李鵬

（湖北省襄陽市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，湖北 襄陽 441021）

論著

微小RNA Let-7/Lin28調(diào)節(jié)環(huán)與鼻咽癌血管新生的關(guān)系研究

李鵬

（湖北省襄陽市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，湖北 襄陽 441021）

目的探討微小RNA Let-7/Lin28調(diào)節(jié)環(huán)與鼻咽癌促血管生成因子的關(guān)系，并研究這一關(guān)系的作用機(jī)制。方法選取2012年4月-2014年在湖北省襄陽市中心醫(yī)院耳鼻喉科就診的鼻咽癌患者54例。另選取同期40例慢性鼻炎患者和32例健康者作為對照組。采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測組織中Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA相對表達(dá)量，ELISA檢測血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）及內(nèi)皮抑素（ES）水平，蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況，分析m iRNA Let-7a/Lin28調(diào)節(jié)環(huán)與血管新生因子的關(guān)系。結(jié)果RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者Lin28A m iRNA和Lin28B miRNA相對表達(dá)量均高于慢性鼻炎組和健康對照組（P＜0.05），而Let-7amiRNA的相對表達(dá)量低于上述兩組（P＜0.05）；ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者組VEGF、bGFG、ES表達(dá)量均高于慢性鼻炎組和健康對照組（P＜0.05）；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者組病理組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達(dá)量高于慢性鼻炎患者組和健康對照組（P＜0.05），而p-PTEN表達(dá)量低于上述兩組（P＜0.05）；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Lin28A、Lin28B m iRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關(guān)（P＜0.05），Let-7a m iRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論miRNA Lin28/Let-7調(diào)節(jié)環(huán)與血管新生有定的關(guān)聯(lián)性，而這一關(guān)聯(lián)性可能與激活Ras/PI3K/PTEN/Akt通路有關(guān)。

Lin28A；Lin28B；Let-7a；促血管生成因子；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

鼻咽癌是我國南方較為常見的一種惡性腫瘤，采用調(diào)強(qiáng)放療為主的綜合治療可以取得較為理想的效果［1］。但是臨床發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌診斷時多處在晚期，且出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移。因此早診斷、早治療是鼻咽癌患者延緩生存期的重要前提保證［2］。miRNA Let-7家族在惡性腫瘤中表達(dá)下降，而Lin28A、Lin28B則升高。目前，已有臨床報道證實［3］，miRNA Let-7/Lin28與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)性，而癌癥的發(fā)生、發(fā)展，尤其是淋巴轉(zhuǎn)移與血管新生有著密切關(guān)系。那么鼻咽癌患者miRNA Let-7/Lin28與血管新生是否具有相關(guān)性以及這一相關(guān)性的作用機(jī)制如何值得研究［4］。本研究旨在探討miRNA Let-7/Lin28與促血管生成因子的關(guān)聯(lián)性，以及這一關(guān)系的作用機(jī)制，以期揭示miRNA與鼻咽癌淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)而為分子的靶向治療提供一定的實驗基礎(chǔ)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對象

選擇2012年4月-2014年在湖北省襄陽市中心醫(yī)院耳鼻喉科就診的鼻咽癌患者54例。所有患者經(jīng)病理組織活檢證實為鼻咽癌，其中，男性43例，女性11例，年齡33～69歲，平均（47.1±6.9）歲。根據(jù)中國鼻咽癌臨床分期委員會“2008年鼻咽癌分期診斷標(biāo)準(zhǔn)”將54例患者分為：初診患者40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期13例；14例出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移。另選取72例疑有腫瘤患者，經(jīng)病理組織活檢分為慢性咽炎患者和健康者并作為對照組。慢性咽炎組：40例，其中，男性31例，女性9例，年齡32～68歲，平均（46.5±6.4）歲。健康對照組：32例，其中，男性25例，女性7例，年齡34～70歲，平均（47.3±6.8）歲。所有患者均簽訂知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1病理標(biāo)本收集所有研究對象在局部麻醉下行內(nèi)鏡輔助鼻咽活檢術(shù)，取部分所采集病理組織標(biāo)本以多聚甲醛固定進(jìn)行病理學(xué)檢查，其余組織放入已消毒的離心管，置入液氮中，于-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清標(biāo)本采集所有研究對象在入選后均采取空腹肘靜脈血3m l并立即分離血清，置于-40℃冰箱冷凍中備用，統(tǒng)一測定。

