蘭艷麗　劉　韻

?

兩種用藥方式對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

蘭艷麗劉韻

目的比較去甲斑蝥素(noreantharidin,NCTD)單獨(dú)用藥和聯(lián)合ABT-737 2種用藥方式對宮頸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，檢測NCTD單藥或聯(lián)合ABT-737 2種用藥方式對宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa 增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析NCTD聯(lián)合ABT-737對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果NCTD單獨(dú)用藥能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞株HeLa和SiHa的增殖(P<0.05)，且抑制作用呈劑量依賴性，而且NCTD與ABT-737聯(lián)用后對宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)。NCTD和ABT-737聯(lián)合用藥的促凋亡作用比單獨(dú)用藥效果顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論體外單獨(dú)使用NCTD對宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa的增殖具有明顯抑制作用，聯(lián)合使用ABT-737后對其增殖抑制以及促凋亡作用更明顯。

宮頸腫瘤； 癌； 斑蝥素； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1230～1233)

宮頸癌常見的女性惡性腫瘤，發(fā)病率僅僅低于乳腺癌，是對女性造成危害的第二大疾病。細(xì)胞周期失調(diào)是細(xì)胞過度增殖而致使癌變產(chǎn)生的重要原因[1]?；熓侵委煂m頸癌的有效方法。目前多數(shù)宮頸癌化療藥物以降低患者的免疫系統(tǒng)抵抗力為代價(jià)發(fā)揮其抗癌作用，對患者的預(yù)后產(chǎn)生極大影響。積極尋找更為有效的且安全的化療藥物是我們的焦點(diǎn)。

去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是1種我國率先對我國傳統(tǒng)中藥斑螫改良合成的新型抗腫瘤藥物，對腫瘤的惡性生長如侵襲、轉(zhuǎn)移具有抑制作用，同時(shí)還具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)其凋亡的作用，對多種腫瘤具有治療作用，如乳腺癌、肺癌等[2]。此外，NCTD獨(dú)特的抗癌優(yōu)勢為能升高機(jī)體白細(xì)胞水平，從而成為抗癌研究的熱點(diǎn)。NCTD因其較強(qiáng)的毒副作用、多次重復(fù)給藥等缺點(diǎn)僅僅作為臨床上抗癌治療的輔助藥物[3-4]。BCL-2抑制劑ABT-737有較少毒副作用和良好抗癌活性[5-6]，本研究就ABT-737的優(yōu)勢聯(lián)合NCTD做更深入探討，以期尋找對宮頸癌治療的高效且安全的方案。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用品

宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa(上海復(fù)旦大學(xué))。NCTD(鄭州大學(xué))，ABT-737(上海前塵生物科技有限公司)；Annexin V/PI凋亡試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HeLa和SiHa細(xì)胞接種在10 cm培養(yǎng)皿中，盡可能使細(xì)胞分布均勻，培養(yǎng)基采用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，在5%CO2、37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)。對所培養(yǎng)的細(xì)胞每日用倒置顯微鏡觀察生長狀態(tài)，并做記錄，24 h后細(xì)胞貼壁對其培養(yǎng)基進(jìn)行更換，并且按照各種細(xì)胞的增長速度選擇1～2天更換一次培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞增殖的檢測采用MTT法通過檢測細(xì)胞能量代謝來反映宮頸癌細(xì)胞增殖活力。96孔板中接種HeLa和SiHa細(xì)胞，密度1×105/孔。調(diào)零組[即空白組，添加同體積DMEM，藥物和細(xì)胞缺如，去除96孔板和培養(yǎng)基對OD值的影響]、對照組(藥物缺如)和加藥組(設(shè)置NCTD的濃度梯度為7.5，15，30，60，120，240，480 μmol/L)，每個組設(shè)3個復(fù)孔。在細(xì)胞貼壁后加藥進(jìn)行作用48 h，隨后加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后終止培養(yǎng)，小心的棄去培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，添加DMSO 150 μl/孔，置入溫箱中10 min后，使得結(jié)晶物充分融解，調(diào)節(jié)酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處，測定各孔光吸收值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。分析各組細(xì)胞存活率。存活率=(加藥組平均OD值-調(diào)零組平均OD值) /(對照組平均OD值-調(diào)零組平均OD值)×100%。

1.2.3宮頸癌細(xì)胞增殖的檢測96孔板中接種HeLa和SiHa細(xì)胞，密度1×105/孔。分組為調(diào)零組和對照組以及ABT-737與NCTD聯(lián)合組。聯(lián)合組中NCTD的濃度梯度方別為0、30、60、120、240 μmol/L，ABT的濃度梯度為0.25、0.5、1、2 μmol /L，前一藥物中各濃度與后一藥物中各濃度兩兩混合。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[5]。

