盧宏全　黃國定　林　影　潘敏麗

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XRCC1基因多態(tài)性對結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4方案化療療效的影響

盧宏全黃國定林影潘敏麗

目的探討X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多態(tài)性對結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4方案化療療效的影響。方法113例結(jié)腸癌患者均接受根治術(shù)治療。術(shù)后采用焦磷酸測序法檢測腫瘤組織中的XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性，并給予FOLFOX4方案化療6個(gè)周期。治療結(jié)束后對患者進(jìn)行隨訪。結(jié)果⑴113例結(jié)腸癌患者的XRCC1 Arg399Gln位點(diǎn)包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3種等位基因型，其頻率分別為66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。⑵Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組之間性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態(tài)、TNM分期、T分期、癌胚抗原(CEA)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。⑶隨訪期內(nèi)，Gln/Gln基因型組復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性可以影響結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4輔助化療的遠(yuǎn)期療效。

X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1；基因多態(tài)性；結(jié)腸癌

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1239～1241)

以手術(shù)為主的綜合治療是目前臨床治療結(jié)腸癌的主要原則，F(xiàn)OLFOX4方案則是高危Ⅱ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案，盡管如此，該方案的療效常受到多方面因素的影響[1]。X射線交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多態(tài)性是目前腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，諸多報(bào)道均認(rèn)為它可以影響奧沙利鉑的抗腫瘤效果[2-4]。本研究即旨在探討其對結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4方案化療療效的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1研究對象

選取2009年7月-2012年5月海南省儋州市第一人民醫(yī)院收治的113例患者，其中男性65例、女性48例，年齡>50歲28例、≤50歲85例；病理類型：腺癌101例、黏液癌9例、未分化癌3例；癌腫部位：近端結(jié)腸47例、遠(yuǎn)端結(jié)腸66例；腫瘤形態(tài)：腫塊型50例、浸潤型35例、潰瘍型28例；TNM分期：Ⅱ期31例、Ⅲ期82例；T分期：T1～T220例、T3～T493例；癌胚抗原(CEA)正常17例、升高96例。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴結(jié)腸癌根治術(shù)后取組織送檢，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診；⑵術(shù)后接受FOLFOX4方案化療，化療周期數(shù)為6個(gè)；⑶符合結(jié)腸癌根治術(shù)的治療指征，臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期；⑷簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴未接受XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性檢測；⑵臨床資料收集不全；⑶隨訪丟失。

1.3XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性檢測方法

1.3.1組織DNA提取包括去除石蠟、組織溶解、DNA柱分離等3個(gè)步驟。去除石蠟方法如下：⑴取1 ml 二甲苯置于EP管中，用二甲苯?jīng)_淋載玻片上的石蠟切片(片厚4 μm)，濕潤后用刀片刮取石蠟組織，二甲苯反復(fù)沖淋，將全部二甲苯液轉(zhuǎn)移至EP管中，共刮取2～4塊石蠟切片。⑵強(qiáng)力震蕩20 s，室溫下18 000 rpm離心3 min，棄上清。⑶加入1 ml無水乙醇，震蕩混勻，室溫下18 000 rpm離心3 min，棄上清。⑷乙醇提取重復(fù)1次。組織溶解方法如下：⑴加入180 μl 消化緩沖液、20 μl 蛋白酶K，震蕩混勻。⑵50 ℃水浴孵育3 h，室溫下18 000 rpm離心3 min，將上清移于另一支EP管。⑶加入20 μl 核糖核酸酶A，震蕩混勻，室溫孵育2 min。⑷加入200 μl 裂解/結(jié)合緩沖液，震蕩混勻。⑸加入200 μl 無水乙醇，震蕩混勻。DNA柱分離方法如下：⑴吸取組織溶解液，置于小柱中，室溫下18 000 rpm離心1 min。⑵更換收集管，向柱子中加入500 μl 緩沖液1，室溫下18 000 rpm離心1 min。⑶更換收集管，向柱子中加入500 μl 緩沖液2，室溫下18 000 rpm離心3 min。⑷將柱子置于EP管中，加入50 μl 洗脫緩沖液，室溫孵育1～5 min，室溫下18 000 rpm離心1 min。此時(shí)EP管中為gDNA，標(biāo)記后-20 ℃保存。

1.3.2目的基因PCR片段擴(kuò)增擴(kuò)增引物包括XRCC1 25487-pyro BioF：CATCGTGCGTAAGGAGTGG；XRCC1 25487-pyro R：ATTGCCCAGCACAGGATAAG。PCR反應(yīng)體系包括：dNTP 1.5 μl，10×PCR 緩沖液 5.0 μl，XRCC1 25487-pyro BioF 0.5 μl，XRCC1 25487-pyro R 0.5 μl，rTaq 0.5 μl，ddH2O 40.0 μl，gDNA 2.0 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃終延伸5 min。

