的溶液，按1.3項下色譜條件和樣品處理后重復(fù)進樣5針，以頭孢喹肟峰面積計算RSD。

1.5.2方法精密度 精密稱取5份批號為20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動相溶解成濃度為100 μg·mL-1的溶液，按1.3項下色譜條件和樣品處理后測定，并以頭孢喹肟峰面積計算RSD。

1.6穩(wěn)定性考察

精密稱取批號為 20141104的硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）適量，用流動相溶解成濃度為 100 μg·mL-1的溶液，按1.3項下色譜條件和樣品處理后分別在室溫下于0、0.5、1、2、3 h時進樣，測定主成分及雜質(zhì)峰面積。

1.7線性考察

精密稱取頭孢喹肟標準品適量，流動相溶解并稀釋成300、200、100、30、7.5 μg·mL-1系列濃度的溶液，取20 μL進樣，測定有關(guān)物質(zhì)峰及頭孢喹肟峰面積，以頭孢喹肟及有關(guān)物質(zhì)濃度對各自峰面積分別進行線性回歸分析。

1.8專屬性考察

1.8.1樣品前處理 精密稱取2 g樣品置于50 mL離心管中，加入50 mL流動相后渦旋2 min，水浴超聲20 min，4 000 r/min離心5 min。

1.8.2破壞前樣品處理 精密量取下清液1 mL，加流動相1 mL，渦旋2 min后過0.2 μm濾膜，取20 μL進樣，記錄色譜圖（圖1-a）。

1.8.3酸破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1HCl 2 mL，振蕩搖勻，置50℃水浴振蕩4 h后，自然冷卻，加入0.2 mol·L-1NaOH 2 mL中和，再加入1 mL流動相后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進樣，記錄色譜圖（圖1-b）。

1.8.4堿破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入0.2 mol·L-1NaOH 2 mL，振蕩搖勻，室溫下振蕩4 h后，加入0.2 mol·L-1HCl 2 mL中和，再加入1 mL流動相后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進樣，記錄色譜圖（圖1-c）。

1.8.5高溫破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，置90℃烘箱內(nèi)1 h后取出，自然冷卻，加入流動相5 mL后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進樣，記錄色譜圖（圖1-d）。

1.8.6氧化破壞樣品處理 精密量取下清液5 mL，于10 mL離心管中，加入10% H2O22 mL，振蕩搖勻，置50℃水浴振蕩30 min后，自然冷卻，加入流動相3 mL后渦旋1 min，過0.2 μm濾膜，取20 μL進樣，記錄色譜圖（圖1-e）。

圖1　樣品破壞前后色譜圖Fig. 1 The HPLC chromatograms of samples before and after destruction

2 結(jié)果

2.1檢測限確定

由數(shù)據(jù)表1可知，樣品經(jīng)一系列稀釋后，當主成分濃度為7.5 μg·mL-1時，有關(guān)物質(zhì)的信噪比為3，經(jīng)過面積歸一化法計算，有關(guān)物質(zhì)的濃度為 0.05 μg·mL-1，因此本方法中硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的檢測限約為0.05 μg·mL-1，色譜圖如圖2。

表1　檢測限試驗Table 1 Results of LOD tests

圖2　檢測限色譜圖Fig. 2 The HPLC chromatograms of LOD

2.2精密度試驗

按1.5項下樣品處理方法處理的樣品按1.3項下色譜條件分析，同一樣品重復(fù)進樣5次，以主峰峰面積計算，RSD=0.8%；同一批樣品平行處理 5個樣品，以主峰峰面積計算，RSD=0.6%。

2.3穩(wěn)定性試驗

由數(shù)據(jù)表2可知，隨著放置時間的加長，雜質(zhì)含量明顯增加，放置2 h的樣品測定其有關(guān)物質(zhì)已經(jīng)超過獸藥質(zhì)量標準規(guī)范規(guī)定的最高含量（2.0%）［26］，因此樣品配制后應(yīng)該立即檢測。

2.4線性考察

2.4.1頭孢喹肟濃度對峰面積進行線性回歸分析，回歸方程為y = 45852x - 11520，相關(guān)系數(shù)r=1。表明頭孢喹肟在7.5—300 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)性良好（圖3）。

表2　穩(wěn)定性試驗Tab 2 Results of stability tests

圖3　頭孢喹肟標準曲線圖Fig. 3 The standard curve figure of Cef

圖4　有關(guān)物質(zhì)標準曲線圖Fig. 4 The standard curve figure of related-substances

表3　專屬性試驗Table 3 Results of specific tests

2.4.2經(jīng)過主成分對照計算，有關(guān)物質(zhì)的濃度范圍為0.05—2 μg·mL-1，在此范圍內(nèi)有關(guān)物質(zhì)濃度對峰面積進行線性回歸分析，回歸方程為y = 45935x-130.03，相關(guān)系數(shù)r=1，線性相關(guān)性良好（圖4）。

