張玉娜　王國(guó)玉　宋　捷　夏　偉

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·基礎(chǔ)研究·

shRNA結(jié)合131I-免疫脂質(zhì)體抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的初步研究

張玉娜王國(guó)玉宋捷夏偉

目的探索RNA干擾與131I-免疫脂質(zhì)體聯(lián)用在膠質(zhì)瘤疾病治療中的潛在價(jià)值。方法在合成pGPU6-GFP-Neo-EGFRvIII-shRNA表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，結(jié)合核素內(nèi)放射性131I免疫脂質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖凋亡的影響。結(jié)果成功構(gòu)建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvIII-shRNA載體；同時(shí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNA和131I免疫脂質(zhì)體聯(lián)用有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖和促進(jìn)其凋亡，抑制率達(dá)70%。結(jié)論shRNA結(jié)合131I免疫脂質(zhì)體能高效地促凋亡和抑制細(xì)胞增殖，為其在膠質(zhì)瘤治療中的應(yīng)用奠定了初步基礎(chǔ)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤;U251細(xì)胞;131I;shRNA;RNA干擾;免疫脂質(zhì)體

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1219～1221)

腦膠質(zhì)瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的和最具侵襲性的原發(fā)性腦瘤[1]，約占全部顱內(nèi)腫瘤的45%左右[2],，惡性膠質(zhì)瘤療效差，預(yù)后差[3-4]。隨著RNAi技術(shù)的不斷發(fā)展，以RNA為基礎(chǔ)用于治療多種人類疾病包括癌癥的潛在而安全有效的基因治療方法應(yīng)運(yùn)而生[4]。國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于免疫脂質(zhì)體作為載體運(yùn)送shRNA的報(bào)道，新近研究證實(shí)，免疫脂質(zhì)體還可以通過(guò)血腦屏障[4-5]。同時(shí)，放射性核素131I作為一種經(jīng)典的核素示蹤劑，除在影像診斷領(lǐng)域發(fā)揮重要作用外，也早已逐步應(yīng)用于診斷與治療并重的分子功能顯像和分子靶向治療領(lǐng)域[6]。目前已知EGFR的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起重要作用[7]。其突變體EGFRvⅢ與野生型EGFR相比缺失6-273位氨基酸殘基，這種突變體只出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，是一個(gè)很好的腫瘤治療靶標(biāo)[8]。本研究針對(duì)EGFRvⅢ基因，構(gòu)建特異性shRNA表達(dá)載體，由免疫脂質(zhì)體導(dǎo)入膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞表達(dá)，評(píng)估其對(duì)U251細(xì)胞政治凋亡的影響，以期為惡性膠質(zhì)瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

U251細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心提供；高糖DMEM購(gòu)自GIBCO；新生牛血清購(gòu)自Life Technologies；免疫脂質(zhì)體購(gòu)自INVITROGEN；pGPU6-GFP-Neo載體購(gòu)自吉瑪；Trizol購(gòu)自INVITROGEN；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa；RIPA裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)；Anti-EGFR (phospho Y1173) antibody [E124]，Goat Anti-Rabbit IgG Fc購(gòu)自Abcam；MTT細(xì)胞增殖及Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天。

1.2方法

1.2.1shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建依據(jù)pGPU6-GFP-Neo載體的克隆要求將EGFRvⅢ胞外區(qū)基因序列的shRNA序列5'-GAAAGGUAAUUAUGUGGUG-3'[9]克隆到pGPU6-GFP-Neo載體，同時(shí)將NC序列 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'克隆到pGPU6-GFP-Neo載體作為陰性對(duì)照。

1.2.2131I標(biāo)記免疫脂質(zhì)體使用Bolton和Hunter方法，Bolton Hunter試劑溶于DMSO，濃度為22.5 μCi/μL。60 μL的聚合物溶液與20 μL的Bolton Hunter在室溫下反應(yīng)60 min。從低分子量產(chǎn)品中進(jìn)行純化，并更換緩沖液為含有150 mM NaCl，pH為7.4的Hepes 緩沖液。每0.8 mL的餾分被收集，確定放射性活度和樣品收集。

1.2.3體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)取U251細(xì)胞接種96孔板，5.0×103個(gè)/孔，設(shè)多個(gè)平行孔，細(xì)胞分不同治療組：131I組、131I-免疫脂質(zhì)體組、shRNA-131I-免疫脂質(zhì)體組、shRNA-免疫脂質(zhì)體組、空白對(duì)照組，與U251細(xì)胞孵化48 h。

1.2.4MTT分析MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(GIR)，分析基因治療和內(nèi)照射治療的協(xié)調(diào)效應(yīng)。

1.2.5轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)Real time PCR方法檢測(cè)靶基因的敲降效果，提取出總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物如下：EGFRvⅢ(F:TGACTCCGTCCAGTATTGATCG，R:ATTCCGTTACACACTTTGCGGC);EGFRvⅢ-shRNA(F:GAAAGGTAATTATGTGGTG，R:TTGATGAGTTTGGACAAACC);EGFRvⅢ-NC(F:TTCTCCGAACGTGTCACGT，R:TTGATGAGTTTGGACAAACC);GAPDH(F:TTGAAGGGTGGAGCCAAAC，R:ACAGTCTTCTGGGTGGCAG).

