□ 付慧彥　諾利如一（北京）生物科技有限公司　劉新旗　北京工商大學郭　際　諾利如一（北京）生物科技有限公司　胡永生　河北嘉好糧油有限公司

核桃肽酶解條件的研究

□ 付慧彥諾利如一（北京）生物科技有限公司劉新旗北京工商大學
郭際諾利如一（北京）生物科技有限公司胡永生河北嘉好糧油有限公司

以核桃仁為原料，提取核桃油后，采用酶法制備核桃多肽，試驗過程根據(jù)核桃蛋白及所使用酶的特性，研究了酶反應時底物濃度、酶添加量、反應前的液體的殺菌溫度和殺菌時間，以及阻止核桃蛋白熱凝聚的輔料對酶反應的DH和得率的影響。試驗結果表明：當?shù)孜餄舛葹?%，添加0.3%卡拉膠，殺菌溫度120 ℃，時間15 min，再添加復合酶10 000 U/g，反應溫度58 ℃，pH值9.0，反應時間3.5 h,得到核桃肽DH為31.11%，核桃肽得率為60.75%。

核桃仁含有豐富的蛋白質，其主要由4類蛋白質構成，其中谷蛋白含量為70.1%，醇溶蛋白5.05%，球蛋白17.6%，清蛋白6.8%。核桃蛋白生物價、蛋白質凈利用率和消化率都很高，其中的支鏈氨基酸和中性氨基酸含量都很高，是植物蛋白中營養(yǎng)價值很高的蛋白質，具有極高的深加工價值。

核桃蛋白的簡介

核桃蛋白的氨基酸組成

研究分析了核桃蛋白的氨基酸組成，數(shù)據(jù)顯示核桃蛋白主要由18種氨基酸組成，其中疏水性氨基酸和酸性氨基酸含量較高，分別占39.21%和30.13%，其含有的8種人體必需氨基酸的含量合理，占總氨基酸含量的31.82%，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量高。核桃蛋白能充分滿足FAOWHO建議的于成年人所必需氨基酸的攝入，因此核桃蛋白是一種優(yōu)質的植物蛋白。

核桃蛋白質特性

研究表明，核桃蛋白在pH5左右，溶解度最小，而在偏離pH5的酸性和堿性條件下，溶解度較高，因在偏離等電點的條件下，蛋白呈正離子和負離子狀態(tài)，電荷互相排斥，分子分散性較好。

研究表明，核桃蛋白熱穩(wěn)定性差，核桃蛋白的熱變性溫度是67.05 ℃。其溶液在不同溫度條件下的溶解度曲線圖如圖1所示。溫度在58 ℃時，核桃蛋白質的NSI值最大，低于此溫，NSI值隨著溫度的升高而增加，從58℃開始到67.05 ℃，NSI值開始急劇下降，67.05 ℃是核桃蛋白開始熱變性的溫度，從67.05 ℃開始核桃蛋白的NSI還是在下降，但是下降的速度有所緩解。這是因為溫度較低時，核桃蛋白分子和水分子之間的相互作用力比較低，當溫度適當增加時，核桃蛋白分子立體結構伸展，增加了核桃蛋白分子和水分子之間的相互作用力，起到增溶作用。當溫度繼續(xù)升高，超過核桃蛋白質的變性溫度時，蛋白空間構象中的弱鍵斷裂，破壞了肽鍵特定結構，原來包在分子內部的疏水基團暴露，分子間相互結合凝結沉淀，降低了核桃蛋白的溶解性。

材料與方法

試驗材料

核桃仁：長白山，市售一級、無病蟲害、成熟度高，達到采收標準。冷藏、備用。

試驗試劑

氫氧化鈉、三氯乙酸（分析純）、硫酸（98%）、硫酸銅（分析純）、硫酸鉀（分析純）、稀鹽酸、硼酸（分析純）以及指示劑：天津化學試劑廠；復合蛋白酶（諾維信生物科技有限公司）；黃原膠（阜豐集團）、大豆多糖（谷神集團）、卡拉膠（嘉吉中國）。

試驗儀器與設備

圖1　核桃蛋白溶液在不同溫度條件下的溶解度曲線圖

精密分析天平（龍騰）、恒溫水浴鍋（上海博訊）、pH計（梅特勒）、恒溫干燥箱（上海博訊）、冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、凱氏定氮儀（FOSS）以及高壓鍋（上海博訊）。

試驗方法

1核桃肽制備過程

核桃肽制備過程，如圖2所示。

2試驗研究方案

為了確保核桃蛋白酶解過程不受其他有害微生物的影響，在核桃蛋白酶解之前需要進行高溫殺菌，殺菌溫度的高低直接影響了核桃蛋白的酶解效果和生產(chǎn)收率，由于核桃蛋白在67.05 ℃時會發(fā)生蛋白凝聚，導致核桃蛋白溶液的溶解性下降，影響了酶解程度和產(chǎn)品得率。因此，本實驗的目的是通過研究核桃蛋白底物濃度、復合酶的添加量、輔料種類、輔料的添加量、殺菌時間以及殺菌溫度得到核桃肽生產(chǎn)的最適宜的生產(chǎn)條件。