1.3.3測序樣本純化以及目的基因SNP檢測步驟如下：⑴在PSQ 96孔板中加入40 μl 退火緩沖液、3 μl 測序引物。⑵在925 μl 結(jié)合緩沖液中加入75 μl磁珠，震蕩混勻。⑶在96孔板中先后加入40 μl磁珠混合液以及等體積的PCR產(chǎn)物，封蓋，1 900 rpm 震蕩10 min。⑷在真空工作站中，4個(gè)樣品板分別加入180 ml高純水、120 ml 70%乙醇、變性緩沖液、沖洗緩沖液。⑸打開泵，在高純水中清洗柱頭30 s，將柱頭移至PCR板中抓取磁珠。⑹將柱頭置入70%乙醇中5 s，移至變性緩沖液中5 s，再移至沖洗緩沖液中5 s。⑺將柱頭置于Pyro反應(yīng)板上方，將泵關(guān)掉。⑻將柱頭置于含有測序引物的板中，振動(dòng)釋放磁珠，高純水清洗柱頭。⑼將放有樣品的PSQ 96孔板置于透明恒溫臺，加熱至80 ℃，2 min后冷卻至室溫，此時(shí)即可進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。⑽將PSQ 反應(yīng)板、試劑倉置于測序儀中，點(diǎn)擊RUN鍵。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料百分率比較采用R×C表χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Log rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1基因型分布

113例結(jié)腸癌患者的XRCC1 Arg399Gln位點(diǎn)包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3種等位基因型，其構(gòu)成比分別為66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。

2.2Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組臨床資料指標(biāo)的比較

Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組之間性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態(tài)、TNM分期、T分期、CEA相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.3Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組遠(yuǎn)期療效的比較

隨訪期內(nèi)，Gln/Gln基因型組復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3　討論

結(jié)腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤之一。近20年來，其發(fā)病率在國內(nèi)有明顯提高，尤其是在大城市，結(jié)腸癌有多于直腸癌的趨勢[5]。在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，遺傳突變包括癌基因激活、抑癌基因失活、基因過度表達(dá)、錯(cuò)配修復(fù)基因突變等發(fā)揮了舉足輕重的作用。隨著研究的深入，遺傳突變與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系逐步得到重視。

表1　Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組臨床資料指標(biāo)的比較/例

表2　Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組遠(yuǎn)期預(yù)后的比較(例，%)

XRCC1是一個(gè)參與電離輻射所致DNA損傷修復(fù)的基因，該基因定位于19號染色體q13.2-q13.3，包含17個(gè)外顯子，編碼1個(gè)分子量為70 kD的蛋白質(zhì)[6]。目前國內(nèi)有關(guān)XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性影響奧沙利鉑療效的研究主要集中在消化系統(tǒng)腫瘤。劉同欣等[3]報(bào)道，XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性可以影響以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案治療晚期胃癌患者的化療有效率、無疾病進(jìn)展生存期(mPFS)、總生存期(MST)。吳云云等[4]報(bào)道，XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性分布與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤部位、組織病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但它可以影響結(jié)直腸癌患者接受含奧沙利鉑輔助化療方案治療的PFS，進(jìn)一步多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性Gln/Arg、Arg/Arg是結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。羅鵬飛等[7]報(bào)道，XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性可以影響大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者奧沙利鉑化療后的近期療效、無進(jìn)展生存期(PFS)。盡管如此，目前XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性影響奧沙利鉑療效的機(jī)制尚未完全明確，其可能機(jī)制包括如下兩點(diǎn)[8-9]：一方面，Gln→Arg突變可以改變XRCC1蛋白的氨基酸序列，XRCC1蛋白的DNA損傷修復(fù)功能受到影響；另一方面，Gln→Arg突變可能可以促使XRCC1基因高表達(dá)，從而降低DNA損傷劑的殺細(xì)胞效應(yīng)。