1.2.6蛋白質(zhì)水平檢測(cè)Western Blot方法分析靶基因蛋白表達(dá)水平的變化，提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定含量后進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳并轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影、定影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS 10.0 軟件，應(yīng)用T-student檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1shRNA表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)EGFRvⅢ基因的CDS序列設(shè)計(jì)shRNA序列，合成后通過(guò)限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和BbsⅠ將其克隆至pGPU6-GFP-Neo載體，并且測(cè)序驗(yàn)證克隆成功，見(jiàn)表1。

表1　shRNA載體克隆序列信息表

2.2EGFRvⅢ轉(zhuǎn)錄水平分析

為了分析不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平EGFRvⅢ mRNA變化情況，取48 h后所得細(xì)胞抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1A所示，與空白對(duì)照組相比，在轉(zhuǎn)錄水平上，shRNA-131I-免疫脂質(zhì)體組EGFRvⅢ mRNA含量最低，shRNA-免疫脂質(zhì)體組其次，131I組、131I-免疫脂質(zhì)體組與空白對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異。

2.3EGFRvⅢ蛋白水平分析

取48 h后所得細(xì)胞進(jìn)行總蛋白抽提，并經(jīng)蛋白定量后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，分析不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞蛋白水平EGFRvⅢ變化情況，結(jié)果如圖1B所示，在蛋白表達(dá)水平上，131I組、131I-免疫脂質(zhì)體組EGFRvⅢ蛋白含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異，shRNA-免疫脂質(zhì)體組EGFRvⅢ蛋白含量下降，shRNA-131I-免疫脂質(zhì)體組EGFRvⅢ蛋白含量顯著降低。

2.4細(xì)胞增殖分析

為了分析"shRNA-免疫脂質(zhì)體-131I"復(fù)合物對(duì)U251細(xì)胞增殖凋亡的影響，復(fù)合物處理細(xì)胞48 h后，首先通過(guò)MTT法分析各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，其他各組細(xì)胞增殖都有明顯下降，尤其是shRNA-免疫脂質(zhì)體-131I組。結(jié)果提示RNA干擾結(jié)合131I-免疫脂質(zhì)體能更有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖。

A為Real time PCR，B為Western blot。

圖2　MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化

3　討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RNAi技術(shù)取得了迅猛發(fā)展，已被廣泛用于探索基因功能和多種疾病及惡性腫瘤的基因治療[10-11]。Fan等[9]利用特異針對(duì)EGFRvⅢ的外顯子1和外顯子8結(jié)合序列的siRNA，有效地抑制EGFRvⅢ在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)，導(dǎo)致磷酸化絲蘇氨酸激酶水平下降，從而增加細(xì)胞的凋亡。Pirollo等[12]采用脂質(zhì)體包裹小型干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)治療腫瘤，發(fā)現(xiàn)其可明顯降低腫瘤轉(zhuǎn)移率。Mizuno 等[13]分別將免疫球蛋白G(IgG)和G-22單抗的F(ab)2和陽(yáng)離子脂質(zhì)體偶聯(lián)制成免疫脂質(zhì)體，研究通過(guò)這2種免疫脂質(zhì)體將LacZ基因轉(zhuǎn)染到不同的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的效果。與未偶聯(lián)抗體的普通脂質(zhì)體相比，在表達(dá)cd44抗原的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶活性增加約2倍 ；與單次使用免疫脂質(zhì)體相比，重復(fù)使用則使β-半乳糖苷酶活性又增加約2倍。結(jié)果顯示，重復(fù)使用陽(yáng)離子免疫脂質(zhì)體能獲得較高的基因轉(zhuǎn)染效果，是基因治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的潛在有效方法。與此同時(shí)，131I發(fā)出β粒子，由于其電離作用較強(qiáng)，對(duì)腫瘤組織可產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制和破壞作用，射程較短，對(duì)腫瘤外正常組織影響較小，且具有可示蹤性等特點(diǎn)，一直被認(rèn)為是近距離內(nèi)照射治療腫瘤的理想選擇。

本研究旨在整合RNA干擾、免疫脂質(zhì)體和放療，探索治療膠質(zhì)瘤的高效方法。首先，通過(guò)基因克隆手段成功構(gòu)建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA載體；同時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示其能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平高效沉默EGFRvⅢ基因；最后，將其結(jié)合131I-免疫脂質(zhì)體處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，分析其對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的綜合效果，結(jié)果顯示三者聯(lián)用更有效地抑制細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。但是上述都是體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并不代表其在體內(nèi)仍然能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。所以，我們的下一步將進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探索三者在動(dòng)物體內(nèi)的抑癌作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA載體，并在細(xì)胞水平證明pGPU6-GFP-Neo-EGFRvⅢshRNA-131I-免疫脂質(zhì)體能更高效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，該結(jié)果為其在腫瘤治療中的應(yīng)用奠定了初步基礎(chǔ)。

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(編輯：吳小紅)

A Preliminary Study about the Inhibition of U251 Cell Proliferation by Expressing shRNA Combined with131I-immune Liposome

ZHANG Yu'na,WANG Guoyu,SONG Jie,et al.

Putuo District People's Hospital,Shanghai,200060

ObjectiveTo investigate the potential value of RNAi combined with131I-immune liposome in glioma treatment.MethodsStructuring the vector harboring EGFRvⅢ shRNA expression cassettes,used in cell experiments with131I-immune liposome,to study the effect on proliferation and apoptosis of U251 cells.ResultsshRNA combined with131I-immune liposome targeted to EGFRvⅢ was able to effectively inhibit the proliferation and apoptosis of U251 cell.The inhibition rate was 70%.ConclusionshRNA combined with131I-immune liposome can efficiently promote apoptosis and inhibit cells proliferation,which laid a preliminary foundation for its application in the treatment of gliomas.

Gliomas;U251 cell;131I;shRNA;RNA interference;Lmmune liposome

上海市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：20114y194)

200060 上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院(張玉娜，王國(guó)玉，宋捷)；200137 上海市第七人民醫(yī)院(夏偉)

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.001

R730.264

A

1001-5930(2016)08-1219-03

2015-09-19

2016-07-071)