唐勇，向小紅，李國(guó)春,許紅

（西南醫(yī)科大學(xué):1附屬中醫(yī)醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心；2藥學(xué)院藥理學(xué)系；3附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州646000）

趕黃草不同濃度乙醇提取物中沒(méi)食子酸含量的測(cè)定

唐勇1，2，向小紅，李國(guó)春1,許紅1

（西南醫(yī)科大學(xué):1附屬中醫(yī)醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心；2藥學(xué)院藥理學(xué)系；3附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州646000）

目的：測(cè)定趕黃草不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物收率及其中沒(méi)食子酸含量，為篩選更優(yōu)的趕黃草提取方法提供參考。方法：①用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇采用熱回流提取法提取趕黃草，得到趕黃草提取物；②采用Agilent C18色譜柱，甲醇-0.15%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫35℃，流速1.0 mL·min-1測(cè)定趕黃草提取物中沒(méi)食子酸含量。結(jié)果：35%乙醇、55%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取得到的趕黃草浸膏收率分別為16.3%、16.6%、16.8%、9.6%，所得提取物中沒(méi)食子酸含量分別為10.81 μg·mg-1、11.87 μg·mg-1、13.61 μg·mg-1、15.50 μg·mg-1。結(jié)論:75%乙醇提取趕黃草收率及提取物中沒(méi)食子酸含量總量最高，95%乙醇趕黃草提取物中沒(méi)食子酸濃度最高。

趕黃草；乙醇；沒(méi)食子酸；含量

趕黃草（Penthorum Chinese Pursh）又名水澤蘭，為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草的干燥地上部分，主要分布與我國(guó)華東、華北、中南、陜西、四川和貴州等地，具有清熱解毒、活血平肝、健脾祛黃等功效，是苗族治療肝病的常用藥物[1]。現(xiàn)代研究顯示趕黃草還具有清除DPPH自由基、抗病毒、抗突變等藥理活性[2-5]，趕黃草的化學(xué)成分主要為黃酮類、揮發(fā)油類、苷類等，已報(bào)道單體成分有喬松素7-O-β-D-葡萄糖苷、2，4，6-三羥基苯甲酸、沒(méi)食子酸、槲皮素、2，6-二羥基苯乙酮-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等20余種[6-7]。單一組分藥理實(shí)驗(yàn)表明，沒(méi)食子酸具有抗乙肝病毒和保肝作用的成分[7-10]。因此測(cè)定趕黃草提取物中沒(méi)食子酸的含量是評(píng)價(jià)提取方法以及評(píng)價(jià)提取物藥理活性質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，本文建立了RP-HPLC測(cè)定趕黃草不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物中沒(méi)食子酸的含量，對(duì)比其含量差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

趕黃草（四川省瀘州市百草堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：130606-1），無(wú)水乙醇（吉林省新天龍實(shí)業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20130308），沒(méi)食子酸（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：130711），甲醇（美國(guó)Sigma公司），甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0054 g于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.540 mg·ml-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

用蒸餾水將無(wú)水乙醇按體積分?jǐn)?shù)稀釋為35%、55%、75%、95%四個(gè)濃度溶液備用，將實(shí)驗(yàn)分為35%乙醇提取物組，55%乙醇提取物組，75%乙醇提取物組，95%乙醇提取物組4個(gè)實(shí)驗(yàn)組及沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品組共5個(gè)組。

1.4 供試液的制備

各實(shí)驗(yàn)組稱取趕黃草100 g于圓底燒瓶中，加入3倍體積的對(duì)應(yīng)濃度乙醇浸泡30 min后，加熱回流提取2 h,所得提取物經(jīng)過(guò)濾、回收乙醇、真空干燥等操作成干燥粉末待用。稱取約相當(dāng)于原生藥1 g的提取物于50 mL容量瓶中，甲醇定容，微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾即得供試品溶液。

1.5 色譜條件

色譜柱為：Agilent C18（4.6 mm×150 mm×5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇：0.15%磷酸溶液＝10∶90，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫35℃，流速1.0 ml·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,2.5 mL,5.0 mL,7.5 mL,10.0 mL于4只10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線供試液。

按實(shí)驗(yàn)色譜條件，各對(duì)照品供試液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)（A），沒(méi)食子酸含量為橫坐標(biāo)（C）,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

照方法1.5所示色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，外標(biāo)峰面積法計(jì)算沒(méi)食子酸含量，理論塔板數(shù)＞5 000，沒(méi)食子酸RT=7.537 min，與相鄰峰分離度＞1.5，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸對(duì)照品與樣品色譜圖

2.2 線性關(guān)系

按1.6實(shí)驗(yàn)方法得回歸方程為：A=0.0004C-0.0059,r=0.9997，表明沒(méi)食子酸濃度在0.135 mg· mL-1～0.540mg·ml-1范圍內(nèi)，沒(méi)食子酸峰面積值（A）與濃度（C）之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，但由于其不過(guò)原點(diǎn)，因此采用外標(biāo)兩點(diǎn)法測(cè)定供試品中沒(méi)食子酸含量。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品供試液（0.540 mg·ml-1），連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測(cè)定峰面積積分值計(jì)算RSD。RSD=0.3417%，說(shuō)明儀器具有良好的精密度，見(jiàn)表1。