1.2.4宮頸癌細(xì)胞凋亡的檢測把HeLa和SiHa 細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，分為藥物聯(lián)合組、對照組、NCTD組和ABT-737組。于細(xì)胞對數(shù)期加入藥物(ABT-737=1 μmol/L，NCTD=60 μmol /L)，藥物作用48 h后，各培養(yǎng)皿中加入胰酶37 ℃下消化3～5 min，然后將混合液移至15 mL離心管1 000 rpm離心5 min，棄上清液。對細(xì)胞進(jìn)行沖洗，懸于PBS緩沖液中。凋亡檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞凋亡應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用方差分析和單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1NCTD對細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT檢測，NCTD的濃度為60 μmol/L時(shí)(HeLa細(xì)胞)和NCTD的濃度為30 μmol/L時(shí)(SiHa細(xì)胞)對細(xì)胞增殖有抑制作用(P<0.05)，且NCTD的濃度為120 μmol/L時(shí)(HeLa細(xì)胞)抑制作用明顯(P<0.001)，且隨藥物濃度的增加，NCTD對細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)(P<0.001)。所以NCTD對HeLa 和SiHa 細(xì)胞的增殖抑制作用與藥物劑量呈正相關(guān)性，見表1。

表1　MTT法檢測NCTD對細(xì)胞增殖的影響

注：與對照組比較，*為P<0.05；**為P<0.001。

2.2NCTD聯(lián)合ABT-737對細(xì)胞增殖的抑制作用

經(jīng)過MTT檢測，在HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中，NCTD和ABT-737單獨(dú)應(yīng)用產(chǎn)生的抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)(P=0.000)，但是此相關(guān)性在HeLa細(xì)胞中不存在協(xié)同作用(P=0.093)；而在SiHa細(xì)胞中NCTD與ABT-737之間存在協(xié)同作用(P=0.000)，見表2、表3。

表2　MTT法檢測兩種藥物聯(lián)合作用對HeLa細(xì)胞存活率的影響±s，%)

表3　MTT法檢測兩種藥物聯(lián)合作用對SiHa細(xì)胞存活率的影響±s，%)

2.3FCM檢測NCTD聯(lián)合ABT-737對宮頸癌細(xì)胞的作用

經(jīng)過FCM檢測，在兩種宮頸癌細(xì)胞(Hela、SiHa)中，ABT-737組、NCTD組與對照組對比，ABT-737組、NCTD組的細(xì)胞凋亡率升高 (P<0.05)；與ABT-737單藥組以及NCTD單藥組相比，兩藥聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；不同的是在Hela細(xì)胞中NCTD與ABT0-737并不存在協(xié)同作用(P=0.980)；在SiHa 細(xì)胞中NCTD與ABT-737存在協(xié)同作用(P=0.000)，見表4。

表4　各組HeLa、SiHa細(xì)胞凋亡情況，%)

3　討論

宮頸癌是1種較容易早發(fā)現(xiàn)、早確診的婦科常見惡性腫瘤，尤其科學(xué)的發(fā)展使得宮頸細(xì)胞學(xué)篩查得以普遍應(yīng)用，更是提高了其早期診斷率，即便如此宮頸癌的病死率仍呈逐年上升的趨勢，且趨向于年輕化。在宮頸癌治療中，化療是放療無效和治療手術(shù)失敗患者的1種重要且有效的手段，但其治療效果始終偏低，在臨床上有30%～40%的患者化療失敗[6]。目前宮頸癌的治療主要為手術(shù)加化療，但化療所致骨髓抑制以及白細(xì)胞降低等毒副作用對患者免疫系統(tǒng)造成極大傷害，降低患者的抵抗力，從而限制其治療效果，因而探尋一種安全有效化療藥物是宮頸癌化療藥物研究所關(guān)注的焦點(diǎn)，這也是本研究要探究的問題。

近年關(guān)于NCTD對癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究已經(jīng)取得了一些成果。Li等[7]研究結(jié)果顯示NCTD能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率與劑量呈正相關(guān)關(guān)系，但是與此同時(shí)線粒體膜電位則剛好與之相反，Cytochrome-C和Bax的表達(dá)量明顯升高，而Bcl-2表達(dá)量下降，肝癌細(xì)胞內(nèi)的AI及Casepase-3被活化，表明NCTD通過線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對癌細(xì)胞的發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，活性氧簇(aos)的升高以及線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是NCTD誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的原因[8]。Yeh等[9]研究表明NCTD通過TRAILDR5信號途徑實(shí)現(xiàn)對人肝癌細(xì)胞Hep3B凋亡的誘導(dǎo)，而TRAILDR5信號途徑則具有抑癌基因P53基因依賴性。An等[10]研究結(jié)果表明，NCTD呈劑量與時(shí)間依賴性抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。該研究還發(fā)現(xiàn)，線粒體、Caspase、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑可能參與NCTD對宮頸癌細(xì)胞的促凋亡作用，具體作用機(jī)制還不十分明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明宮頸癌HeLa、SiHa 細(xì)胞中，NCTD對其增殖抑制作用明顯，且存在劑量依賴性。但因NCTD 半衰期短需重復(fù)注射，且經(jīng)腎臟排泄易致泌尿系統(tǒng)毒性而限制其單獨(dú)用藥的治療效果。

