周　波，張翠英，陳葉福，石婷婷，劉小二，肖冬光（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

高濃高溫對(duì)啤酒酵母發(fā)酵性能的影響

周波，張翠英，陳葉福，石婷婷，劉小二，肖冬光*
（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

以啤酒酵母S-6為實(shí)驗(yàn)菌株，研究了主發(fā)酵溫度和原麥汁濃度對(duì)啤酒發(fā)酵的殘?zhí)?、酒精度、風(fēng)味物質(zhì)和絮凝性等性能指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，原麥汁濃度一定時(shí)，主發(fā)酵溫度對(duì)高級(jí)醇和乙酸酯的含量影響較大，主發(fā)酵溫度由10℃提高至16℃時(shí)，高級(jí)醇含量提高了10%～20%，乙酸酯含量提高了8%～16%，但CO2累積質(zhì)量損失、殘?zhí)?、酒精度和絮凝性基本不受溫度的影響；主發(fā)酵溫度一定時(shí)，原麥汁濃度對(duì)酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低，將高濃（18°Bx）發(fā)酵液稀釋50%至常濃（12°Bx），殘?zhí)?、酒精度和高?jí)醇的含量與常濃發(fā)酵液基本相同。該研究為選育高溫高濃發(fā)酵低產(chǎn)高級(jí)醇同時(shí)強(qiáng)絮凝性酵母菌株提供了重要依據(jù)。

高濃發(fā)酵；高溫發(fā)酵；高級(jí)醇；乙酸酯；絮凝性

啤酒高濃釀造技術(shù)由美國(guó)和加拿大在20世紀(jì)70年代率先推出，現(xiàn)在，北美和北歐的一些國(guó)家已將高濃釀造稀釋法作為通常的生產(chǎn)技術(shù)，國(guó)內(nèi)高濃釀造技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，啤酒行業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)也越來(lái)越激烈。啤酒高濃釀造是指在啤酒釀造過(guò)程中糖化得到較高的麥芽汁濃度（14°P以上），并在發(fā)酵后期用飽和的CO2脫氧水稀釋成常規(guī)濃度啤酒（10～12°P）的技術(shù)。高濃釀造的優(yōu)點(diǎn)是在不增加糖化、發(fā)酵等相關(guān)生產(chǎn)設(shè)備的基礎(chǔ)上，能夠大大提高企業(yè)啤酒的生產(chǎn)能力，減少能源消耗，降低生產(chǎn)成本［1-2］。但是，高濃度的麥芽汁也會(huì)給啤酒釀造帶來(lái)一系列的問(wèn)題，如發(fā)酵不完全，殘?zhí)橇扛?，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，泡沫穩(wěn)定性差，啤酒風(fēng)味不協(xié)調(diào)等［3-5］。楊小蘭等［6］研究表明，高濃釀造過(guò)程中高級(jí)醇的生成與接種量、糖漿濃度、α-氨基酸態(tài)氮含量有關(guān)，18°Bx麥汁發(fā)酵的高級(jí)醇生成量顯著高于12°Bx麥汁發(fā)酵的高級(jí)醇生成量。RUSSELI等［7-8］認(rèn)為高濃麥汁與常濃麥汁相比，其增加的酯水平是成比例的，而ANDERSON R等［4］報(bào)道與傳統(tǒng)的麥汁相比，高濃麥汁發(fā)酵產(chǎn)生更多的酯類(lèi)和高級(jí)醇，尤其是乙酸乙酯和乙酸異戊酯，但與原麥汁濃度不成比例。高濃釀造對(duì)啤酒酵母的影響也很大，主要表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)的變化、細(xì)胞活性的降低，發(fā)酵性能的降低等。啤酒企業(yè)最直接的感受則是酵母使用代數(shù)降低、絮凝性變差、酵母自溶等［9］。

