杜森，葉琳，朱琳，李陽陽，夏春波

（桂林醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，廣西 桂林 541004）

·論著·

大鼠認(rèn)知障礙對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌糖原合成酶激酶-3β表達(dá)水平的關(guān)系*

杜森，葉琳，朱琳，李陽陽，夏春波

（桂林醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，廣西 桂林 541004）

目的探討大鼠認(rèn)知障礙對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達(dá)的關(guān)系，為糖代謝的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法Aβ1-42大鼠海馬內(nèi)注射構(gòu)建認(rèn)知障礙模型，血糖儀檢測大鼠空腹血糖（FPG），半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達(dá)，蛋白印跡法（W estern blot）檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達(dá)。結(jié)果①實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG為（7.99±0.15）mmol/L，與假手術(shù)組和對照組比較顯著升高（P＜0.05）。②實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β mRNA表達(dá)水平分別為（0.47±0.03）和（0.26±0.02），與假手術(shù)組和對照組比較均明顯升高（P＜0.05）。③實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平分別為（0.47±0.04）和（0.26±0.03），均顯著高于假手術(shù)組與對照組（P＜0.05）。結(jié)論大鼠認(rèn)知障礙可引起血糖水平的升高，其機(jī)制可能與認(rèn)知障礙大鼠肝臟和骨骼肌GSK-3β表達(dá)升高有關(guān)。

認(rèn)知功能障礙；糖代謝；糖原合成酶激酶-3β

老年癡呆是一種常見的慢性神經(jīng)退行性病變，又名“阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）”。其發(fā)生發(fā)展與海馬功能的受損密切相關(guān)，老年癡呆包括輕度認(rèn)知障礙前期（pre-MCI）、輕度認(rèn)知障礙期（mild cognitive impairment，MCI）和癡呆期3個(gè)時(shí)期，且其發(fā)展成不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。AD與糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）關(guān)系密切，有些學(xué)者稱之為“3型糖尿病”［1-2］。有研究顯示［3］，81%的AD患者伴隨有糖代謝異常。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）在糖代謝的過程中扮有重要的角色，為進(jìn)一步探討AD對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)擬建立大鼠認(rèn)知障礙模型，探討其對糖代謝的影響及其與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達(dá)的關(guān)系，為糖代謝的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號：SCXK桂2007-000）提供健康SD大鼠30只，雌雄不分，體重約200～250 g。水合氯醛由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)學(xué)院提供，微量注射器購自西化儀（北京）科技有限公司，Aβ1-42購自美國Sigma公司，血糖試紙購自強(qiáng)生（上海）醫(yī)療器材有限公司，Trizon總RNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，Rever tAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒購自美國Ther mo公司。由美國Invitrogen公司在GSK-3β、β-actin基因序列上設(shè)計(jì)并合成引物，GSK-3β正向引物：5'-CACCTGCCCTCTTCAACTTTAC-3'，GSK-3β 反向引物：5'-GGTCTGTCCACGGTCTCCA-3'，產(chǎn)物為158 bp；β-actin正向引物：5'-GAGGGAAATCGTGC GTGAC-3'，β-actin反向引物：5'-CTGGAAGGTGGA CAGTGAG-3'，產(chǎn)物為445 bp。辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，β-actin pAb、GSK-3β pAb購自美國 Bioworld Technology公司。

1.2大鼠認(rèn)知障礙模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、假手術(shù)組和對照組，每組10只大鼠。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬內(nèi)注射 Aβ1-42 15μg，假手術(shù)組海馬內(nèi)注射等體積的PBS緩沖液，對照組不作任何處理。具體操作步驟為：采用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉（3ml/kg），頭部備皮，依照大鼠腦立體定位圖譜將大鼠固定于腦立體定位儀上，沿其頭頂正中切開長約8mm的縱形切口，充分暴露前囟，小型電鉆鉆開左側(cè)海馬上方顱骨（前囟后3.8mm，左旁開2.2mm），不同組別采用微量注射器緩慢垂直進(jìn)針2.9mm注入相應(yīng)的試劑，縫合皮膚，并在縫合口處涂抹青霉素，以防感染，繼續(xù)飼養(yǎng)（每周換3次墊料）。運(yùn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠認(rèn)知功能。認(rèn)知功能障礙評定標(biāo)準(zhǔn)：大鼠定位航行時(shí)間、跨越平臺次數(shù)及在原平臺象限時(shí)間百分比這3項(xiàng)指標(biāo)中的任意2項(xiàng)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則判定為認(rèn)知功能障礙。

