謝全喜，亓秀曄，徐　輝，于佳民，徐海燕，谷　?。ㄉ綎|寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

鼠李糖乳桿菌及枯草芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

謝全喜，亓秀曄，徐輝，于佳民，徐海燕，谷巍
（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000）

該研究通過測(cè)定發(fā)酵飼料pH值、活菌數(shù)、乳酸含量及中性蛋白酶活性，篩選出適宜基礎(chǔ)飼料發(fā)酵的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0281，并對(duì)篩選出的鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行單菌及混菌發(fā)酵方式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，BLCC2-0038單獨(dú)發(fā)酵72 h時(shí)pH值降至3.73，活菌數(shù)達(dá)到7.05×109CFU/g，乳酸含量為48.67 mg/g；BLCC1-0281單獨(dú)發(fā)酵72 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到2.28×1010CFU/g，中性蛋白酶活性達(dá)到3 207 U/g；BLCC2-0038和BLCC1-0281混菌發(fā)酵時(shí)，以鼠李糖乳桿菌/枯草芽孢桿菌配比為3∶1，2%接種量，有氧發(fā)酵方式最優(yōu)，發(fā)酵72 h時(shí)鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)為5.35×109CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g。

鼠李糖乳桿菌；枯草芽孢桿菌；發(fā)酵飼料；乳酸；中性蛋白酶；有氧發(fā)酵

飼料資源短缺問題長(zhǎng)期制約著我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展，尤其是蛋白飼料的嚴(yán)重不足已經(jīng)成為全球性問題。發(fā)展高效飼料工業(yè)，提高糧食向畜牧產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率和飼料利用率、開發(fā)新型飼料原料是滿足畜牧業(yè)發(fā)展的最佳途徑［1-2］。利用微生物發(fā)酵技術(shù)來開發(fā)新型飼料資源越來越受到人們的重視。微生物發(fā)酵飼料作為一種綠色、環(huán)保型飼料，已經(jīng)成為當(dāng)今動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)，同時(shí)也是綠色飼料的一個(gè)重要的發(fā)展方向。

微生物發(fā)酵飼料是指在人為可控制的條件下，利用乳酸菌、芽孢桿菌等有益菌種，對(duì)農(nóng)業(yè)和輕工業(yè)生產(chǎn)的各種副產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵降解，降低pH值，減少有害菌的繁殖，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸和中性蛋白酶等活性物質(zhì)，改善飼料適口性，提高飼料利用率，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、有益活菌含量高的生物飼料或飼料原料［3-7］。目前對(duì)發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵產(chǎn)品對(duì)畜禽生長(zhǎng)性能及免疫水平影響等方面［8-11］，而對(duì)影響發(fā)酵飼料品質(zhì)的菌種、發(fā)酵方式、生產(chǎn)工藝條件等研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)旨在研究適宜妊娠母豬全價(jià)飼料發(fā)酵的芽孢桿菌、乳酸桿菌的篩選和發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵飼料pH、活菌數(shù)、乳酸含量及中性蛋白酶活性的影響，為乳酸桿菌和芽孢桿菌發(fā)酵全價(jià)飼料提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1發(fā)酵基料

玉米-豆粕型配合飼料：山東泰安普瑞納飼料有限公司。

1.1.2發(fā)酵菌種及培養(yǎng)基

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）BLCC2-0038、BLCC2-0001、BLCC2-0111、BLCC2-0015和BLCC2-0112；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BLCC1-0281、BLCC1-0297、BLCC1-0169和BLCC1-0390均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%、檸檬酸銨0.2%、乙酸鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.5%、硫酸錳0.02%、硫酸鎂0.05%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、酵母膏0.5%、吐溫-80 0.1%、pH 6.0。

酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%、pH 7.0。

1.1.3化學(xué)試劑

磷酸氫二鉀（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（分析純）、硫酸錳（分析純）：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；檸檬酸銨（分析純）：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；乙酸鈉（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母膏（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：山東祥瑞藥業(yè)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子液制備

（1）芽孢桿菌種子液制備

取經(jīng)過兩次活化的斜面菌種一環(huán)約0.05 g于裝有100 mL酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，待用。

（2）乳酸桿菌種子液的制備

取經(jīng)過兩次活化的斜面菌種一環(huán)于裝有100 mL乳酸菌培養(yǎng)基的鹽水瓶中，于37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）乳酸桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.8（g∶mL）配制好，裝袋，裝袋量為100 g/袋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸桿菌種子液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)和乳酸含量。

（2）芽孢桿菌的篩選

稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當(dāng)溫度降至40℃左右時(shí)按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的芽孢桿菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定中性蛋白酶活性和活菌數(shù)。