在主發(fā)酵過(guò)程中，溫度的控制是至關(guān)重要的，主發(fā)酵溫度低，麥汁濃度下降慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)；反之，主發(fā)酵溫度高，麥汁濃度下降快，發(fā)酵周期縮短。就下面發(fā)酵啤酒酵母而言，低溫發(fā)酵的溫度控制在7.5～9.0℃，高溫發(fā)酵的溫度控制在10～13℃［1，10］。提高主發(fā)酵溫度，可以加快酵母的繁殖和發(fā)酵，這是對(duì)縮短發(fā)酵周期有利的方面。但是提高溫度后，酵母的代謝作用發(fā)生變化，將產(chǎn)生多量的酯類(lèi)、高級(jí)醇等揮發(fā)性物質(zhì)，嚴(yán)重影響啤酒的風(fēng)味［11］。近年來(lái)，關(guān)于提高啤酒主發(fā)酵溫度方面的研究不多，肖冬光等［12］以啤酒酵母SC-4為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外（ultraviolet，UV）誘變育種后獲得一株亮氨酸缺陷型菌株MS-11，此突變株在較高的主發(fā)酵溫度（14℃）條件下高級(jí)醇生成量為65.35 mg/L，與出發(fā)菌株在9℃發(fā)酵條件下的高級(jí)醇生成量63.24 mg/L基本相當(dāng)。

本研究以啤酒酵母S-6為出發(fā)菌株，通過(guò)改變啤酒的發(fā)酵工藝條件，研究原麥汁濃度和主發(fā)酵溫度對(duì)啤酒酵母發(fā)酵性能的影響，為下一步選育適于高濃高溫發(fā)酵的啤酒酵母提供重要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

下面發(fā)酵工業(yè)啤酒酵母菌株S-6（Saccharomyces cerevisiae）：天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：1%酵母提取物，2%葡萄糖，2%蛋白胨，pH6.0，121℃滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱(chēng)量一定量粉碎的麥芽，按1∶4（g∶mL）的料水比糖化至碘檢完畢，通過(guò)蒸發(fā)濃縮的方式制得18°Bx高濃麥汁，再利用糖度計(jì)調(diào)整外觀糖度至12°Bx，制得常濃麥汁，115℃、0.1 MPa滅菌20 min。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均使用麥芽汁培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基各組分配比均為質(zhì)量體積比（g∶mL），固體培養(yǎng)基需加2%瓊脂。

1.2儀器與設(shè)備

ZXJD-A1270恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；25mL附溫比重瓶：安徽省鳳陽(yáng)縣玻璃廠；50mL具塞比色管：濟(jì)寧佰一化工有限公司；UV-5200型紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；7890A型氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3方法

1.3.1不同發(fā)酵工藝的確定

4種不同的發(fā)酵工藝條件，分別為①常濃常溫（12°Bx、10℃）、②常濃高溫（12°Bx、16℃）、③高濃常溫（18°Bx、10℃）、④高濃高溫（18°Bx、16℃）。

1.3.2啤酒發(fā)酵過(guò)程

菌種活化：保存菌種轉(zhuǎn)接至YEPD斜面試管30℃活化培養(yǎng)2 d。

一級(jí)種子培養(yǎng)：取斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL麥汁的試管中，28℃靜置培養(yǎng)24 h。

二級(jí)種子培養(yǎng)：一級(jí)種子液按10%的接種量接入盛有50 mL麥汁的150 mL三角瓶?jī)?nèi)，16℃靜置培養(yǎng)36 h。

啤酒發(fā)酵：二級(jí)種子液經(jīng)過(guò)離心得到酵母泥，酵母泥按0.5%的接種量接入盛有150 mL麥汁的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，靜置發(fā)酵10～14d。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定CO2累積質(zhì)量損失、酒精度、殘?zhí)?、風(fēng)味物質(zhì)和酵母絮凝性等啤酒指標(biāo)和酵母發(fā)酵性能。

1.3.3測(cè)定方法

CO2質(zhì)量損失測(cè)定：發(fā)酵前預(yù)先稱(chēng)量發(fā)酵體系總質(zhì)量，發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h稱(chēng)質(zhì)量一次，稱(chēng)質(zhì)量前應(yīng)先搖晃三角瓶，以去除發(fā)酵液中的CO2，當(dāng)質(zhì)量損失＜0.1 g時(shí)，表示發(fā)酵基本結(jié)束。

殘?zhí)恰⒕凭群桶l(fā)酵度的測(cè)定：酒精度和發(fā)酵度依據(jù)啤酒分析方法進(jìn)行測(cè)定［13］；利用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)牵?4］。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定：啤酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后采用氣相色譜法測(cè)定［15］。