在本研究中，XRCC1 Arg399Gln基因型分布研究顯示結(jié)腸癌患者Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg構(gòu)成比分別為66.4%、27.4%、6.2%，與楊農(nóng)等[10]報(bào)道相近，這說明XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性分布的地域差異可能較小。由于Arg/Arg的構(gòu)成比較低，如果單獨(dú)列組在統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)易得出假陰性結(jié)論，因此將其與Gln/Arg合并為非Gln/Gln基因型組。進(jìn)一步臨床資料指標(biāo)比較顯示，Gln/Gln基因型組與非Gln/Gln基因型組的性別、年齡、病理類型、癌腫部位、腫瘤形態(tài)、TNM分期、T分期、CEA比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說明結(jié)腸癌患者的主要臨床資料指標(biāo)與XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性的相關(guān)性較弱甚至無相關(guān)性。但值得注意的是，在遠(yuǎn)期療效指標(biāo)比較方面，Gln/Gln基因型組的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率顯著低于非Gln/Gln基因型組，3年生存率顯著高于非Gln/Gln基因型組(P<0.05)。由此可見，XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性可以影響結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4輔助化療的遠(yuǎn)期療效，XRCC1 Arg399Gln基因多態(tài)性分析可以用于預(yù)測該方案治療結(jié)腸癌患者的預(yù)后。

[1]仇宇，周春花，楊農(nóng)，等.MTHFR基因多態(tài)性與結(jié)腸癌患者術(shù)后FOLFOX4輔助化療療效的關(guān)系〔J〕.腫瘤防治研究，2013，40(6)：595-598.

[2]姜健，梁軍，李青芳，等.晚期胃癌病人血清XRCC1基因多態(tài)性與奧沙利鉑化療效果的相關(guān)性〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，46(1)：19-21，25.

[3]劉同欣.晚期胃癌患者外周血XPD、XPA、XRCC1、GSTP1基因多態(tài)性對以奧沙利鉑為基礎(chǔ)的化療方案臨床療效及生存的預(yù)測作用〔D〕.南昌大學(xué)，2011.

[4]吳云云.結(jié)直腸癌患者GSTP1、XRCC1基因多態(tài)性與奧沙利鉑術(shù)后輔助化療效果的相關(guān)性研究〔D〕. 蘇州大學(xué)，2014.

[5]陳建新，喬建國.Ⅱ～Ⅲ期老年結(jié)腸癌患者行根治手術(shù)輔助化療的預(yù)后分析〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2015，30(6)：853-855.

[6]廖瑜倩，萬以葉，彭麗香，等.XRCC1194Arg/Trp基因多態(tài)與晚期乳腺癌患者鉑類方案近期療效的相關(guān)研究〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2012，27(6)：568-571.

[7]羅鵬飛.大腸癌肝轉(zhuǎn)移患者XRCC1基因多態(tài)性與奧沙利鉑療效相關(guān)性研究〔D〕.中南大學(xué)，2011.

[8]劉龍靜，李桂生，陳海輝.XRCC1單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌鉑類化療敏感度的相關(guān)性〔J〕.腫瘤防治研究，2015，42(7)：681-686.

[9]付婷，秦立強(qiáng)，潘旭東，等.XRCC1基因多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌鉑類化療敏感性關(guān)系的Meta分析〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2015，41(12)：1401-1403.

[10]楊農(nóng)，仇宇，王靜，等.XRCC1基因多態(tài)性與結(jié)腸癌術(shù)后FOLFOX4化療療效相關(guān)性分析〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2013，20(22)：1736-1739.

(編輯：甘艷)

Influence of XRCC1 Gene Polymorphism on Efficacy of Postoperative Chemotherapy with FOLFOX4 for Colon Cancer

LU Hongquan，HUANG Guoding，LIN Ying，et al.

The First People’s Hospital of Danzhou，Danzhou，571700

ObjectiveTo explore the influence of X-ray cross complementing repair gene 1(XRCC1) Arg399Gln gene polymorphism on efficacy of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for colon cancer.Methods113 cases of colon cancer were given radical operation.The XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism in tumor tissues was detected by pyrophosphoric acid sequencing method after surgery，and all patients received 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4.Patients were followed up after treatment.Results⑴There were 3 kinds of allelotype of XRCC1 Arg399Gln in 113 cases of colon cancer，including Gln/Gln，Gln/Arg and Arg/Arg，and their composition ratios were 66.4%(75/113)，27.4%(31/113) and 6.2%(7/113)，respectively.⑵There had no statistical differences in gender，age，pathological type，tumor location，tumor morphology，TNM stage，T stage and cancer embryo antigen(CEA) between Gln/Gln genotype group and non-Gln/Gln genotype group(P>0.05).⑶During the follow-up，the incidence of recurrence or metastasis in Gln/Gln genotype group were statistically lower than those of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05)，while the 3-year survival rate was significantly higher than that of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05).ConclusionThe XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism may affect the long-term outcome of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for patients with colon cancer.

X-ray cross complementing repair gene1(XRCC1)；Gene polymorphism；Colon cancer

571700 海南省儋州市第一人民醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.007

R735.3+5

A

1001-5930(2016)08-1239-03

2015-12-18

2016-03-20)