陳清嬋，李　蓉，孫愛紅，簡清梅，王勁松（荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

米糠復(fù)合酶解工藝條件研究

陳清嬋，李蓉，孫愛紅，簡清梅，王勁松
（荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000）

以膨化米糠為主要原料，先經(jīng)α-淀粉酶液化，再經(jīng)糖化酶和蛋白酶同步酶解，改善米糠液中的營養(yǎng)成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，α-淀粉酶水解最佳條件為酶用量1.5%，酶解溫度為80℃，酶解時間為75 min，淀粉酶水解后還原糖含量達(dá)到0.657 1 g/100 mL。糖化酶和蛋白酶復(fù)合水解米糠，最適條件為pH4.5，糖化酶添加量0.2%，蛋白酶添加量2%，酶解溫度60℃，酶解時間120 min，在此條件下，酶解液還原糖含量可達(dá)3.0 g/100 mL，氨基酸含量可達(dá)5.2 g/100 mL。

米糠；α-淀粉酶；糖化酶；蛋白酶

米糠是大米加工的副產(chǎn)物，由稻谷的果皮、種皮、外胚層、糊粉層、胚及部分胚乳等組成。雖然它只占稻米質(zhì)量的6%～8%，卻含有稻米中64%的營養(yǎng)成分［1］，含有豐富及優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、膳食纖維、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，被譽(yù)為“天賜營養(yǎng)源”［2］。除此之外米糠還含有多種天然生物活性物質(zhì)（如植酸、阿魏酸酯、γ-生育三烯酚、β-谷甾醇、肌醇、多糖等）。研究表明，米糠對人體具有通便、降低膽固醇、降低血脂作用，對尿結(jié)石也有一定的輔助治療作用［3］，此外，還具有抑制大腸癌變、抗氧化、防輻射、護(hù)膚等功效，對血管性頭痛、植物神經(jīng)功能失調(diào)等也有一定防治作用［4］。但是，由于米糠的外觀差、有異味和缺乏可食性等原因，使得米糠至今未得到充分利用。因此，在對米糠進(jìn)行加工之前，必須要穩(wěn)定化米糠，防止米糠變質(zhì)，提高貯藏性。本研究所用原料就是經(jīng)膨化后的穩(wěn)定化米糠。

由于米糠中的營養(yǎng)物質(zhì)與其細(xì)胞壁結(jié)合在一起，溶解性差、難以被利用，可利用酶工程改變米糠的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)其中可溶性成分溶出，同時將不溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性成分［5］。

利用淀粉酶和蛋白酶分解米糠中的碳水化合物和蛋白質(zhì)，可改善米糠的食用品質(zhì)，提高米糠的營養(yǎng)價值［6-7］。本研究優(yōu)化確定高溫淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的復(fù)合酶解最佳工藝條件，為提高米糠產(chǎn)品營養(yǎng)價值和新產(chǎn)品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

膨化米糠：湖北金龍泉集團(tuán)股份有限公司提供；α-淀粉酶（3 000～5 000 U/g）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；糖化酶（50 000 U/g）：江蘇博立生物制品有限公司；木瓜蛋白酶（活力≥800 U/g，水分≤8.0%）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；茚三酮（分析純）：廣州金科化玻儀器有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

JY1002型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；JMS-50C膠體磨：威海泰富西瑪電機(jī)有限公司；PHS-25型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

膨化米糠加水（料液比1∶5）混合磨漿→加入α-淀粉酶→淀粉水解→滅酶（90℃、15 min）→調(diào)整pH值→加糖化酶+木瓜蛋白酶→酶解→滅酶（90℃、15min）→酶解液

1.3.2α-淀粉酶酶解條件的確定

α-淀粉酶加酶量對糖化效果的影響：取米糠液100 mL置于250 mL錐形瓶中，加酶量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，在溫度60℃的水浴中酶解60 min，測定還原糖含量。

溫度對酶解效果的影響：取米糠液100 mL置于250 mL錐形瓶中，以40℃、50℃、60℃、70℃、80℃為溫度梯度，在α-淀粉酶加酶量為0.2%，酶解60 min，測定還原糖含量。

時間對酶解效果的影響：取米糠液100 mL置于250 mL錐形瓶中，在60℃，α-淀粉酶加酶量為0.2%，分別酶解30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，測定還原糖含量。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以還原糖含量為考察指標(biāo)，每個因素選擇3個水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1　酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for hydrolysis condition optimization