（1）色譜條件

毛細(xì)管色譜柱（19091N-213）：30 m×320 μm×0.5 μm；柱溫：75℃；進(jìn)樣室溫度：200℃；火焰離子檢測(cè)器溫度：230℃；H2：30 mL/min，N2：20 mL/min，空氣：400 mL/min；隔吹掃流量：3 mL/min，分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

（2）試樣前處理

發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)蒸餾發(fā)酵液得到酒樣，取內(nèi)標(biāo)液（乙酸正丁酯）0.1 mL，并用上述酒樣定容至10 mL，得酒樣稀釋液。

（3）分析方法

進(jìn)樣需要檢測(cè)的高級(jí)醇和酯類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，測(cè)得各物質(zhì)保留時(shí)間。再進(jìn)酒樣稀釋液，根據(jù)各物質(zhì)的保留時(shí)間初步定性各物質(zhì)，根據(jù)各組分峰面積用內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算各組分含量。

酵母絮凝性的測(cè)定方法：光密度改良法測(cè)定酵母絮凝性［16］。

2　結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵速度的影響

圖1　不同發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵速度的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on fermentation rate

按照1.3.2的方法進(jìn)行發(fā)酵，12 h測(cè)量一次CO2質(zhì)量損失，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，CO2的累積質(zhì)量損失為縱坐標(biāo)繪制CO2的累積質(zhì)量損失曲線，4種發(fā)酵工藝對(duì)啤酒發(fā)酵速度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，原麥汁濃度為12°Bx或18°Bx時(shí)，高溫發(fā)酵（16℃）比常溫發(fā)酵（10℃）的發(fā)酵周期都縮短了3 d，說(shuō)明當(dāng)原麥汁濃度相同時(shí)，主發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵速度影響較大，主發(fā)酵溫度越高，發(fā)酵速度越快，發(fā)酵周期越短，但是，同一原麥汁濃度條件下的不同主發(fā)酵溫度對(duì)CO2的累積質(zhì)量損失基本沒(méi)有影響。主發(fā)酵溫度為10℃時(shí)，高濃（18°Bx）發(fā)酵的CO2的累積質(zhì)量損失是常濃（12°Bx）發(fā)酵的1.43倍；主發(fā)酵溫度為16℃時(shí)，高濃發(fā)酵的CO2的累積質(zhì)量損失是常濃發(fā)酵的1.5倍，說(shuō)明當(dāng)主發(fā)酵溫度相同時(shí)，18°Bx和12°Bx麥汁發(fā)酵后的CO2累積質(zhì)量損失變化比例符合濃度變化的比例。

2.2不同發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵性能的影響

將啤酒酵母菌株S-6按照4種不同的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的殘?zhí)?、酒精度和發(fā)酵度，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，原麥汁濃度為12°Bx，主發(fā)酵溫度為10℃時(shí)，殘?zhí)?、酒精度和發(fā)酵度分別為（0.60±0.02）g/100mL、（4.54±0.12）%vol和（71.23±0.82）%，原麥汁濃度為12°Bx、主發(fā)酵溫度為16℃時(shí)，殘?zhí)?、酒精度和發(fā)酵度分別為（0.65±0.02）g/100 mL、（4.50±0.05）%vol和（72.48±0.34）%，通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)原麥汁濃度相同時(shí)，不同主發(fā)酵溫度條件下測(cè)得的殘?zhí)?、酒精度和發(fā)酵度沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明原麥汁濃度相同時(shí)，主發(fā)酵溫度對(duì)殘?zhí)?、酒精度和發(fā)酵度等主要發(fā)酵性能沒(méi)有影響。用高濃麥汁（18 °Bx）發(fā)酵時(shí)，可以得出上述相同的結(jié)論。

