劉勛，陳明，楊志惠

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000）

GTP結(jié)合蛋白4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定*

劉勛，陳明，楊志惠

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州646000）

目的:為了建立GTPBP4基因沉默的人結(jié)腸癌細胞株，研究GTPBP4基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細胞株RKO細胞增殖和凋亡的影響，構(gòu)建并鑒定GTPBP4基因RNA干擾慢病毒載體。方法：針對GTPBP4 mRNA設(shè)計siRNA，構(gòu)建pGCSIL-GFPGTPBP4慢病毒載體，感染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，并進行滴度測定。將慢病毒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細胞株RKO，通過Realtime PCR和Western Blot分析GTPBP4基因敲減效率。結(jié)果：結(jié)果顯示，插入DNA序列與目的基因序列一致，提示插入人GTPBP4基因序列正確。293T細胞中病毒滴度的測定結(jié)果2×108 TU/mL。經(jīng)siRNA慢病毒感染后，實驗組RKO GTPBP4基因mRNA水平表達量受到顯著抑制，Western Blot結(jié)果顯示敲減效率達到72.9%。結(jié)論:GTPBP4基因RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功，可用于結(jié)腸癌生物行為等各方面的研究。

GTPBP4基因；RNA干擾；慢病毒載體；結(jié)腸癌

GTP結(jié)合蛋白4（GTP binding protein4，GTPBP4）基因，位于人染色體10p15-p14，基因庫編號：DQ496111.1，是一條長12285bp的線性DNA序列[1]。該基因編碼的蛋白為GTP結(jié)合蛋白，其作為一個分子開關(guān)，存在激活和失活兩種狀態(tài)。該蛋白參與60S核糖體亞基的生物合成。有報道稱該基因與乳腺癌，白血病耐藥性等有關(guān)[2]。在野生型P53相關(guān)性的乳腺癌中，GTPBP4表達的增高與患者生存率降低相關(guān)[3]。課題組前期實驗結(jié)果顯示結(jié)腸癌癌組織中GTPBP4 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，為進一步了研究GTPBP4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究擬構(gòu)建人GTPBP4 RNA干擾（RNA inter-ference，RNAi）慢病毒載體并進行鑒定為后續(xù)結(jié)腸癌的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T細胞（慢病毒包裝細胞）、RKO人結(jié)腸癌細胞株、PCR引物及慢病毒載體pGCSIL-GFP均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，DMSO購自上海生物試劑廠，胰酶購自上海化學(xué)試劑公司。大腸桿菌菌株DH5α，Lipofectamine 2000，Trizol均購自Invitrogen公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Rnase Inhibitor均購自美國promega，oligo dT購自上海生工，抗體Anti-GTPBP4 antibody購自abcam，Goat Anti-Rabbit IgG及Mouse anti-GAPDH均購自Santa-Cruz。

1.2 人源細胞的培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)：從液氮中取出RKO與293T細胞株并復(fù)蘇，在含胎牛血清FBS及DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.3 GTPBP4基因的RNAi慢病毒載體構(gòu)建、提取及鑒定

針對人GTPBP4基因序列，設(shè)計并合成針對GTPBP4特異性干擾序列RNAi-1：5'-CCGGGCGTAGTCTTGGTGTTGACATCTCGAGATGTCAACACC AAGACTACGCTTTTTG-3'；RNAi-2：5'-AATTCAAA AAGCGTAGTCTTGGTGTTGACATCTCGAGATGTCA ACACCAAGACTACGC-3'。將合成的DNA oligo溶于緩沖液中90℃，水浴15 min退火配對，形成帶粘性末端的雙鏈。再使用AgeI，EcoRI酶切線載體pGCSIL-GFP使其線性化，用T4連接酶將合成的雙鏈DNA連接于酶切后的RNAi慢病毒載體上。用氯化鈣制備感受態(tài)大腸桿菌，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的大腸桿菌感受態(tài)DH5α中進行克隆擴增，對長出的克隆先進行PCR鑒定，再將PCR陽性克隆進行測序分析。針對此實驗設(shè)計的陰性對照DNA單鏈序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。GTPBP4特異性干擾及陰性對照重組質(zhì)粒分別命名為LVGTPBP4-RNAi（24998-1）及CON053。

1.4 GTPBP4 RNAi慢病毒包裝及滴度檢測

按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用說明操作。取細胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期且細胞密度為70%～80%的293T細胞，轉(zhuǎn)染前更換無血清培養(yǎng)基，加入pGCSIL-GFP載體20 μg，PHelper1.0載體15 μg和PHelper 2.0載體10 μg，與Opti-MEN混合均勻，再與稀釋的Lipofectamine 2000顛倒均勻，采用共同轉(zhuǎn)染細胞的方法轉(zhuǎn)染293T細胞。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。48 h后，收集細胞上清液并在4℃的條件下，4 000×g離心10 min，再用0.45 μL的濾器過濾上清液，除去細胞碎片，得到病毒粗提取液；然后將病毒粗提取液4 000×g離心，約10～15 min，棄上清液，再離心＜1 000×g，時間2 min，得到的即為病毒濃縮液。采用孔稀釋法測定病毒滴度，于96孔板培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的293T細胞，4 d后通過熒光倒置顯微鏡計數(shù)熒光細胞數(shù)，再根據(jù)視野中熒光表達的情況計算病毒滴度。