2.5專屬性考察結(jié)果

頭孢喹肟在強酸、強堿、氧化、高溫條件下均有降解，以破壞前樣品主成分含量為 100%，氧化破壞主成分降解達30%，高溫破壞主成分降解達20%，酸、堿破壞主成分降解在10%左右，破壞前后主成分峰保留時間一致，各峰之間分離度良好。

雜質(zhì)峰與雜質(zhì)峰之間分離度達到1.2即可，而被測物與相鄰雜質(zhì)峰的分離度必須大于 1.5［27］。表 3數(shù)據(jù)中顯示，有關(guān)物質(zhì)與其他雜質(zhì)分離良好。本試驗中，在一定時間內(nèi)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑在各種破壞條件下樣品雜質(zhì)數(shù)量發(fā)生變化，有關(guān)物質(zhì)含量均有增加，但有關(guān)物質(zhì)相對保留時間基本不變。在破壞性試驗中，有關(guān)物質(zhì)含量明顯增加且無其他干擾，表明擬定的色譜條件具有較強的專屬性，可應(yīng)用于頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)檢查。

2.6制劑中有關(guān)物質(zhì)測定

按1.3項下的色譜條件及樣品處理后，對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（干乳期）3批制劑中的有關(guān)物質(zhì)進行測定，結(jié)果如下（表4）。

由表4可知，按面積歸一法計算，3批制劑中有關(guān)物質(zhì)均未超過主峰面積的2.0%，符合獸藥質(zhì)量標準的規(guī)定。筆者使用了3根不同品牌的C18色譜柱，均按上述色譜條件進行硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)含量的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除頭孢喹肟及有關(guān)物質(zhì)保留時間有一定差異外，雜質(zhì)個數(shù)及含量均無變化。經(jīng)過調(diào)整柱溫或者適當調(diào)整流動相比例以后，保留時間有所變化，但均未影響含量大小，說明本方法耐用性較好。

表4　有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果Table 4 Results of the determination of the related substances

3 討論

本試驗針對硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)的方法研究，主要參考了鄧晶晶［28］及樊后民等［29］使用高效液相色譜法分別測定頭孢美唑鈉及頭孢噻吩鈉中的有關(guān)物質(zhì)。鄧晶晶除了考察頭孢美唑鈉的檢測限、精密度、線性相關(guān)性等之外，同時進行了酸、堿、氧化、高溫以及高濕條件下的破壞，發(fā)現(xiàn)該藥耐酸，在其他條件下破壞主成分后，產(chǎn)生唯一的一種有關(guān)物質(zhì)，即TMT（1-甲基-1H-四唑-5-硫醇）。在各種破壞條件下，TMT保留時間不變，含量均發(fā)生了變化。樊后民同樣對頭孢噻吩鈉進行了酸、堿、氧化、高溫4種條件的破壞，破壞后發(fā)現(xiàn)該藥在各種破壞條件下主成分均有降解，且各種破壞條件下雜質(zhì)數(shù)量發(fā)生明顯變化，有關(guān)物質(zhì)含量明顯增加。這兩種方法均有較強的專屬性，破壞條件簡單快速，但均未明確表述在一定時間內(nèi)主成分峰及有關(guān)物質(zhì)峰含量的具體變化，而本文所選擇的破壞條件及破壞時間，必須保證藥物主成分峰降解量控制在10%—30%，在此基礎(chǔ)上研究有關(guān)物質(zhì)及其他雜質(zhì)的數(shù)量及含量變化等重要參數(shù)。

在硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)專屬性試驗的研究過程，筆者對不同破壞條件進行了摸索，對不同濃度的酸、堿、過氧化物溶液以及不同溫度下制劑的破壞情況進行了研究，如制劑在 2、1、0.8和 0.2 mol·L-1鹽酸及氫氧化鈉的濃度進行10 min、20 min、30 min、1 h、2 h的破壞，在30%、20%、10%、5% H2O2溶液進行10、20、30 min的破壞，在80、90、100、110℃溫度下進行30 min、1 h、2 h、3 h的破壞等。研究結(jié)果顯示，硫酸頭孢喹肟乳房注入劑經(jīng)過 30 min 10% H2O2溶液破壞后，主成分降解率為30%；經(jīng)過4 h 0.2 mol·L-1的酸、堿溶液破壞后，主成分降解率為10%左右；經(jīng)過90℃高溫破壞1 h后，主成分的降解率為20%左右，滿足《獸用化學藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求。由試驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)硫酸頭孢喹肟乳房注入劑對氧化物敏感，而較耐酸堿。破壞后雜質(zhì)數(shù)量及含量均有增加，說明該檢查方法具有較強的專屬性。