1.3.3糖化酶和蛋白酶雙酶解條件的確定

糖化酶加酶量對糖化效果的影響：取液化的米糠溶液100 mL置于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至4.5，加酶量梯度為0.02%、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%，60℃水浴酶解120 min，測定還原糖含量。

蛋白酶加酶量對水解米糠的影響：取液化的米糠溶液100 mL置于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至4.5，分別加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的木瓜蛋白酶，60℃水浴酶解120 min，測定氨基酸含量。

溫度對酶解效果的影響：取液化的米糠溶液100 mL置于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至4.5，以50℃、55℃、60℃、65℃、70℃為溫度梯度，在糖化酶加酶量為0.2%，蛋白酶加酶量為2%的條件下酶解120 min，測定還原糖含量和氨基酸含量。

時間對酶解效果的影響：取液化的米糠溶液100 mL置于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH至4.5，在60℃，糖化酶加酶量為0.2%，蛋白酶加酶量為2%的條件下分別酶解60 min、80 min、100 min、120 min、140 min，測定還原糖含量和氨基酸含量。

1.3.4檢測方法［8］

還原糖含量的測定：直接滴定法；氨基酸含量測定：茚三酮比色法。

2　結(jié)果與分析

2.1α-淀粉酶酶解米糠條件優(yōu)化

分別對α-淀粉酶加酶量、酶解溫度和酶解時間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2　不同酶解條件對還原糖含量的影響Table 2 Effect of different hydrolysis conditions on reducing sugar content

由表2可知，α-淀粉酶加酶量在1.5%時達(dá)到最高，隨著添加量的增加，還原糖含量沒有顯著增高，因此，考慮到節(jié)約成本，α-淀粉酶加酶量應(yīng)在1.5%左右。α-淀粉酶酶解溫度在70℃時達(dá)到最高，隨著溫度升高，還原糖含量反而降低，可能過高溫度影響酶的活性，因此，酶解溫度應(yīng)在70℃左右。α-淀粉酶酶解時間在60 min時還原糖含量明顯增高，雖然在75 min時達(dá)到最高，但隨著時間延長，還原糖含量升高不顯著，因此，為了提高效率，酶解時間可以選擇在60 min左右。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以還原糖含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳α-淀粉酶酶解米糠條件，結(jié)果與分析見表3。

表3　α-淀粉酶酶解米糠條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for rice bran hydrolysis condition optimization by α-amylase

由表3可知，通過極差分析，可知對于α-淀粉酶水解米糠而言，3個因素的影響程度大小依次為溫度＞加酶量＞時間，最優(yōu)組合為A2B3C3，即酶用量1.5%，酶解溫度為80℃，酶解時間為75 min。因最優(yōu)組合A2B3C3并未出現(xiàn)在試驗(yàn)中，所以需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在最優(yōu)組合條件下，經(jīng)α-淀粉酶水解后還原糖含量達(dá)到0.657 1 g/100 mL。

2.2糖化酶和蛋白酶雙酶解米糠條件優(yōu)化

2.2.1酶添加量對酶解效果的影響

圖1　糖化酶添加量對還原糖含量的影響Fig.1 Effect of saccharrifying enzyme addition on reducing sugar content

圖2　蛋白酶添加量對氨基酸含量的影響Fig.2 Effect of the protease addition on amino acid content

由圖1可知，隨著糖化酶添加量的增加，米糠糖化的程度逐漸增加，最后趨于平緩。在糖化酶添加量為0.2%時，還原糖含量最高，為3.2 g/100 mL。因此，考慮糖化效果和節(jié)約成本，糖化酶的最適添加量為0.2%。由圖2可知，隨著蛋白酶添加量的增加，米糠蛋白水解度逐漸增加，在添加量2%時水解效果最好，為4.5 g/100 mL。但隨著蛋白酶添加量的進(jìn)一步增加水解度反而降低。這可能是由于，當(dāng)加酶量達(dá)到一定水平時，酶的數(shù)量趨于飽和，單位時間內(nèi)一部分酶不與底物結(jié)合，酶解程度將逐漸下降［9］，且再增加酶量，就會加大成本。因此，蛋白酶的最適添加量為2%。