1.3大鼠空腹血糖水平的檢測

造模后大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)45 d，利用血糖儀檢測大鼠空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），具體操作方法：大鼠空腹12 h，75%酒精清潔大鼠尾尖，消毒手術(shù)剪，剪去少許尾尖，使血液自然流出，按照血糖儀說明書檢測大鼠FPG水平。

1.4大鼠肝臟與骨骼肌組織樣本采集

采用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉（3ml/ kg），腹部及大腿備皮，打開腹腔和大腿處皮膚，剪取部分大鼠肝臟以及骨骼肌分別裝入凍存管，然后快速放入液氮灌中，12 h后將凍存管從液氮灌轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍保存。

1.5RT-PCR法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達(dá)水平

從-80℃冰箱取出肝臟（骨骼?。┙M織并在液氮中研磨充分，利用Trizon總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的純度和濃度，A260/A280比值在1.8～2.0為最佳，置入-80℃冰箱內(nèi)短時(shí)間冷凍保存?zhèn)溆?，用RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA最終得到穩(wěn)定的cDNA，然后分別運(yùn)用GSK-3β引物和β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃2min，變性94℃ 30 s、退火65℃ 30 s、延伸72℃ 30 s共32個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 2min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，計(jì)算光密度值并加以分析。

1.6蛋白印跡法（Western blot）法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達(dá)水平

從-80℃冰箱取出肝臟（骨骼?。┙M織并在液氮中研磨充分，加入到盛有適量RIPA組織細(xì)胞裂解液的EP管中，充分震蕩，靜置15min，快速離心并吸取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測所提取蛋白質(zhì)濃度，制備上樣蛋白樣本，按照步驟：蛋白樣本SDS-PAGE電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→TBST洗膜→孵育GSK-3β（β-actin）一抗→TBST洗膜→孵育二抗→TBST洗膜→發(fā)光，逐步操作。測定蛋白條帶光密度值，并分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異性比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較用LSD-t或Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1模型建立結(jié)果

大鼠飼養(yǎng)45 d后，實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡1只，存活9只，且表現(xiàn)為體型變瘦，皮毛粗糙，運(yùn)動(dòng)遲緩；假手術(shù)組大鼠死亡1只，存活9只；對照組大鼠無死亡，存活10只。實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠體征無差異。

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對各組大鼠認(rèn)知功能的檢測結(jié)果

對各組大鼠運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測認(rèn)知功能結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠定位航行時(shí)間為（85.19±2.41）s，明顯高于假手術(shù)組與對照組的（43.80±10.32）s和（47.20±11.24）s（P＜0.01）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠跨越平臺的次數(shù)、在原平臺象限時(shí)間百分比分別為（1.78±0.93）次、（18.43±5.75）%，與假手術(shù)組和對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而假手術(shù)組與對照組的所有指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.434，P2=0.304，P3=0.061）（見附表）。結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建認(rèn)知障礙大鼠模型取得良好的效果。

2.3各組大鼠空腹血糖檢測結(jié)果

利用血糖儀檢測大鼠FPG水平結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG為（7.99±0.15）mmol/L，假手術(shù)組和對照組分別為（5.36±0.30）和（5.42±0.24）mmol/L，與假手術(shù)組和對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG水平顯著增高（P＜0.01），而假手術(shù)組和對照組FPG水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.895）。

附表　大鼠認(rèn)知功能檢測結(jié)果 （）

附表　大鼠認(rèn)知功能檢測結(jié)果 （）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與假手術(shù)組比較，P＜0.01

組別跨越平臺次數(shù)/次對照組（n=10）　47.20±11.24　36.67±3.21　5.67±0.54假手術(shù)組（n=9）　43.80±10.32　34.34±4.32　4.94±0.62實(shí)驗(yàn)組（n=9）　85.19±2.411）2）　18.43±5.751）2）　1.78±0.931）2）定位航行時(shí)間/s原平臺象限時(shí)間/%

2.4半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定肝臟與骨骼肌GSK-3βmRNA的表達(dá)水平結(jié)果

運(yùn)用RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA表達(dá)水平分別為（0.47± 0.03）和（0.26±0.02），與對照組及假手術(shù)組比較均顯著升高（P＜0.001），假手術(shù)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.066，P2=0.258），其中β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長度為445 bp，GSK-3β擴(kuò)增產(chǎn)物長度為158 bp。見圖1～3。

2.5Western blot法測定肝臟與骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平結(jié)果

圖1　肝臟GSK-3β mRNA的表達(dá)