根據(jù)質(zhì)量標準規(guī)定，本產(chǎn)品水分含量不得超過0.2%。在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，密封性較差的樣品可能由于受潮而存在有關(guān)物質(zhì)含量較高的情況。而試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品溶液放置超過2 h后，有關(guān)物質(zhì)含量也有上升趨勢，因此筆者考慮可能由于制劑水分的原因會直接引起有關(guān)物質(zhì)含量的增加，期望更深入的試驗探究水分對有關(guān)物質(zhì)含量的影響。

本試驗建立了HPLC法測定硫酸頭孢喹肟乳房注入劑的有關(guān)物質(zhì)，該方法快捷，在已知結(jié)構(gòu)的反相色譜有關(guān)物質(zhì)檢測中，HPCL法是經(jīng)濟適用、高效分離、準確定量的研究方法。而TLC（薄層分析法）多適用于正相色譜有關(guān)物質(zhì)的分析，GC（氣相色譜法）多用來分析可氣化且具備熱穩(wěn)定性的藥物分析，CE（毛細管電泳法）主要用來分析離子化藥物且具有分離程度高，簡單高效等優(yōu)勢，但其自身穩(wěn)定性較差。綜上分析，在硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)分析初期，筆者首選HPLC法對其進行研究分析。

4 結(jié)論

本試驗參考硫酸頭孢喹肟注射液獸藥質(zhì)量標準以及文獻中針對有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，建立了硫酸頭孢喹肟乳房注入劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。試驗結(jié)果證明本方法靈敏度高，簡單高效，專屬性強，可用于硫酸頭孢喹肟乳房注入劑有關(guān)物質(zhì)考察。

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（責任編輯 林鑒非）

The Detection Methods of the Related Substances in Cefquinome Sulfate Intramammary Infusion

LIU Mao-lin1， LIU Yi-ming1， XU Fei1， ZHANG Dao-kang1， HUANG Hui-li1， LI Han2， LI Xiu-bo1
（1Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Reference Laboratory of Drug in Feeds， Beijing 100081；2Beijing Institute of Veterinary Drugs Control， Beijing 100107）

【Objective】 The detection methods of the related substances in cefquinome sulfate intramammary infusion were optimized by referencing the cefquinome sulfate injection in Veterinary Drug Quality Standard Assembly. A specific， sensitive，simple and rapid method was developed， which could be used to analyze the related substance in cefquinome sulfate intramammary infusion， effectively. And it will be useful for its quality control and process optimization. 【Method】 The instrument method was made by the pharmacopoeia requirements. The separation was performed on sodium perchlorate buffer （3.45 g NaClO4·H2O was dissolved in 1 000 mL water， mixed in 12 mL phosphoric acid and 115 mL acetonitrile， and adjusted pH to 3.6 with triethylamine） as the mobile phase at flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wave length was 270 nm and the injection amount of sample solution was 20 μL. The LOD and concentration of the related substance in cefquinome sulfate were estimated by HPLC area normalization method. The linearity， the RSD of injection precision and method precision were tested. For the specificity test， by using 0.2 mol·L-1HCL， 0.2 mol·L-1NaOH to destroy the drug for 4 h，using 10% H2O2to destroy the drug for 30 min and 90℃high temperature to destroy the drug for 1 h. The before and after destroyed samples were detected by HPLC after preparation. And the main-substances’ area， related-substances’ concentration， and their resolutions were contrasted with each other， and the number of the peak values of the impurities was also contrasted. 【Result】 After a series of dilutions of the cefquinome sulfate intramammary infusion， when the concerntration of the main component was at 7.5 μg·mL-1， the S/N of the related-substance was no less than 3， and through calculation of the LOD of the related substance was 0.05 μg·mL-1， and the RSD of injection precision and method precision of 100 μg·mL-1were 0.8% and 0.6%， respectively. The calibration curve of the related substances was a liner equation as y = 45935x-130.03 with a correlation coefficient of 1. The infusions were degraded by almost 10%， 10%， 30%，and 20% under the conditions of acid， alkali， an oxidizing agent， and high temperature， respectively. The retention time and resolution of cefquinome and related-substances were good， and the concentration and numbers of the impurities were added. After detecting the concentration of related substances of the 3 batches of cefquinome sulfate intramammary infusion， and calculated by HPLC method， it was found that the area of related substances were less than 2% of Cef， which met the the Quality Standards of Veterinary Drugs Provisions. 【Conclusion】 The method is simple and easy， selective and sensitive， which can be used to analyze the related substances in agents efficiently.

cefquinome sulfate intramammary infusion； related substance； HPLC method

2016-03-01；接受日期：2016-05-14

國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團隊項目、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303038）、中國農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（2015YWF-ZD-25）

聯(lián)系方式：劉茂林，E-mail：lmlcaas@foxmail.com。劉義明，E-mail：liuyiming@caas.cn。劉茂林和劉義明為同等貢獻作者。通信作者李秀波，E-mail：lixiubo@caas.cn