比較相同主發(fā)酵溫度條件下的不同原麥汁濃度發(fā)酵后的殘?zhí)?、酒精度發(fā)現(xiàn)，隨著原麥汁濃度的提高，殘?zhí)呛途凭榷加兴?。主發(fā)酵溫度為10℃時(shí)，用12°Bx麥汁發(fā)酵的殘?zhí)菫?.60 g/100 mL，用18°Bx麥汁發(fā)酵的殘?zhí)菫?.95 g/100 mL，較12°Bx麥汁發(fā)酵的殘?zhí)翘岣吡?.58倍，接近于原麥汁濃度提高的倍數(shù)，同樣地，18°Bx麥汁發(fā)酵的酒精度較12°Bx麥汁發(fā)酵的酒精度提高了0.53倍。上述結(jié)果表明，18°Bx和12°Bx麥汁發(fā)酵后的殘?zhí)呛途凭群孔兓谋稊?shù)基本符合麥汁濃度變化的倍數(shù)，即將18°Bx麥汁的發(fā)酵液稀釋50%后可達(dá)到常濃麥汁的酒精度和殘?zhí)橇俊?/p>

發(fā)酵度反映了酵母對(duì)糖類(lèi)的發(fā)酵情況，有些酵母不能或較少地發(fā)酵麥芽三糖，表現(xiàn)為低發(fā)酵度；有些酵母能發(fā)酵麥芽四糖或異麥芽糖，表現(xiàn)為高發(fā)酵度［17］。從表1可以看出，不同的發(fā)酵條件對(duì)啤酒的發(fā)酵度影響不大，四種發(fā)酵工藝條件下的啤酒發(fā)酵度都處于較高的水平。

2.3不同發(fā)酵工藝對(duì)高級(jí)醇和乙酸酯含量的影響

發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾，獲得待測(cè)酒樣，采用氣相色譜法測(cè)定酵母菌株S-6在不同發(fā)酵工藝條件下發(fā)酵液中高級(jí)醇和乙酸酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　不同發(fā)酵工藝條件對(duì)發(fā)酵性能的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on fermentation performance

表2　不同發(fā)酵工藝條件高級(jí)醇和乙酸酯含量的比較Table 2 Comparison of higher alcohols and acetic esters production under different fermentation conditions mg/L

從表2可以看出，發(fā)酵工藝條件的不同對(duì)總高級(jí)醇和總乙酸酯的影響較大，原麥汁濃度為12°Bx時(shí)，16℃發(fā)酵產(chǎn)生的總高級(jí)醇含量比10℃發(fā)酵時(shí)提高了14.0%，總乙酸酯的含量提高了16.2%；原麥汁濃度為18°Bx時(shí)，16℃發(fā)酵產(chǎn)生的總高級(jí)醇含量比10℃發(fā)酵時(shí)提高了13.0%，總乙酸酯的含量提高了8.0%。在相同的原麥汁濃度條件下，經(jīng)SPSS軟件分析，不同主發(fā)酵溫度生成的總高級(jí)醇和總乙酸酯有顯著性差異，主發(fā)酵溫度越高，總高級(jí)醇和總乙酸酯的含量越高。當(dāng)發(fā)酵溫度相同時(shí)，原麥汁濃度越高，發(fā)酵液中總高級(jí)醇和總乙酸酯的含量越高。但將高濃（18°Bx）發(fā)酵液稀釋50%達(dá)到常濃（12°Bx），此時(shí)總高級(jí)醇含量與常濃發(fā)酵液的總高級(jí)醇含量基本相同，說(shuō)明總高級(jí)醇的含量是與原麥汁濃度的提高基本成比例的。但是，總乙酸酯的含量與原麥汁濃度的提高不成比例，高濃度稀釋啤酒較同濃度發(fā)酵的啤酒含有較多的酯類(lèi)。

2.4不同發(fā)酵工藝條件對(duì)酵母絮凝性的影響

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)離心、洗滌等步驟獲得酵母泥，按照1.3.3方法測(cè)定酵母的絮凝性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同發(fā)酵工藝條件對(duì)酵母絮凝性的影響Table 3 Effects of different fermentation conditions on yeast flocculation

