蘇松，宋建生，羅德，劉江，賀凱，李波，夏先明

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

甲磺酸去鐵胺減輕大鼠肝臟低溫保存期缺血損傷的實驗研究*

蘇松，宋建生，羅德，劉江，賀凱，李波，夏先明

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000）

目的：探討甲磺酸去鐵胺（DFO）對大鼠離體肝臟低溫保存期損傷的影響。方法：80只SD大鼠，隨機分為4組，每組20只：HTK液保存組（HTK組），另外3組在HTK保存液中加入不同濃度的DFO，分別為25 umol/L（D25組）、50 umol／L（D50組）、100 umol／L（D100組）。游離取出肝臟后，分別置入各組保存液4℃保存24 h,冷保存結束后進行肝臟酶學檢查，病理學觀察，臺盼藍灌注，細胞凋亡以及丙二醛（MDA）檢測。結果：與HTK組相比，D50與D100組ALT、AST、LDH等酶學指標均明顯降低（P＜0.05）,肝臟臺盼藍染色時間均明顯縮短（P＜0.05），細胞凋亡水平均明顯下降（P＜0.05），MDA含量均降低（P＜0.05），同時D100組與HTK組相比，病理學評分明顯降低（P＜0.05）。而D25組與HTK組，以及加入DFO的各實驗組的組間比較無統(tǒng)計學差異。結論：在HTK保存液中加入DFO能有效減輕大鼠肝臟的冷缺血損傷，其保護機制可能與DFO減少了冷缺血期間氧自由基生成以及細胞凋亡程度有關。

鐵螯合劑；肝臟移植；器官保存；缺血損傷；氧自由基

器官保存是肝臟移植過程中的重要環(huán)節(jié)[1]，而冷保存是器官轉運過程中最常用的保存方式。盡管在冷保存條件下，肝臟組織通過降低代謝程度可以減輕細胞損傷的作用，但研究證實在較長時間的冷缺血條件下，組織器官仍會受到一定損害。而這些損害是導致肝移植術后原發(fā)器官無功能，膽管狹窄，慢性排斥反應等一系列并發(fā)癥的重要原因[2]。同時，肝臟冷缺血損傷也是制約邊緣供體或心臟死亡供體使用的重要因素之一[3]。因此，進一步研究肝臟冷缺血損傷機制并探索有效的拮抗手段已成為移植研究重要的方向。我們前期通過細胞學研究發(fā)現(xiàn)，使用鐵離子螯合劑-去鐵胺（desferrioxamine，DFO）可以減輕肝臟細胞的冷缺血損害[4]，為進一步探索DFO的保護作用，我們擬通過動物模型進行更深入的探討。

1 材料與方法

1.1 材料，試劑及儀器

雄性SD大鼠80只（250±30 g）,購于西南醫(yī)科大學動物實驗中心。主要試劑與藥物有：注射用甲磺酸去鐵胺（NOVARTIS，瑞士），HTK保存液（DR. FRANZ KOEHLER CHEMIE公司,德國），丙二醛（MDA）試劑盒（上海信裕生物制劑公司），TUNEL試劑盒（Sigma公司，美國）。主要儀器有752-分光光度儀（上海醫(yī)療器械廠），微量泵（上海標儀實驗儀器設備公司），自動生化分析儀（HITACHI公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 分組

大鼠隨機分為4組，每組20只。其中3組在HTK保存液中分別添加不同濃度的DFO，分別為25 umol/L（D25組）、50 umol／L（D50組）、100 umol／L的DFO（D100組），對照組HTK保存液中不添加DFO（HTK組）。冷保存結束后，每組隨機抽取10只進行臺盼藍灌注實驗，其余10只進行其他相關實驗。

1.2.2 模型制備

模型根據(jù)我們前期研究結果制備[5]，手術前大鼠禁食12 h，禁飲2 h。氯胺酮麻醉后取仰臥位，腹部弧形切口，顯露肝下腔靜脈，離斷右腎靜脈。結扎，離斷肝動脈后，游離出門靜脈遠端并予結扎。經(jīng)門靜脈插管并將4℃的各類保存液行供肝原位低壓重力灌洗。同時剪開肝上下腔靜脈驅血，至肝臟顏色變淡呈均勻灰黃色。遂將肝臟置于各保存液中在4℃條件下保存24 h。冷保存結束后，根據(jù)實驗要求，部分肝臟行臺盼藍灌注實驗，其余肝臟取標本后分別行冰凍保存以及10%甲醛固定后制成蠟塊。

