史東沙，董艷迎，趙麗華，謝明

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部 免疫學(xué)與病原生物學(xué)系，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061）

論著

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1和腫瘤壞死因子-α對(duì)漢灘病毒感染的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用*

史東沙1，董艷迎1，趙麗華2，謝明1

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部 免疫學(xué)與病原生物學(xué)系，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061）

目的探討腫瘤壞死因子-α和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1對(duì)漢灘病毒感染的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，為闡明腎綜合征出血熱發(fā)病過(guò)程中通透性增高的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法首先用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)情況，然后通過(guò)Transwell單層細(xì)胞模型系統(tǒng)檢測(cè)外源性腫瘤壞死因子-α和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1對(duì)漢灘病毒感染的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。結(jié)果牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，漢灘病毒感染對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1表達(dá)量無(wú)顯著性影響，漢灘病毒感染后加入腫瘤壞死因子-α使牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1表達(dá)量顯著性增加（P＜0.05）。單純漢灘病毒感染后，通透性無(wú)顯著性變化（P＞0.05），而感染細(xì)胞加入外源性腫瘤壞死因子-α或牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1后，內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增加（P＜0.05），兩者聯(lián)合作用能促進(jìn)通透性進(jìn)一步增加（P＜0.05）。結(jié)論牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1廣泛表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤壞死因子-α和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1均可使?jié)h灘病毒感染的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增高，且兩者存在聯(lián)合作用。

腎綜合征出血熱；transw ell單層細(xì)胞模型系統(tǒng)；通透性

腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever renal syndrome，HFRS）是一種以發(fā)熱、出血和急性腎功能損害為主要特征的急性傳染病，漢坦病毒（Hantavirus，HV）是HFRS的病原體，目前已經(jīng)確認(rèn)的漢坦病毒有23種，在我國(guó)流行的主要為漢灘型（hantaan virus，HTNV）［1-2］。HFRS的具體機(jī)制尚未闡明，但是HFRS發(fā)病過(guò)程中存在的免疫病理?yè)p傷已被公認(rèn)，其基本病變是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和滲透性增加導(dǎo)致的有效血容量下降，研究表明HFRS血管內(nèi)皮損傷的機(jī)制可能為病毒感染的免疫細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子作用：如病毒感染的單核/巨噬細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）在病程中表達(dá)異常并與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)，TNF-α在HFRS患者中水平增高，且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但TNF-α發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚［3］。

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）屬于小整合素結(jié)合配體N端聯(lián)接糖蛋白家族（small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein family，SIBLING）［4］。最早在牙本質(zhì)和骨組織中被發(fā)現(xiàn)，近期發(fā)現(xiàn)DMP1表達(dá)廣泛，在頜下腺組織和腫瘤組織中均有表達(dá)［5-6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，DMP1可以通過(guò)激活其伴侶基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）降解基底膜的Ⅳ型膠原和黏著連接的組成成分血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin），該過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致通透性的增高。而近期有研究顯示TNF-α可以促進(jìn)MMP9的表達(dá)［7］，因而推測(cè)TNF-α和DMP1可能在HFRS患者通透性增高過(guò)程中發(fā)揮聯(lián)合作用。

本研究的目的是，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)DMP1在 HTNV感染的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的表達(dá)情況，以及TNF-α對(duì)其表達(dá)量的影響。并通過(guò)Transwell單層細(xì)胞模型系統(tǒng)檢測(cè)DMP1及TNF-α對(duì)HTNV感染的HUVEC通透性的影響。為闡明HFRS發(fā)病過(guò)程中通透性增高的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和病毒

原代HUVEC購(gòu)自上海澳賽爾斯公司，采用該公司的內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)液，10%的胎牛血清和2%的生長(zhǎng)因子添加劑（含表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、環(huán)磷酸腺苷、肝素、醋酸氫化可的松、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B溶液等）。細(xì)胞培養(yǎng)瓶提前用0.25%的明膠（美國(guó)Sigma公司）包被以保證細(xì)胞能均勻生長(zhǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均保證細(xì)胞控制在p3到p5代內(nèi)使用。非洲綠猴腎細(xì)胞（African green monkey kidney cell，VERO）和漢灘病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株HTNV 76-118由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院感染科王平忠教授惠贈(zèng)。采用免疫熒光化學(xué)方法鑒定病毒在細(xì)胞的復(fù)制情況，并采用Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度。

1.2間接免疫熒光檢測(cè)病毒感染情況

VERO細(xì)胞在24孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至50%～60%時(shí)棄去培養(yǎng)基，加入HTNV懸液37℃培養(yǎng)2 h后棄去病毒懸液加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，病毒感染3 d后采用間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)。首先，用4%的多聚甲醛4℃固定20min，然后采用0.5%的TritonX-100室溫通透10min，5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉30min，然后加入鼠抗人HTNV 1A8抗體（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院感染科王平忠教授惠贈(zèng)，1∶1 000稀釋）4℃過(guò)夜。然后加入羊抗鼠異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（中國(guó)北京中杉金橋生物公司）37℃孵育1 h。每一步結(jié)束后均用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次5min。最后在熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）上觀察。