圖2　骨骼肌GSK-3β mRNA的表達(dá)

圖3　肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA的表達(dá)情況

運(yùn)用 Western blot法檢測肝臟與骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平分別為（0.47±0.04）和（0.26± 0.03），與假手術(shù)組和對照組比較均明顯升高（P＜0.001），而假手術(shù)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P1=0.466，P2=0.542），其中β-actin分子量為43 kD、GSK-3β分子量為46 kD。見圖4～6。

圖4　肝臟GSK-3β的表達(dá)水平

圖5　骨骼肌GSK-3β的表達(dá)水平

圖6　肝臟與骨骼肌GSK-3β的表達(dá)情況

3　討論

隨著人口老齡化進(jìn)展加快，AD嚴(yán)重威脅人類的健康，據(jù)統(tǒng)計(jì)截止到2010年，我國AD患者已達(dá)到569萬［4］。近年來越來越多研究表明［5］，AD與糖尿病具有復(fù)雜的相互關(guān)系。目前，糖尿病可促進(jìn)AD的發(fā)生、發(fā)展已漸漸被人們所認(rèn)可，但AD是否可以引起外周血糖水平的異常尚不清楚。SCHULINGKAMP等［6］研究發(fā)現(xiàn)，大腦的一些結(jié)構(gòu)如海馬、額葉皮質(zhì)等也可合成并分泌胰島素，大腦內(nèi)的胰島素可以調(diào)節(jié)血糖的水平、食物的攝入、體重等。RIVERA等［7］認(rèn)為，AD患者大腦額葉組織中胰島素水平降低。李欽云等［8］通過126例AD患者研究發(fā)現(xiàn)，AD患者存在血糖水平升高以及胰島素抵抗。有國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)［9］，PD患者認(rèn)知功能障礙和病情程度可能與血糖水平?jīng)]有明顯的關(guān)系，可能與多因素影響血糖水平有關(guān)，具體機(jī)制有待研究。本研究通過大鼠海馬注射Aβ1-42構(gòu)建認(rèn)知障礙模型，采用血糖儀檢測大鼠FPG水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠FPG水平與假手術(shù)組和對照組比較顯著升高（P＜0.05），提示大鼠認(rèn)知功能障礙可能會(huì)引起血糖水平升高。

大腦海馬不僅是參與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，而且其與周圍一些腦組織具有廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系，例如海馬與下丘腦室旁核（PVN）之間具有直接的神經(jīng)聯(lián)系，下丘腦－垂體－腎上腺皮質(zhì)軸（HPA軸）的激活點(diǎn)位于PVN，HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌途徑的主要傳出通路。有報(bào)道，損傷海馬的結(jié)構(gòu)如腹側(cè)下腳可增加糖皮質(zhì)激素的釋放［10］。由此可知，海馬可參與神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。XU等［11］研究發(fā)現(xiàn)，海馬可以通過神經(jīng)通路參與胃動(dòng)力的調(diào)節(jié)。劉梅等［12］通過對SD大鼠海馬內(nèi)微量注射胃動(dòng)素發(fā)現(xiàn)大鼠十二指腸消化間期移行性復(fù)合肌電活動(dòng)發(fā)生了顯著性的變化，但是當(dāng)切斷膈下迷走神經(jīng)后海馬對十二指腸消化間期移行性復(fù)合肌電活動(dòng)的影響幾乎消失，因此，海馬可能會(huì)通過海馬－下丘腦－腦干－迷走神經(jīng)通路調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)。

GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，不僅是糖代謝的關(guān)鍵酶，并且參與胰島素信號通路的調(diào)節(jié)，GSK-3β可以通過抑制GS的生物活性，從而降低肝（?。┨窃暮铣?，導(dǎo)致血糖水平升高。本研究通過運(yùn)用RT-PCR法與Western blot法檢測大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β mRNA與GSK-3β的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟與骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平與假手術(shù)組和對照組比較，均顯著升高（P＜0.05），提示認(rèn)知障礙大鼠血糖水平的升高可能與肝臟和骨骼肌GSK-3β表達(dá)水平升高有關(guān)。也有研究表明［13］，AD患者大腦內(nèi)GSK-3β水平及活性顯著升高。海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分可能通過自主神經(jīng)參與機(jī)體調(diào)節(jié)［12］。推測認(rèn)知障礙大鼠可能由于海馬神經(jīng)元受損導(dǎo)致其肝臟與骨骼肌GSK-3β表達(dá)升高，進(jìn)而引起血糖水平的上升。認(rèn)知障礙大鼠出現(xiàn)血糖升高的機(jī)制復(fù)雜，GSK-3β作為調(diào)控糖代謝的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平的升高可為海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分參與糖代謝調(diào)節(jié)提供新的依據(jù)。

［1］LESTER-COLL N，RIVERA E J，SOSCIA SJ，et al.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes:relevance to sporadic Alzheimer's disease［J］.J Alzheimers Dis，2006，9（1）:13-33.