表1 精密度測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取35%乙醇提取物0.2037g共5份，按1.5方法測(cè)定沒(méi)食子酸含量，RSD=0.9288%說(shuō)明該方法據(jù)有較好的重現(xiàn)性，見(jiàn)表2。

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取95%乙醇提取物0.002596 g共10份，分為兩組：一組（5份）加甲醇超聲溶解后甲醇定容致10 mL，按1.5方法測(cè)定沒(méi)食子酸含量，另一組（5份）加入對(duì)照品溶液適量，加甲醇超聲溶解后甲醇定容致25 mL，按1.5方法測(cè)定沒(méi)食子酸含量，計(jì)算回收率，計(jì)算公式為：回收率（%）=（測(cè)定量-樣品中含量）/加入對(duì)照品量×100%，結(jié)果得：平均回收率為100.43%，RSD=0.1262%，見(jiàn)表3。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果

2.6 趕黃草不同濃度乙醇提取物收率及其沒(méi)食子酸含量

按1.4方法制備供試液，按1.5色譜條件，進(jìn)樣量10 μL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)峰面積由回歸方程計(jì)算各組供試品沒(méi)食子酸含量。由表2可知，35%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.3%，提取物中沒(méi)食子酸含量10.81 μg·mg-1，55%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.6%，提取物中沒(méi)食子酸含量11.87 μg·mg-1，75%乙醇提取趕黃草浸膏收率為16.8%，提取物中沒(méi)食子酸含量13.61 μg·mg-1，95%乙醇提取趕黃草浸膏收率為9.6%，提取物中沒(méi)食子酸含量15.50 μg·mg-1，見(jiàn)表4。

表4 趕黃草不同濃度乙醇提取物收率及沒(méi)食子酸含量的測(cè)定

3 討論

沒(méi)食子酸作為趕黃草中明確具有抗乙肝病毒和保肝作用的活性成分[11-12]，在趕黃草制劑中作為質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)趕黃草進(jìn)行現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)利用不可避免的需要對(duì)趕黃草進(jìn)行加工提取[13-16]，而需要找到良好的提取方法及提取溶劑，提取物中沒(méi)食子酸的含量是需要考察的一個(gè)重要指標(biāo)[14]，本文采用RP-HPLC測(cè)定趕黃草不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物中沒(méi)食子酸含量，由方法學(xué)考察情況看本實(shí)驗(yàn)所用方法可靠、穩(wěn)定。

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取趕黃草后所得浸膏收率情況看75%乙醇提取物浸膏收率最高，95%乙醇提取物中沒(méi)食子酸含量最高，從沒(méi)食子酸在提取物中的含量換算所得提取物中沒(méi)食子酸總量看，75%乙醇提取物中沒(méi)食子酸含量總量最高。

從提取物中沒(méi)食子酸含量總量看75%乙醇提取方法較好，從提取物中沒(méi)食子酸含量看95%乙醇提取較優(yōu)。有效成分含量是評(píng)價(jià)中藥提取分離方法較為重要的參考指標(biāo)，本文通過(guò)比較不同提取方法所得趕黃草提取物中沒(méi)食子酸的含量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用趕黃草，尋找最優(yōu)提取方法提供參考。

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（2016-03-07收稿）

Determination of the content of gallic acid in ethanol extract from different concentrations of ethanol extracts from Phethorum Chinese Pursh

Tang Yong1,2,Xiang Xiaohong3,Li Guochun1,Xu Hong11PIVAS of the Affiliated TCM Hospital of Southwest Medical University,2Departmant of Prarmacolgy of Southwest Medlical University;3Ophthalmology of the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Provivce,646000,China

Objective：The content of gallic acid and the recovery rate of Phethorum Chinese Pursh from different concentrations of ethanol extracts were determined in order to provide a better way to recover the Phethorum Chinese Pursh from extraction.Methods：①We use different volume fractions of ethanol were used in hot reflux extraction to extract the Phethorum Chinese Pursh extraction.②Gallic acid was analyzed by Agilent C18 column at 270nm.The mobile phase consisted of acetonitrile 0.1%phosphoric acid（10:90）,running at the velocity at 1.0 mL·min-1,and the column temperature was 35℃.Results：At the concentrations of ethanol of 35%, 55%,75%,95%，the recovery rates of Phethorum Chinese Pursh were 16.3%,16.6%,16.8%,9.6%,and the contents of gallic acid were 10.81 μg·mg-1,11.87 μg·mg-1,13.61 μg·mg-1,15.50 μg·mg-1,respectively. Conclusion：The recovery rate was the highest using 75%ethanol,whereas 95%ethanol gave the highest concentration of gallic acid.

Phethorum Chinese Pursh;Ethanol;Gallic acid;Content

R733.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.021

唐勇（1988-），男，碩士生，藥師。E-mail:tangy1989@yeah.net