1.3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)DMP1在HUVEC的表達(dá)

將HUVEC爬片后用HTNV（感染復(fù)數(shù)=1）感染，3 d后加入TNF-α刺激30 min，PBS沖洗后加入4%的多聚甲醛4℃固定20min，加入0.5%的TritonX-100室溫通透10min，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加50μl內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10min，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加入50μl二抗動(dòng)物非免疫血清，室溫下孵育15min；甩干玻片上的血清，每張蓋玻片上滴加鼠抗人DMP1一抗（美國(guó)Santa Cruz公司，1∶100稀釋）4℃過(guò)夜，PBS沖洗3×5min，除去PBS，每張玻片加50μl生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），37℃放置1 h，PBS沖洗3×5min；除去PBS，每張玻片滴加50μl鏈霉素抗生物素過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育10min，PBS沖洗3×5min；除去PBS，每張玻片滴加一滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺顯色液，室溫下顯色2～10min，在顯微鏡下控制染色時(shí)間；將染色液沖洗干凈，干燥后中性樹(shù)膠封片，將樣品置于顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗進(jìn)行反應(yīng)。圖像半定量分析：顯微鏡觀察，每組隨機(jī)取15個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0分析各視野下平均光密度值（average optical density，AOD）。AOD為陽(yáng)性目標(biāo)光密度和陽(yáng)性面積比（IOD/area），代表待測(cè)抗原的量。

1.4Transwell單層細(xì)胞模型系統(tǒng)檢測(cè)HUVEC的通透性變化

HUVEC接種于基質(zhì)膠（10μg/m l）包被的Costar Transwell單層細(xì)胞模型系統(tǒng)（孔徑3μm），HUVEC生長(zhǎng)在內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基，細(xì)胞密度是3×104個(gè)；HTNV感染transwell系統(tǒng)中的HUVEC 3 d后，細(xì)胞密度接近100%，長(zhǎng)成均勻致密單層，HUVEC在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中饑餓過(guò)夜；FITC標(biāo)記的葡聚糖（FITC-dextran，0.5mg/m l）加入Transwell的上室，在相應(yīng)組加入TNF-α（10 ng/ml），DMP1（100 nmol/L），一式3份。反應(yīng)30min后，從每個(gè)transwell的下室吸取100μl樣品，樣品中葡聚糖的含量在熒光酶標(biāo)儀（490 nm處激發(fā)，530 nm處發(fā)射）中檢測(cè)，以檢測(cè)樣本中的相對(duì)熒光強(qiáng)度來(lái)反映TNF-α，DMP1與HTNV對(duì)HUVEC通透性的影響。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，免疫組織化學(xué)AOD值及transwell的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1VERO細(xì)胞及原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好（見(jiàn)圖1）

2.2HTNV感染的VERO和HUVEC鑒定及病毒滴度測(cè)定

HTNV感染72 h后幾乎所有的VERO細(xì)胞均被感染，HUVEC在HTNV感染72 h后也被感染，陰性對(duì)照組均無(wú)熒光。Reed-Muench法測(cè)定病毒的TCID 50為6.31×106/ml。

2.3DMP1在HUVEC的表達(dá)情況

免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示DMP1可以表達(dá)在HUVEC；HTNV感染可以導(dǎo)致其表達(dá)的輕微上升；感染細(xì)胞加入TNF-α后DMP1的表達(dá)量顯著升高（P=0.009）；單獨(dú)TNF-α刺激對(duì)DMP1的表達(dá)量無(wú)顯著性影響，見(jiàn)圖2和表1。

2.4DMP1、TNF-α對(duì)HTNV感染的HUVEC的通透性影響

DMP1和TNF-α均可顯著提高HTNV感染的HUVEC的通透性（見(jiàn)圖3A，3B），且兩者聯(lián)合作用后，感染HUVEC的通透性進(jìn)一步增加，與單獨(dú)作用比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3C，3D）。而DMP1，TNF-α單獨(dú)作用對(duì)于通透性的影響明顯低于HTNV感染組（見(jiàn)圖3A，3B）。如表2所示，HTNV單獨(dú)作用并不能提高HUVEC的通透性。

圖1　細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

圖2　DMP1在HUVEC的表達(dá)變化

表1　各組DMP1表達(dá)變化 （）

表1　各組DMP1表達(dá)變化 （）

組別TNF-α（+）HTNV（-）　0.147±0.019　0.169±0.018 HTNV（+）　0.168±0.014　0.174±0.014 TNF-α（-）

表2　各組通透性變化情況 （）

表2　各組通透性變化情況 （）

組別DMP1+TNF-α HTNV（-）　573±60　713±78　759±162　735±78 HTNV（+）　557±76　1113±254　985±149　1426±283空白組TNF-α DMP1

確定DMP1可以表達(dá)在HTNV感染的HUVEC后，筆者進(jìn)一步檢測(cè)DMP1和TNF-α對(duì)HTNV感染的HUVEC通透性的影響。結(jié)果顯示，DMP1和TNF-α均可顯著提高HTNV感染的HUVEC的通透性（P=0.000），且兩者聯(lián)合作用后感染HUVEC的通透性進(jìn)一步增加，與單獨(dú)作用比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與HTNV+TNF-α組比較，P=0.002，與HTNV+DMP1組比較，P=0.000）。而DMP1，TNF-α單獨(dú)作用對(duì)于通透性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HTNV感染組分別為（P=0.033和0.000）。HTNV單獨(dú)作用并不能提高HUVEC的通透性。見(jiàn)圖3和表2。