1.2.3實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA將冷凍活檢的部分鼻咽組織以液氮吹打使細(xì)胞破裂，Trizol法抽提細(xì)胞中的總RNA，采用紫外分光光度計判定RNA的純度并以λ260 nm的光吸收值作為定量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR模板，設(shè)計靶基因Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及內(nèi)參U6snRNA的正反向引物（引物的正反序列見表1），以cDNA模板合成引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，瓊脂糖電泳進(jìn)行有效性驗證，將有效的 cDNA模板、Lin28A、Lin28B及Let-7a miRNA以及內(nèi)參U6snRNA進(jìn)行RT-PCR，嚴(yán)格按照SYBR Green（TOYOBO公司，日本）說明書進(jìn)行操作，在LightCyclerTM（Roche公司）PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct求得目的基因相對于內(nèi)參基因的相對表達(dá)量。△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因?！鳌鰿t表示正常鼻咽組織與鼻咽癌組織中差異程度。

1.2.4血管新生指標(biāo)檢測檢測的血管新生指標(biāo)有血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及血管內(nèi)皮抑素（Endostatin，ES）。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）進(jìn)行檢測，嚴(yán)格執(zhí)行說明書操作。

1.2.5蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測H-Ras/ PTEN/PI3K/Akt通路將冷凍活檢的部分鼻咽組織取出，通入液氮研磨使細(xì)胞充分破裂，將破碎的組織裝入玻璃混勻器中，按照100（1/10 ng加入適量裂解液，含PMSF），冰上孵育30min，然后4℃離心機(jī)，以12 000 r/min離心5 min，吸取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。組織總蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行定量。組織蛋白質(zhì)樣品加入1/4倍量5×SDS上樣緩沖液進(jìn)行混勻，煮沸變性6 min左右，10% SDS-PAGE115V進(jìn)行電泳，210mA恒流1 h 40min濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（NC膜）上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉 3 h，加抗 H-Ras-21、PTEN、p-PI3K、p-Akt單抗（鼠抗人，1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，然后與結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBS洗膜3次，每次10 min，最后采用發(fā)光試劑盒ECL反應(yīng)，X膠片曝光顯影。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)用單因素方差分析，Western blot圖片用Image J4.2進(jìn)行掃描灰度值。用pearson相關(guān)性分析指標(biāo)相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　引物序列

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測結(jié)果

研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者Lin28A miRNA、Lin28B miRNA相對表達(dá)量均高于慢性鼻炎組、健康對照組（P＜0.05），而Let-7a miRNA的相對表達(dá)量低于上述兩組（P＜0.05），見表2。

2.2血管新生因子測定結(jié)果

血清研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者組VEGF、bGFG、ES表達(dá)量均高于慢性鼻炎組、健康對照組（P＜0.05），見表3。

2.3Western blot檢測結(jié)果

檢測結(jié)果顯示，鼻咽癌患者組病理組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達(dá)量高于慢性鼻炎患者組、健康對照組（P＜0.05），而p-PTEN表達(dá)量低于上述兩組（P＜0.05），見表4和附圖。

表2　RT-PCR檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相對量的結(jié)果比較 （）

表2　RT-PCR檢測Lin28A、Lin28B及Let-7a m iRNA相對量的結(jié)果比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

組別Let-7amiRNA健康對照組　32　2.23±0.61　2.21±0.43　1.49±0.31慢性鼻炎組　40　2.75±0.56　3.49±0.691）　1.27±0.291）鼻咽癌組　54　3.64±0.872）　4.58±0.762）　0.83±0.242）F值　10.41　21.36　8.93 P值　0.019　0.000　0.027例數(shù)Lin28AmiRNA Lin28BmiRNA

表3　不同組別血管新生因子結(jié)果比較 （）

表3　不同組別血管新生因子結(jié)果比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

ES/（ng/L）健康對照組　32　25.47±6.13　12.65±2.89　31.69±4.65慢性鼻炎組　40　31.32±9.601）　19.20±3.531）　32.32±6.31鼻咽癌組　54　50.43±10.122）　30.33±4.182）　76.62±6.332）F值　19.47　10.71　8.83 P值　0.000　0.014　0.031組別例數(shù)VEGF/（pg/ml）bFGF/（pg/ml）