［2］BEKKERING P L，JAFRI I，VAN OVERVELD F J，et al.The intricate association between gut microbiota and development of type 1，type 2 and type 3 diabetes［J］，2013，9（11）:1031-1041.

［3］BIESSELS G J，STAEKENBORG S，BRUNNER E，et al.Risk of dementia in diabetes mellitus:a systematic review［J］.Lancet Neurol，2006，5（1）:64-74.

［4］CHAN K Y，WANG W，WU JJ，et al.Epidemiology of Alzheimer's disease and other forms of dementia in China，1990-2010:a systematic review and analysis［J］.Lancet，2013，381（9882）:2016-2023.

［5］LI X H，SONG D L，LENG SX.Link between type 2 diabetes and Alzheimer's disease:from epidemiology to mechanism and treatment［J］.Clin Interv Aging，2015，10:549-560.

［6］SCHULINGKAMP R J，PAGANO TC，HUNG D，et al.Insulin receptors and insulin action in the brain review and clinical in plieations［J］.Neu Rosei Biobehan Rec，2000，24（8）:855-872.

［7］RIVERA E J，GOLDIN A，F(xiàn)ULMER N，et al.Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer's disease:link to brain reductions in acetylcholine［J］.J Alzheimers Dis，2005，8（3）:247-268.

［8］李欽云，陳崢，張守字，等.126例阿爾茨海默病患者血脂代謝和胰島素抵抗的研究［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2015，13（1）:15-17.

［9］黃靜，張玉虎，聶坤，等.帕金森病認(rèn)知功能障礙及病情程度與血糖水平的關(guān)系［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2014，27（2）:81-83.

［10］HERMAN J P，OSTRANDER M M，MUELLER N K，et al. Limbic system mechanisms of stress regulation，hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2005，29（8）:1201-1213.

［11］XU L L，GONG Y，WANG H，et al.The stimulating effect of ghrelin on gastric motility and firing activity of gastric-distension-sensitive hippocampal neurons and its underlying regulation by the hypothalamus［J］.Exp Physiol，2014，99（1）:123-135.

［12］劉梅，董蕾，朱文藝，等.大鼠海馬區(qū)微量注射胃動(dòng)素對十二指腸移動(dòng)性復(fù)合肌電活動(dòng)的影響［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25:955-958.

［13］蘇亞楠，陳立強(qiáng)，張曉波，等.山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠GSK-3β和磷酸化GSK-3β的影響 ［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（9）:2092-2094.

（張蕾編輯）

Eeffects of cognitive im pairm ent in rats on glucose metabolism and its relationsw ith expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle*

Sen Du，Lin Ye，Lin Zhu，Yang-yang Li，Chun-bo Xia
（Department of Anatomy，Guilin Medical University，Guilin，Guangxi，541004，China）

Ob jective To investigate the effects of cognitive impairment in rats on glucose metabolism and its relation with the expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle，and to provide a new experimental evidence for study of the neural mechanisms regulating glucose metabolism.M ethods The Aβ1-42 was injected into the hippocampus to build cognitive impairmentmodel of rats，and fasting blood glucose of ratswas tested by blood glucosemeter.Expression of GSK-3βmRNA and GSK-3βin liver and skeletalmuscle were detected by RT-PCR and Western blot，respectively.Results In the experimental group，fasting blood glucose（FPG）was（7.99±0.15）mmol/L，which was significantly higher than that in the sham group and the control group（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βmRNA in liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.03）and（0.26±0.02），which were significantly higher than other two groups（P＜0.05）.The expressions of GSK-3βin liver and skeletalmuscle of the experimental group were（0.47±0.04）and（0.26±0.03），which also higher than other groups significantly（P＜0.05）.Conclusions Cognitive impairment in rats causes the elevation of glucose levels，which mechanism may related to the increase of expression of GSK-3βin liver and skeletalmuscle.

cognitive；impairment；glucosemetabolism；glycogen synthase kinase-3β

R 338.26

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.001

1005-8982（2016）12-0001-05

2015-12-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No：81260137）

夏春波，E-mail：xiachunbo910@163.com；Tel:13977378285