結果與討論

酶解條件的優(yōu)化

1底物濃度對水解度的影響

選取加酶量為10 000 U/g底物，酶解溫度（58±2） ℃，pH值9.0，酶解時間3.5 h。以核桃蛋白質質量為基準，定容成3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%和12%的水溶液，測定核桃蛋白水解度DH和得率。結果如圖3所示?？梢钥闯?，隨著底物濃度的增加，DH和得率都呈現(xiàn)下降的趨勢，但DH值變化較小，得率變化較大。實驗現(xiàn)象看到，底物濃度超過6%時，核桃肽的得率和DH變化趨勢減緩，所以核桃蛋白酶解液底物濃度選定為6%。

2復合蛋白酶添加量對DH和得率的影響

復合蛋白酶添加量為10 000 U/g時，核桃肽水解度和得率漲勢最快，添加量超過10 000 U/g后，DH和得率雖然也在增長，但是，漲幅比較慢，所以試驗選定酶添加量為10 000 U/g（如圖4所示）。

輔料種類對核桃蛋白熱凝聚性的影響

由于核桃蛋白中谷蛋白含量較高，其在67.05 ℃時就會發(fā)生熱變性，變性狀態(tài)分子暴露出來的疏水性基團是蛋白質的疏水相互作用達到最大，使得蛋白質凝聚。但是在核桃肽酶解之前，需要經(jīng)過一次高溫殺菌，以避免其他有害微生物影響酶解條件。殺菌的溫度影響到核桃蛋白的熱凝聚。因此，需要選定一種輔料來降低核桃蛋白的凝聚度，試驗過程中選用了大豆多糖、黃原膠、卡拉膠作為抑制核桃蛋白凝聚的輔料。

1核桃蛋白熱凝聚性的測定

一定量的核桃蛋白質溶液，溶解于pH9.0的水溶液中，在100 ℃加熱30 min，3 000 rpm，離心30 min，取沉淀，充分水洗后，測定其蛋白質含量，與初始液體蛋白含量的比值，即可計算出凝聚的蛋白占總蛋白的比例。在同等條件下添加大豆多糖、黃原膠、卡拉膠和空白試驗得出，卡拉膠對蛋白熱凝聚抑制效果最顯著，且在添加量低于0.3%時，熱凝聚力下降的很快，超出0.3%時，下降的速度減緩（如圖5所示）。因此，試驗后選定0.3%的添加量的卡拉膠作為輔料，以達到抑制核桃蛋白熱凝聚的目的。

圖2　核桃肽制備流程

圖3　底物濃度對水解度的影響

圖4　復合蛋白酶添加量對DH和得率的影響

大豆多糖、黃原膠、卡拉膠都是一種親水膠體，分子中含有親水基團，對核桃蛋白形成一層保護層，又因其膠黏性，可以增加體系粘度，減少蛋白凝聚?？ɡz中含有硫酸鹽基團R-OSO3，其有陰離子性，能與蛋白發(fā)生相互作用，從而對膠束、膠團起穩(wěn)定的作用，比其他膠體更能降低蛋白的熱凝聚性。

2殺菌溫度對酶解DH和得率的影響

不同的熱處理工藝對核桃蛋白功能性有很大的影響。試驗過程中，選定80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃和120 ℃的，殺菌時間條件15 min，添加0.3%卡拉膠進行滅菌，滅菌后酶解，底物濃度6%，復合酶添加量10 000 U/ g，反應液溫度58 ℃，pH值9.0酶解3.5 h，反應后測其DH和得率。當殺菌溫度低于120 ℃時，DH和得率都有顯著增加，超過120 ℃時，增加的趨勢減緩（如圖6所示）。因此，選定殺菌溫度為120 ℃。

3殺菌時間對酶解DH和得率的影響

試驗過程中，選定殺菌溫度為120 ℃，殺菌時間5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，添加0.3%卡拉膠進行滅菌，滅菌后酶解，底物濃度6%，復合酶添加量10 000 U/g，反應液溫度58 ℃，pH值9.0酶解3.5 hr，反應后測其DH和得率。殺菌時間低于15 min時，DH和得率增加，超過15 min時增加趨勢減緩（如圖7所示）。因此，選定殺菌時間為15 min。

結論

圖5　輔料對核桃蛋白熱凝聚性的影響

圖6　殺菌溫度對酶解DH和得率的影響

圖7　殺菌時間對酶解DH和得率的影響

試驗結果表明：核桃仁經(jīng)壓榨和超零界萃取后，在pH值為9.0，底物濃度6%，殺菌條件120 ℃，15 min，用0.3%的卡拉膠作為抑制熱凝聚的輔料，反應溫度58 ℃，反應3.5 h，其DH和得率可以達到最佳，此時DH為31.11%，核桃肽得率為60.75%。

劉新旗（1962-），男，漢族，江蘇徐州人，博士，教授。研究方向：植物蛋白和油脂的生理活性及其生產(chǎn)應用技術。