表4　Western blot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情況比較 （）

表4　Western blot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白灰度值比情況比較 （）

注：1）與健康對照組比較，P＜0.05；2）與慢性鼻炎組比較，P＜0.05

組別p-Akt健康對照組 0.345±0.023 0.462±0.017 0.126±0.015　0.107±0.013慢性鼻炎組0.449±0.0311）0.298±0.0211）0.212±0.0201）0.237±0.0191）鼻咽癌組　0.824±0.0442）0.253±0.0242）0.351±0.0272）0.428±0.0262）F值　13.58　18.32　12.36　19.38 P值　0.010　0.009　0.011　0.007 H-Ras p-PTEN p-PI3K

附圖　Western b lot檢測H-Ras/PTEN/PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)情況

表5　相關(guān)性分析結(jié)果

2.4相關(guān)性分析

表5相關(guān)性分析顯示，Lin28A、Lin28B miRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關(guān)（P＜0.05），與p-PTEN呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Let-7a miRNA與VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與p-PTEN呈正相關(guān)（P＜0.05）。

3　討論

鼻咽癌是我國南方較為常見的一種惡性腫瘤，采用調(diào)強(qiáng)放療為主的綜合治療方法是目前非常有效的方式之一，但是該病隱匿性較高、轉(zhuǎn)移傾向較為強(qiáng)烈，大約有75%的患者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌時在晚期，其局部已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此盡早診斷是臨床治愈該病的關(guān)鍵點［5］。臨床研究結(jié)果顯示［6］，該病與編碼區(qū)基因有關(guān)，其非編碼區(qū)基因與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系，特別是一類高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，約有50%左右的miRNA定位于腫瘤相關(guān)基因區(qū)域，染色體出現(xiàn)異常時miRNA的基因拷貝數(shù)出現(xiàn)變化，研究證實［7］miRNA參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的每一個環(huán)節(jié)。有報道指出miRNA經(jīng)過長期保存、反復(fù)凍融后仍然可以穩(wěn)定存在，其在腫瘤患者循環(huán)中的表達(dá)譜相對于正常人具有顯著性差異［8］。因此miRNA具有穩(wěn)定、不易降解、高效、易得等特點，可以作為腫瘤標(biāo)志物。在多種人類癌癥中，Let-7 miRNA家族的表達(dá)發(fā)生明顯的改變，其調(diào)控多種癌相關(guān)基因表達(dá)情況，具有“抑癌基因”的功能［9］。Lin28是廣泛表達(dá)于惡性腫瘤細(xì)胞中的RNA結(jié)合蛋白，研究證實其為Let-7生物合成的重要負(fù)向調(diào)節(jié)因子，也有研究證實，Lin28反過來成為Let-7的主要作用靶點，兩者構(gòu)成了調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展的“雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)”［10］。黃孝文等［4］已經(jīng)有研究證實，鼻咽癌患者組織中存在Lin28表達(dá)上調(diào)，而Let-7a表達(dá)下調(diào)。本研究也證實鼻咽癌患者組織中存在Lin28A、Lin28B均出現(xiàn)上調(diào)，而Let-7a出現(xiàn)下調(diào)，與黃孝文所研究的基本一致。這也說明鼻咽癌患者存在Lin28/Let-7調(diào)節(jié)環(huán)的表達(dá)異常。但需要指出的是黃等并未探討Lin28/Let-7調(diào)節(jié)環(huán)與血管新生的關(guān)系以及關(guān)聯(lián)性的作用機(jī)制。

惡性腫瘤的主要臨床特征表現(xiàn)在癌細(xì)胞容易侵襲周圍組織以及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而其轉(zhuǎn)移主要是通過新生血管和淋巴管進(jìn)行轉(zhuǎn)移［11］。新生血管已經(jīng)被證實為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通道，其中VEGF和bFGF是促血管新生作用最強(qiáng)且特異性最高的兩種因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，從而促進(jìn)新生血管的形成，而新生血管的形成為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通道以及營養(yǎng)支持，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散［12］。通過本研究顯示，鼻咽癌患者血清中VEGF、bFGF的表達(dá)量高于慢性鼻炎組、健康對照組。促血管生成與抗血管生成共同構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。研究顯示［13］，ES增高的惡性腫瘤患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移增加的現(xiàn)象，其原因是ES的增高間接的反映出血管新生因子的表達(dá)量也明顯增加，因此本研究也發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者血清中ES含量明顯高于慢性鼻炎組、健康對照組。