1.5 人結(jié)腸癌RKO細胞慢病毒感染

感染前，首先將目的細胞RKO復(fù)蘇，將細胞懸液接種于含3 mL完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞狀態(tài)良好并將處于對數(shù)生長期時，將其用胰酶消化，制成細胞懸液；再將制成的細胞懸液接種于6-well中，每孔細胞數(shù)約為5×104個，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到約30%；根據(jù)細胞感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值，加入適宜量LVGTPBP4-RNAi病毒（RKO細胞正常，加Polybrene，MOI為5的時候進行感染），將感染的細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設(shè)置陰性對照組及空白對照組。若感染后細胞狀態(tài)正常，則24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)；3 d后觀察熒光表達情況，如果感染效率（熒光率）大于80%，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功，可進行收集細胞提取RNA及蛋白。若感染后細胞狀態(tài)不佳有明顯的細胞毒作用或者感染效率低于80%，則需要重新進行感染實驗。

1.6 Real-time PCR檢測GTPBP4 mRNA的表達

提取感染率超過50%的目的細胞，按Trizol操作說明書提取總RNA，再根據(jù)M-MLV操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將引物、SYBR GreenⅠ染料、cDNA、水按照比例配置反應(yīng)體系（反應(yīng)體系試劑總量20 μL），進行Real-time PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，15 s，進行1個循環(huán)；之后每一步變性95℃，5 s；退火延伸60℃，30 s；共進行45個循環(huán)。（實驗組引物序列：GTPBP4上游5’-CAGCCCTATGCGTTCACAAC-3’、下游5’-TCCCAGGAGTGTCTACAACCT-3’；陰性對照組引物序列：GAPDH上游5’-TGACTTCAACAGCGACACCA-3’、下游5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’）。根據(jù)PCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和看家基因的Ct值，計算2-ΔΔCt值進行定量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.7 Western Bolt檢測目的細胞中GTPBP4蛋白的表達

提取目的細胞總蛋白20 μg，在濃度為10%的SDS-PAGE分離膠上進行電泳，120 mA，1 h。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件：4℃，150 min，400 mA恒流。轉(zhuǎn)膜后用封閉液封閉過夜，再進行雙抗孵化。實驗組一抗?jié)舛?∶500，二抗?jié)舛?∶2 000；對照組一抗?jié)舛?∶5 000，二抗?jié)舛?∶5 000。最后按照說明加顯色液，再暗室曝光，顯影。

2 結(jié)果

2.1 GTPBP4 RNAi慢病毒載體的DNA測定

挑選陽性克隆的大腸桿菌進行PCR鑒定。經(jīng)PCR反應(yīng)生成條帶：連接入GTPBP4 RNAi的陽性克隆PCR片段大小為：343bp（從載體中切掉24bp）；沒有連接入GTPBP4 RNAi的空載體克隆PCR片段大小為：306bp，PCR電泳圖片如下（圖1）。為保證合成的GTPBP4 RNA干擾序列表達框無誤，挑選陽性克隆進行DNA測序鑒定，測序結(jié)果顯示：插入的堿基序列片段與目的基因完全一致，表明GTPBP4 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖1 慢病毒表達載體的PCR鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）

2.2 GTPBP4 RNAi慢病毒重組體的包裝及鑒定

采用上述方法使慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞，培養(yǎng)293T細胞2 d后，用熒光顯微鏡觀察細胞，細胞狀態(tài)良好。用孔稀釋法測定病毒滴度為2×108 TU/mL，說明病毒包裝成功。

2.3 Real-time PCR分析GTPBP4 mRNA表達

統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，GTPBP4基因敲減后，其mRNA表達量低于陰性對照組（見表1），實驗組與對照組的GTPBP4基因敲減率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)LV-GTPBP4-RNAi慢病毒感染后，實驗組RKO細胞中GTPBP4基因在mRNA水平的表達量受到顯著抑制（見圖2）。

2.4 Western Bolt檢測目的細胞中GTPBP4蛋白表達量

從Western Blot灰度結(jié)果分析可以看出，轉(zhuǎn)染病毒后，實驗組RKO細胞中GTPBP4蛋白的表達量較陰性對照組蛋白的表達量顯著降低。GTPBP4基因沉默后，其蛋白敲減效率達到72.9%（見圖3）。