（3）乳酸桿菌和芽孢桿菌混合發(fā)酵

將上述篩選得到的乳酸桿菌和芽孢桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)酵方式為需氧發(fā)酵（料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當(dāng)溫度降至40℃接菌，按乳酸桿菌/芽孢桿菌為3∶1，接種量2%接種）、厭氧發(fā)酵（基料按料水比1∶0.8（g∶mL）配制好，裝袋，裝袋量為100 g/袋，生料發(fā)酵，按乳酸桿菌/芽孢桿菌為1∶1，接種量2%接種）和混合發(fā)酵（料水比為1∶0.8（g∶mL），裝量50 g/瓶，121℃滅菌20 min后取出，使其自然冷卻，當(dāng)溫度降至40℃接入1%芽孢桿菌進(jìn)行需氧發(fā)酵，15 h后接入1%乳酸桿菌裝袋再進(jìn)行厭氧發(fā)酵），以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)和中性蛋白酶活性。

1.2.3測(cè)定指標(biāo)及方法

（1）1樣品pH測(cè)定

取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

（2）芽孢桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至NRS培養(yǎng)基和酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳酸桿菌和芽孢桿菌數(shù)量，結(jié)果用lg（CFU/g）表示。

（3）乳酸含量的測(cè)定

采用羥基聯(lián)苯比色法測(cè)定發(fā)酵飼料中乳酸含量［12］。

（4）中性蛋白酶活性的測(cè)定

取發(fā)酵飼料1.0 g，采用福林-酚試劑法測(cè)定樣品中中性蛋白酶活性。

中性蛋白酶酶活定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸桿菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

表1　鼠李糖乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 1 Effect ofL.rhamnosusfermentation on feed quality

續(xù)表

由表1可知，24 h、48 h和72 h時(shí)，BLCC2-0038發(fā)酵飼料的pH值均最低，顯著低于其余各菌株（P＜0.05），且活菌數(shù)均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）；且BLCC2-0038發(fā)酵妊娠母豬全價(jià)飼料在72 h時(shí)pH值達(dá)到最低，為3.73，活菌數(shù)維持在較高活菌數(shù)水平，為70.5×108CFU/g。

24 h、48 h和72 h時(shí)BLCC2-0038乳酸含量均最高，顯著高于其余各菌株（P＜0.05）。72 h時(shí)BLCC2-0038發(fā)酵妊娠母豬全價(jià)飼料乳酸含量高達(dá)48.67 mg/g。綜合pH值、活菌數(shù)和乳酸含量，鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038最適宜作為發(fā)酵妊娠母豬全價(jià)飼料的理想菌株。

2.2芽孢桿菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

由表2可知，24 h、48 h和72 h時(shí)，BLCC1-0281活菌數(shù)和中性蛋白酶活性均顯著高于其余3株芽孢桿菌（P＜0.05），在發(fā)酵72 h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到2.275×1010CFU/g，且中性蛋白酶活性達(dá)到3207U/g發(fā)酵飼料，說明芽孢桿菌BLCC1-0281最適宜發(fā)酵妊娠母豬全價(jià)飼料。

表2　枯草芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 2 Effect ofB.subtilisfermentation on feed quality

2.3乳酸桿菌和芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

利用篩選得到的鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038和枯草芽孢桿菌BLCC1-0281混合發(fā)酵妊娠母豬全價(jià)飼料，按照需氧發(fā)酵（乳酸桿菌/芽孢桿菌為3∶1，接種量2%接種）、厭氧發(fā)酵（乳酸桿菌/芽孢桿菌為1∶1，接種量2%接種）和混合發(fā)酵（先接入1%芽孢桿菌進(jìn)行需氧發(fā)酵，15 h后接入1%乳酸桿菌裝袋再進(jìn)行厭氧發(fā)酵），以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，考察混合發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。

表3　乳酸桿菌和芽孢桿菌混合發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 3 Effect ofL.rhamnosusandB.subtilis mixed fermentation on feed quality

由表3可知，厭氧發(fā)酵時(shí)24 h、48 h和72 h時(shí)取樣均未測(cè)定中性蛋白酶活性，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)未計(jì)出，說明兩者厭氧發(fā)酵時(shí)枯草芽孢桿菌不能夠進(jìn)行有效發(fā)酵；混合發(fā)酵時(shí)，24 h取樣pH值最低，顯著低于厭氧發(fā)酵和需氧發(fā)酵（P＜0.05），鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌活菌均超過108CFU/g發(fā)酵料，且測(cè)得的中性蛋白酶活性為757.14 U/g發(fā)酵料，說明24 h時(shí)兩者混合發(fā)酵均能夠有效發(fā)酵；48 h和72 h樣品pH值較24 h有所降低，鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)增加，說明乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵，但枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和24 h相比維持在相同水平，且中性蛋白酶活性有所降低，說明枯草芽孢桿菌沒有繼續(xù)發(fā)酵，這與混合發(fā)酵前期是需氧發(fā)酵，氧氣充足有利于枯草芽孢菌的生長(zhǎng)，后期厭氧發(fā)酵，枯草芽孢桿菌由于缺氧停止發(fā)酵有關(guān)；需氧發(fā)酵時(shí)24 h、48 h和72h時(shí)鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌活菌數(shù)均在109CFU/g發(fā)酵料水平，說明二者均能夠同時(shí)有效發(fā)酵，且48 h和72 h樣品酶活性較24 h有大幅度提高，說明枯草芽孢桿菌繼續(xù)發(fā)酵。因此，鼠李糖乳桿菌和枯草芽孢桿菌兩者接種比例為3∶1，接種量為2%，37℃需氧發(fā)酵至72 h時(shí)，鼠李糖乳桿菌活菌數(shù)為5.35×109CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g，此時(shí)兩者發(fā)酵效果較好。