圖3　Transwell技術(shù)檢測(cè)HUVEC的通透性

3　討論

HTNV的主要靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，在病毒侵入人體后不久，機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，參與HFRS的發(fā)病過(guò)程。TNF-α是主要由單核巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生的一種調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和代謝過(guò)程的多功能細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫防御、炎癥損傷和休克等發(fā)生的重要介質(zhì)。TNF-α在體內(nèi)維持一定濃度對(duì)機(jī)體發(fā)揮生理功能有重要作用，但血中濃度過(guò)高，則可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，已有研究證實(shí)，HFRS患者中的TNF-α的水平增高且與疾病進(jìn)程密切相關(guān)［3］。HFRS基本的病理生理改變?yōu)槿砦⒀軗p傷，通透性增加，而TNF-α又可進(jìn)一步增加血管的通透性。然而TNF-α引起通透性增高的具體機(jī)制鮮有報(bào)道。

DMP1是一種非膠原蛋白，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)十分廣泛，在腎、腦、腫瘤組織等均有表達(dá)［8］。有研究證實(shí)，DMP1能通過(guò)激活其伴侶MMP9降解基底膜的IV膠原等成分，基底膜是一種特化的細(xì)胞外基質(zhì)，是細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)移的物理屏障［9］。本文證實(shí)，DMP1可以表達(dá)在HTNV感染的血管內(nèi)皮細(xì)胞，這說(shuō)明DMP1可能在HFRS的發(fā)病中扮演一定角色。HTNV單獨(dú)作用于HUVEC并不能引起通透性增高，病毒感染細(xì)胞加入TNF-α之后，DMP1的表達(dá)量顯著增加。DMP1可以活化重組人基質(zhì)金屬蛋白酶前體-9并增強(qiáng)MMP-9酶解活性，通過(guò)破壞局部組織結(jié)構(gòu)降解基底膜屏障，改建細(xì)胞外基質(zhì)，使通透性增加［9］。故筆者推測(cè)在HFRS的發(fā)病過(guò)程中，TNF-α通過(guò)促進(jìn)DMP1表達(dá)增加促使通透性增高。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DMP1和TNF-α均可使體外HTNV感染的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，且兩者聯(lián)合作用對(duì)通透性的增高作用明顯高于各自獨(dú)立作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α可以促進(jìn)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白VE-cadherin的磷酸化、內(nèi)化，并可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF和MMP-9的表達(dá)［10］。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白是內(nèi)皮細(xì)胞間黏著連接的主要成分［11］，鈣黏蛋白的內(nèi)化會(huì)導(dǎo)致黏著連接的解體，細(xì)胞間隙增大，這可能是TNF-α引起通透性增高的一方面原因。另一方面，TNF-α可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)［10］，而DMP1可以激活MMP-9，兩者可能聯(lián)合參與了降解基底膜的過(guò)程從而使通透性大大增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中DMP1和TNF-α的共同作用使HTNV感染的HUVEC通透性增加明顯，顯著高于單獨(dú)作用組，也支持這一推斷。

綜上所述，本文通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)證明DMP1可以表達(dá)在HTNV感染的HUVEC，且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明TNF-α和DMP1在可以促進(jìn)HTNV感染的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，且兩者存在聯(lián)合作用，該結(jié)果為闡明TNF-α引起通透性增高的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持，MMP-9在HFRS中的直接作用將在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。

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（張蕾編輯）

Function of DMP1 and TNF-αin hemorrhagic fever of renal syndrome*

Dong-sha Shi1，Yan-ying Dong1，Li-hua Zhao2，Ming Xie1
（1.Department of Immunology and Pathogenic Biology，School ofMedicine，Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi 710061，China；2.Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an，Shaanxi710061，China）

Objective To exp lore the mechanism of hyper-permeability in hemorrhagic fever of renal syndrome（HFRS）.M ethods Immunocytochemistry was used to detect the production of dentin matrix protein 1（DMP1）.The penetrability changes of human umbilical vein endothelial cells were detected by transwell monolayer system. Uninfected vein endothelial cells were used as the negative control in each experiment.Immunofluorescence was used to guarantee that cells were infected by HTNV before each experiment.Results HTNV infection alone did not change the penetrability of vein endothelial cells.but the penetrability elevated remarkably after TNF-αor DMP1 were added，and increased evenmore when both two were added.Conclusions TNF-αand DMP1 can increase the penetrability of HTNV infected endothelial cells，and there were combined effects.They may play a role in the immunopathogenesis of HFRS.

hemorrhagic fever of renal syndrome；transwellmonolayer system；penetrability

R 373.32

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.007

1005-8982（2016）12-0030-05

2015-12-02

陜西省科技計(jì)劃項(xiàng)目基金資助課題（No：2012SF2-12）