圖2 實驗組與對照組RKO細胞中GTPBP4基因mRNA表達量

圖3 實驗組及對照組Western Blot掃面圖片

表1 當MOI值為5時，LV-GTPBP4-RNAi慢病毒感染RKO細胞后GTPBP4基因mRNA敲減的定量數(shù)值及分析

3 討論

結(jié)腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，中老年為最高發(fā)年齡組[4]。近來結(jié)腸癌在我國的發(fā)病趨勢更是逐年攀升；就全球范圍看，結(jié)腸癌發(fā)病率占所有癌癥的第4位，病死率為第2位[5]。結(jié)腸癌的診斷主要依靠病理檢測，治療則以手術(shù)為主，化療、放療為輔。但是在目前結(jié)腸癌患者的診斷中，晚期患者比例較高，且患生存質(zhì)量及生存率較低[6]。提高結(jié)腸癌患者的生存率，必須早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。結(jié)腸癌的發(fā)病機制較復(fù)雜，涉及多種抑癌基因和原癌基因相互作用[7]，因此結(jié)腸癌相關(guān)基因的研究一直是研究熱門。如：近年來發(fā)現(xiàn)新抑癌基因NGX6與結(jié)腸癌細胞凋亡有關(guān)[8]；RECK和MMP-9在結(jié)腸癌組織中的表達對結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展可能起著促進作用[9]；Survivin、Bcl-2[10]及PTEN[11]蛋白在結(jié)腸癌組織的表達可作為預(yù)測預(yù)后的因素之一；Raf激酶抑制蛋白、上皮型鈣黏蛋白[12]、人軟骨糖蛋白39（YKL-40）、及白細胞介素-6（IL-6）蛋白[13]在結(jié)腸癌組織中的表達可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)等。本課題亦是對結(jié)腸癌相關(guān)基因的研究，題組前期實驗結(jié)果顯示結(jié)腸癌癌組織中GTPBP4 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，因此推斷人GTPBP4可能在結(jié)腸癌發(fā)生機制中起著重要的作用。

RNAi技術(shù)是一種在轉(zhuǎn)錄后水平抑制相關(guān)基因表達的一種調(diào)節(jié)機制，其主要原理為雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）會誘導(dǎo)與之同源的目標信使RNA（message RNA，mRNA）降解，從而達到抑制特定基因表達的效果[14]。RNA干擾具備高特異性、高效性、可遺傳性及遠距離效應(yīng)等，因此成為基因沉默的理想工具。慢病毒載體與傳統(tǒng)的病毒載體相比具備以下優(yōu)點：使目的基因在宿主細胞中長期穩(wěn)定地表達；可轉(zhuǎn)染細胞分裂的的各個時期；兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子等[15]。慢病毒載體將RNAi片段導(dǎo)人宿主細胞，抑制同源mRNA的表達，使目的基因持續(xù)而穩(wěn)定沉默[16]。國內(nèi)外關(guān)于GTP結(jié)合蛋白4（GTP binding protein4 GTPBP4）基因的研究較少，此基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用不明確。為進一步探究GTPBP4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究用pGCSIL-GFP載體，PHelper1.0載體及PHelper2.0載體構(gòu)建慢病毒載體系統(tǒng)，成功感染RKO細胞株，并通過Real-time PCR及western-blot實驗證明LVGTPBP4-RNAi使GTPBP4 mRNA和蛋白的表達受到明顯的抑制，達到基因沉默的作用，為后續(xù)GTPBP4與結(jié)腸癌生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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（2016-03-30收稿）

Construction and identification of lentiviral vector for RNA interference targeting GTP binding protein 4

Liu Xun,Chen Ming,Yang Zhihui
DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,SichuanProvince646000,China

Objective：A lentiviral vector for RNA interference targeting GTP binding protein 4（GTPBP4）was constructed,which was used to establish a human colon cancer cell line,RKO to study the effect of GTPBP4 on cell proliferation and apoptosis.Methods：A siRNA targeting GTPBP4 mRNA was designed and cloned into a lentiviral vector to generate pGCSIL-GFP-GTPBP4.The virus was packaged in 293T cells and the titer of the virus was determined.Human colon cancer cell line RKO was transduced with the lentivirus,and the efficiency of the gene knocking-down was analysed by Real-time PCR and Western blot.Results：The identity of the plasmid was verified by DNA sequencing.After packaging,the titer of the virus was 2×108 TU/mL.When the virus was introduced into RKO cells,the expression GTPBP4 was inhibited at both mRNA and protein levels,with a knockdown efficiency of 72.9%on Western Blot.Conclusion：The lentiviral vector expressing of GTPBP4-RNAi was successfully constructed,which can be used in studying the biological roles/functions of GTPBP4.

GTP binding protein 4 gene;RNA interference;Lentiviral vector;Colon carcinoma

R78，Q75

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.016

*四川省科技廳科技計劃項目（NO：14JC0091），瀘州市科技局科技計劃項目（2013 LZLY-J44）

劉勛（1991-），女，碩士生

楊志惠（1973-），女，博士。E-mail：Yzhih 73@126.com