3　結(jié)論

微生物發(fā)酵飼料是利用乳酸桿菌、芽孢桿菌等微生物的新陳代謝和繁殖菌體來生產(chǎn)的飼料，主要通過微生物的發(fā)酵作用來改變飼料的品質(zhì)［13］，將原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子分解或轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生能被畜禽采食、消化、吸收，養(yǎng)分更高且無(wú)毒害作用的飼料原料［14］。微生物發(fā)酵飼料中含有大量的有益微生物菌群（乳酸桿菌、芽孢桿菌等），乳酸菌作為替代抗生素的新型飼料發(fā)酵劑，具有益生菌的效用，如維持腸道菌群平衡，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，且具有無(wú)殘留、無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)［15］。同時(shí)，乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能型飼料，具有酸香味、適口性好、飼喂簡(jiǎn)便、消化率高和功效穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值［16］。飼料發(fā)酵后產(chǎn)生的有機(jī)酸可促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收利用。芽孢桿菌繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生各種酶，如中性蛋白酶、淀粉酶等活性消化酶，促進(jìn)了動(dòng)物對(duì)飼料的消化和吸收。

本試驗(yàn)對(duì)菌種庫(kù)保存的性能優(yōu)良的乳酸桿菌和芽孢桿菌發(fā)酵玉米-豆粕型配合飼料，根據(jù)發(fā)酵后飼料pH、活菌數(shù)和中性蛋白酶活性能指標(biāo)，篩選出適宜發(fā)酵的乳酸桿菌為鼠李糖乳桿菌BLCC2-0038，發(fā)酵72 h時(shí)pH值降至3.73，活菌數(shù)達(dá)到7.05×109CFU/g發(fā)酵料，乳酸含量為48.67mg/g；適宜發(fā)酵的芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌BLCC1-0281，發(fā)酵72h時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到2.275×1010CFU/g，且中性蛋白酶活性達(dá)到3207U/g；篩選得到的乳酸桿菌和芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵時(shí)，以乳酸桿菌和芽孢桿菌兩者接種比例為3∶1，接種量為2%，37℃需氧發(fā)酵72 h時(shí)乳酸桿菌活菌數(shù)為5.35×109CFU/g，芽孢桿菌活菌數(shù)為7.80×109CFU/g，中性蛋白酶活性為1 407.83 U/g，此時(shí)乳酸桿菌和芽孢桿菌能夠同時(shí)發(fā)酵。

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Effect of Lactobacillus rhamnosus and Bacillus subtilis fermentation on feed quality

XIE Quanxi，QI Xiuye，XU Hui，YU Jiamin，XU Haiyan，GU Wei
（Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.，Ltd.，Taian 271000，China）

Bydetermination of fermented feed pH，viable count of bacteria，lactic acid content and neutral protease activity，theLactobacillus rhamnosus BLCC2-0038 andBacillus subtilisBLCC1-0281 that was suitable for basic feed fermentation were screened，and the fermentation conditions of single and double-strains were researched.Results indicated that at the condition ofL.rhamnosusBLCC2-0038 single strain fermentation for 72 h，the feed pH reduced to 3.73，the viable count reached to 2.28×1010CFU/g，and the neutral protease activity was 3 207 U/g.The optimum conditions for L.rhamnosusBLCC2-0038 andB.subtilisBLCC1-0281 double-strains fermentation（ratio 3∶1），aerobic fermentation，inoculum 2%，fermentation time 72 h.The viable count ofL.rhamnosusandB.subtiliswere 5.35×109CFU/g and 7.80×109CFU/g，respectively，and the neutral protease activity was 1 407.83 U/g.

Lactobacillus rhamnosus；Bacillus subtilis；fermented feed；lactic acid；neutral protease；aerobic fermentation

S816.6

0254-5071（2016）02-0053-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.012

2015-11-20

泰安市科技發(fā)展計(jì)劃（201540701）

謝全喜（1984-），女，副研究員，碩士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。