2.2.2酶解溫度對酶解效果的影響

由圖3可知，溫度＜60℃時，還原糖的含量隨著溫度的升高而增加，在60℃時達(dá)到最大值。溫度＞60℃之后，酶的活性反而被抑制了，還原糖的含量也隨之降低。并且隨著溫度上升，葡萄糖分子中的羰基和水解液中的一些氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)，都會在一定程度上影響還原糖的含量。蛋白酶水解米糠蛋白質(zhì)時，隨著溫度的升高，混合液中氨基酸含量先升高后逐漸降低，在65℃時氨基酸含量最高。由于酶對溫度有一定的適應(yīng)范圍，在最適宜溫度條件下酶的活性最高，高于或低于最適溫度，酶的活性逐漸降低。因此，根據(jù)兩種酶的酶解效果確定最佳溫度范圍為60℃。

圖3　酶解溫度對米糠酶解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on rice bran hydrolyzation

2.2.3酶解時間對酶解效果的影響

圖4　酶解時間對米糠酶解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on rice bran hydrolyzation

由圖4可知，酶解時間＜100 min時，隨著酶解時間的延長，還原糖含量逐漸增大；酶解時間＞100 min后，還原糖的含量隨著時間的增加而減少。由于酶反應(yīng)具有高效性和高度專一性，在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H條件下，反應(yīng)速率迅速提高，但反應(yīng)到一定時間后，底物濃度會相對降低，所以酶解反應(yīng)也會減速，使得還原糖含量減少［10］。同樣，隨著水解時間的延長，米糠蛋白的水解度先增高后逐漸降低，在120 min時出現(xiàn)氨基酸含量峰值。因此，考慮到生產(chǎn)效率等因素，選取120 min作為最佳酶解時間。

綜合以上結(jié)果，可以確定利用糖化酶和蛋白酶同時水解米糠，最適條件為糖化酶添加量0.2%，蛋白酶添加量2%，酶解溫度60℃，酶解時間120 min。在該條件下還原糖含量可達(dá)3.0 g/100 mL，氨基酸含量可達(dá)5.2 g/100 mL。利用其酶解產(chǎn)物中的營養(yǎng)物質(zhì)，可為提高米糠乳酸發(fā)酵中的菌種生長及產(chǎn)酸效果提供基礎(chǔ)［11-15］。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)以膨化米糠為主要原料，先經(jīng)α-淀粉酶液化，再經(jīng)糖化酶和蛋白酶同步酶解，改善米糠液中的營養(yǎng)成分。試驗(yàn)結(jié)果表明，α-淀粉酶水解最佳條件為酶用量1.5%，酶解溫度80℃，酶解時間75 min，淀粉酶水解后還原糖含量達(dá)到0.657 1 g/100 mL。糖化酶和蛋白酶復(fù)合水解米糠，最適條件為pH 4.5，糖化酶添加量0.2%，蛋白酶添加量2%，酶解溫度60℃，酶解時間120 min。在此條件下，還原糖含量可達(dá)3.0 g/100 mL，氨基酸含量可達(dá)5.2 g/100mL。

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Hydrolysis process of rice bran by compound enzyme

CHEN Qingchan，LI Rong，SUN Aihong，JIAN Qingmei，WANG Jinsong
（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China）

Using puffed rice bran as raw material，nutritional value of enzymatic extract was improved with treatment firstly by α-amylase liquefaction，and then by compound enzyme（glucoamylase and protease）.Results showed that the optimal hydrolysis condition for α-amylase was α-amylase addition 1.5%，hydrolysis temperature 80℃，time 75 min，and the reducing sugar content was 0.6571 g/100 ml after hydrolysis.The optimum hydrolysis conditions for compound enzyme hydrolysis were pH 4.5，glucoamylase 0.2%，protease 2%，hydrolysis temperature 60℃，time 120 min.Under the conditions，the reducing sugar content of hydrolysate was 3.0 g/100 ml，and amino acid content reached 5.2 g/100 ml.

rice bran；α-amylase；glucoamylase；protease

Q556

0254-5071（2016）02-0057-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.013

2015-11-24

荊楚理工學(xué)院校級科研項(xiàng)目（ZR201214）；荊楚理工學(xué)院博士科研啟動經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2013BK06）

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向?yàn)轱L(fēng)味食品。