Lin28/Let-7調(diào)節(jié)環(huán)影響多種基因、蛋白的表達(dá)，主要有C-myc基因、Ras基因、高遷移率組蛋白等。有研究發(fā)現(xiàn)［14］，H-Ras的過表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示，Ras可以通過Raf//MEK/ ERK和PI3K/PTEN/Akt等通路介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而PI3K/PTEN/Akt通路是目前公認(rèn)的血管新生通路，該通路上的PI3K、Akt蛋白出現(xiàn)磷酸化后將導(dǎo)致VEGF、bFGF等促血管生成因子的高表達(dá)［15］。通過Western blot證實鼻咽癌患者組織中H-Ras、p-PI3K及p-Akt表達(dá)量高于慢性鼻炎患者組、健康對照組，而p-PTEN表達(dá)量低于上述兩組，該結(jié)果說明鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt被激活，導(dǎo)致促血管生成因子高表達(dá)。通過pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Lin28A、Lin28B miRNA與 VEGF、bFGF、H-Ras、p-PI3K及p-Akt呈正相關(guān)，Let-7a miRNA與VEGF、bFGF、HRas、p-PI3K及p-Akt呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果說明Lin28/ Let-7對鼻咽癌患者PI3K/PTEN/Akt及其下游的促血管生成因子有一定的影響。通過本研究顯示，Lin28/Let-7與促血管生成因子具有一定的關(guān)聯(lián)性，而該關(guān)聯(lián)性可能是由于PI3K/PTEN/Akt通路被激活所致。

綜上所述，miRNA Lin28/Let-7調(diào)節(jié)環(huán)與血管新生有定的關(guān)聯(lián)性，而該關(guān)聯(lián)性可能與激活PI3K/ PTEN/Akt通路有關(guān)。

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（張蕾編輯）

Relationship between m iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal angiogenesis

Peng Li
（Department of ENT，Xiangyang Central Hospital，Xiangyang，Hubei 441021，China）

Objective To investigate the relationship betweenm iRNA Let-7/Lin28 feedback loop and nasopharyngeal pro-angiogenesis factors，and to study themechanism of its effect.Methods From April 2012 to 2014，54 cases of nasopharyngeal carcinoma（NPC）therapied in ENT in Xiangyang Central Hospital were selected，and 40 cases of chronic rhinitis patients and 32 healthy subjects were selected as control groups.Expressions of Lin28A，Lin28B and Let-7amiRNA relative were detected by RT-PCR，and the levels of VEGF，bFGF and ES in serum were detected by ELISA.Expressions of protein in H-Ras/PTEN/PI3K/Akt pathway were detected by western blotting，and relationship between miRNA Let-7a/Lin28 feedback loop and angiogenesis factors was analyzed.Results Expression levels of Lin28A miRNA，Lin28B miRNA in NPC patients were relatively higher than the other two groups，and the relative expression of Let-7a miRNA was less than the other two groups（P＜0.05）.ELISA test found that expressions of VEGF，bGFG，ES in NPC patients were higher than the control groups（P＜0.05）.Expressions of H-Ras，p-PI3K and p-Akt in NPC patients pathology tissue were higher than the other two groups（P＜0.05），and expression of p-PTEN was less than the above two groups（P＜0.05）.The correlation analysis showed thatLin28A，Lin28BmiRNA were positively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05），and Let-7am iRNA was negatively correlated with VEGF，bFGF，H-Ras，p-PI3K and p-Akt（P＜0.05）.Conclusions miRNA Lin28/Let-7 feedback loop has certain correlation with angiogenesis，and this associationmay related to the activation of Ras/PI3K/PTEN/Akt pathway.

Lin28A；Lin28B；Let-7a；angiogenic factor；H-Ras/PTEN/PI3K/Akt

R 739.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.010

1005-8982（2016）12-0044-05

2015-11-17