酵母絮凝性是啤酒酵母的一個(gè)重要特性，絮凝性的強(qiáng)弱不僅對(duì)啤酒的發(fā)酵周期、過(guò)濾性能等生產(chǎn)過(guò)程控制具有重要意義，而且會(huì)影響到啤酒的風(fēng)味，在生產(chǎn)上具有特殊的意義，也是區(qū)別酵母菌株的一項(xiàng)重要內(nèi)容［18］。由表3可以看出，不同的發(fā)酵工藝條件對(duì)酵母絮凝性的影響不同。通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，主發(fā)酵溫度相同時(shí)，不同原麥汁濃度對(duì)酵母絮凝性有顯著影響（P＜0.05），主發(fā)酵溫度為10℃時(shí)，18°Bx麥汁發(fā)酵的酵母絮凝性較12°Bx麥汁發(fā)酵的酵母絮凝性降低了10.4%，而主發(fā)酵溫度為16℃時(shí)，18°Bx麥汁發(fā)酵的酵母絮凝性較12°Bx麥汁發(fā)酵的酵母絮凝性降低了12.5%。但是，同一主發(fā)酵溫度條件下的不同原麥汁濃度對(duì)酵母的絮凝性影響不大。結(jié)果表明，主發(fā)酵溫度對(duì)酵母絮凝性的影響沒(méi)有原麥汁濃度對(duì)酵母絮凝性的影響大，原麥汁濃度越高，酵母的絮凝性越低。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了原麥汁濃度和主發(fā)酵溫度對(duì)啤酒發(fā)酵各項(xiàng)性能指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，主發(fā)酵溫度不僅影響啤酒發(fā)酵的速度，還影響啤酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量。主發(fā)酵溫度由10℃升至16℃，高級(jí)醇含量提高了10%～20%，乙酸酯含量提高了8%～16%。而且主發(fā)酵溫度對(duì)CO2的累積質(zhì)量損失、殘?zhí)恰⒕凭群托跄缘挠绊懖淮?；原麥汁濃度越高，酵母的絮凝性越低，但殘?zhí)?、酒精度和高?jí)醇的含量與原麥汁濃度的提高基本成比例。

高溫發(fā)酵通過(guò)選育低產(chǎn)高級(jí)醇的啤酒酵母菌株能夠降低啤酒中的高級(jí)醇含量，改善啤酒的風(fēng)味。高濃發(fā)酵通過(guò)選育強(qiáng)絮凝性的啤酒酵母，在啤酒發(fā)酵后期酵母能夠及時(shí)地沉降到發(fā)酵罐的底部，便于過(guò)濾［19-20］。綜上所述，選育出一株高溫高濃發(fā)酵低產(chǎn)高級(jí)醇同時(shí)強(qiáng)絮凝性的酵母菌株，既可以使啤酒的風(fēng)味保持在合理的閾值范圍內(nèi)，又可以達(dá)到節(jié)約能耗，降低生產(chǎn)成本的目的。

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Effects of high gravity and high temperature on fermentation performance of beer yeast

ZHOU Bo，ZHANG Cuiying，CHEN Yefu，SHI Tingting，LIU Xiaoer，XIAO Dongguang*
（KeyLab ofIndustrial FermentingMicrobiology，MinistryofEducation，College ofBioengineering，Tianjin UniversityofScience and Technology，Tianjin 300457，China）

Using beer yeast S-6 as experimental strain，the effects of main fermentation temperature and initial wort gravity on alcohol content，flavor substance，flocculability and other fermentation characters by beer yeast S-6 were studied.The results showed that under certain initial wort gravity，the main fermentation temperature had great effects on higher alcohols and acetic esters.When the main fermentation temperature increased from 10℃to 16℃，higher alcohols content increased 10%to 20%，acetic esters increased 8%to 16%，but no effects on total loss of CO2，residual sugar，alcohol content and flocculability.In addition，the initial wort gravity had great effects on flocculability under certain main fermentation temperature；the original wort concentration was higher，while the flocculability of beer yeast was lower.When the high-gravity fermentation broth（18°Bx）was diluted50%totheconventionalgravity（12°Bx），therewasnosignificantdifferencesinresidualsugar，alcoholcontentandhigheralcoholswithcommon fermentation broth.The research provided an important basis for breeding a low-yielding higher alcohols and strong flocculability beer yeast under high temperature and high gravity fermentation process.

high gravity fermentation；high temperature fermentation；higher alcohols；acetic esters；flocculability

Q815；TS261.4；TS262.5

0254-5071（2016）02-0009-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.003

2015-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31271916）

周波（1988-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。

肖冬光（1956-），男，教授，博士，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代釀造技術(shù)。