Zhang等[11]研究結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞中，NCTD聯(lián)合ABT-737對增殖的抑制作用明顯，對其凋亡存在促進(jìn)作用，該作用是通過線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明NCTD對宮頸癌細(xì)胞的增殖，聯(lián)合ABT-737后用藥后抑制作用明顯增強(qiáng)。兩藥聯(lián)合使用時(shí)，通過升高ABT-737的濃度而降低NCTD的用藥劑量，可以降低藥物的不良反應(yīng)，即NCTD的抑制增殖作用可以通過ABT-737明顯增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，NCTD聯(lián)合ABT-737可以顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡(P<0.05)，且比單獨(dú)用藥作用的效果更加顯著(P<0.05)。NCTD聯(lián)合ABT-737后對凋亡的促進(jìn)作用可能是通過其增強(qiáng)線粒體細(xì)胞凋亡途徑的結(jié)果，NCTD聯(lián)合ABT-737用藥對宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究，這也為我們以后的研究思路提供了廣闊的空間和方向。

綜上所述，兩種用藥方式，NCTD聯(lián)合ABT-737用藥對宮頸癌增殖的抑制作用和凋亡促進(jìn)作用較NCTD單獨(dú)用藥更加顯著增強(qiáng)，且ABT-737可以明顯減少NCTD對于患者免疫系統(tǒng)的傷害。

[1]喻小蘭，盧科蓮，夏紀(jì)毅，等.黃芩素干預(yù)宮頸癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015,42(1)：121-124,130.

[2]潘春英，顧新剛.去甲斑蝥素抗肝癌作用機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015,23(4)：575-577.

[3]Deng L,Tang S.Norcantharidin analogues：a patent review(2006-2010)〔J〕.Expea Opin Ther Pat，2011，21(11)：1743-1753.

[4]Zhao Q,Qian Y,Li R,et al.Norcantharidin facilitates LPS-mediated immune responses by up- regulation of AKT/ NF- kβsignaling in macrophages〔J〕.PLoS One，2012，7(9)：e 44956.

[5]李澤明，余進(jìn)進(jìn)，陸冰穎.丙戊酸鈉聯(lián)合紫杉醇對宮頸癌Hela細(xì)胞抑制作用的研究〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2013,28(2)：121-124.

[6]張慧君.奈達(dá)鉑或伊立替康聯(lián)合紫杉醇作為首選方案治療中晚期宮頸癌的療效比較〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2013,28(3)：272-274.

[7]Li XQ,Shao SH,Fu GL,et al.Study on norcantharidin-induced apoptosis in SMMC-7721 cells through mitochondrial pathways〔J〕.Chin J Integr Med，2010，16(5)：448-452.

[8]Chang C,Zhu YQ,Mei JJ,et al.Involvement of mitochondrial pathway in NCTD-induced eytotoxicity in human hepG2 cells〔J〕.J Exp Clin Cancer Res，2010，29：145.

[9]Yeh CB,Hsieh MJ,Hsieh YH,et al.Antimetastatic effects of norcantharidin on hepatocellular carcinoma by transcriptional inhibition of MMP-9 through modulation of NF-Kβactivity〔J〕.PLoS One，2012，7(2)：e31055.

[10]An WW,Gong XF,Wang MW,et al.Norcantharidin induces apoptosis in HeLa cells through easpase，MAPK，and mitochondrial pathways〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2004，25(11)：1502-1508.

[11]Zhang S,Li G,Ma X,et al.Norcantharidin enhances ABT-737 induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by transcriptional repression of Mcl-1〔J〕.Cell Signal，2012，24(9):1803-1809.

(編輯：吳小紅)

Influence of Two Kinds of Treatments on the Proliferation and Apoptosis of Cervical Cancer Cells

LAN Yanli,LIU Yun.

Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science,Xiangyang,441021

ObjectiveTo study the influence of NCTD (noreantharidin) and ABT-737 on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells.MethodsMTT method was used to detect the influence of NCTD single-agent or joint ABT-737 on the proliferation of HeLa and SiHa cervical cancer cell lines;flow cytometry was used to analyze the influence of NCTD joint ABT-737 on the apoptosis of cervical cancer cells.ResultsNCTD single-agent can significantly inhibit the proliferation of HeLa and SiHa cervical cancer cell line(P<0.05),and the inhibitory effect was dose dependent.NCTD inhibition was enhanced after combination with ABT-737.Combination of NCTD and ABT-737 had more significant effect on promoting apoptosis than any single agent (P<0.05).ConclusionThe proliferation of SiHa and HeLa in cervical cancer cells is significantly inhibited by NCTD in vitro,the inhibition effect of ABT-737 and NCTD on proliferation and apoptosis is more obvious.

Cervical cancer;Cancer;Cantharidin;Cell proliferation;Cell apoptosis

441021 湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院

劉韻

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.004

R737.33

A

1001-5930(2016)08-1230-04

2015-09-07

2016-02-07)