1．3標本收集及檢測

李青海交代：“我在這個位置上，錢來得太容易。我當時已經(jīng)不滿足小打小鬧，希望得到更多的錢?！遍L期擔任鎮(zhèn)黨委一把手，李青海把五棵樹鎮(zhèn)當成了自己的“后花園”，重大決策、重大項目安排、大額資金使用基本由其個人決定，有項目必定雁過拔毛，沒項目創(chuàng)造項目也要貪，其斂財方式簡單粗暴，可以用“瘋狂”來形容。

1.3.1 ALT及LDH檢測

冷保存結束后分別取各組的保存液2 mL,在自動生化儀上進行丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）水平檢測。

1.3.2 微循環(huán)檢測（臺盼藍溶液灌注）

本實驗通過經(jīng)離體肝臟門靜脈插管處灌注臺盼藍溶液，記錄大鼠肝臟左外葉自灌注開始到均勻藍染的時間。通過肝臟藍染的時間，可估計肝臟組織的微循環(huán)通暢情況。具體方法根據(jù)Wu等[6]的方法改進，冷保存結束后，門靜脈插管處靜脈留置針連接微泵并灌注0.4%臺盼藍溶液，自微泵啟動開始計時，記錄大鼠肝臟左外葉完全均勻藍染所需時間。結果用秒（S）表示。

1.3.3 病理形態(tài)觀察

冷保存結束后，組織標本制成蠟塊。標本HE染色后行光鏡下觀察。采用Rauen等[7]建立的缺血再灌注肝臟病理半定量評分標準進行評分（見表1），每份標本評分由兩名病理科醫(yī)師盲法評判并取平均值。

表1 肝臟病理組織學評分標準

1.3.4 細胞凋亡檢測

將冷保存后標本行石蠟切片并采用TUNEL法行肝臟細胞凋亡檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。每張切片隨機選擇3個高倍光鏡視野（x 400），通過Image-Pro Plus 6.0軟件計算每個視野凋亡細胞密度（cell number／mm2）后取平均值。

冷保存結束后收集各組冰凍組織標本，制備肝組織勻漿，采用硫代巴比妥酸法（TBA）法測定MDA含量，檢測過程按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s進行描述，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計推斷，如結果有統(tǒng)計學差異則采用LSD及SNK法進行事后檢驗以比較兩兩之間的差異，P＜0.05表示結果有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 保存液ALT及LDH水平

肝臟冷缺血保存24 h后，HTK組、D25組、D50組、D100組保存液內(nèi)LDH水平分別為：（331.42± 72.18）U/L、（305.94±41.58）U/L、（246.01±42.52）U/ L、（239.53±41.03）U/L。而各組ALT水平分別為（120.16±14.40）U/L、（108.84±13.56）U/L、（91.28 ±12.99）U/L、（92.46±13.61）U/L。四組LDH及ALT水平存在明顯差異（F=7.81,P＜0.001;F=10.32,P＜0.001），其中D50、D100組LDH和ALT水平較HTK組以及D25組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,而D25組與HTK組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。D50與D100組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表2 冷缺血24 h保存液LDH、ALT水平比較（x±s）（U/L）

2.2 病理學觀察

光鏡下觀察見各組肝組織結構基本正常，HTK組及D25組可見肝細胞腫脹，肝竇間隙輕度增寬，較多空泡變性，并可見較多腫脹變形之肝竇內(nèi)皮細胞；D100組及D50組細胞腫脹及空泡變性明顯較HTK組及D25組減輕，見圖1。

圖1 各組肝臟冷保存24 h后組織病理學改變（HE×400）

肝組織病理評分分別為HTK組：1.95±0.55；D25組：1.87±0.21；D50組1.67±0.66；D100組：1.66±0.25。四組肝組織病理評分存在統(tǒng)計學差異（F=3.45，P=0.04）。其中，D100組與HTK組相比，病理學評分明顯降低，并具有統(tǒng)計學意義（P= 0.03）。其余各組組間比較無統(tǒng)計學差異。見表3。

表3 冷缺血24 h后病理評分（x±s）

2.3 肝臟微循環(huán)變化

研究通過經(jīng)門靜脈灌注臺盼藍溶液，并觀察其染色速度判斷肝臟的微循環(huán)功能[5]。肝臟冷保存24 h后經(jīng)門靜脈插管注入0.4%臺盼藍溶液，各組肝臟左外葉達到均勻藍染所需的時間存在明顯差異（F =7.07，P=0.001）。其中D100組、D50組分別為（64.5±8.6）S和（69.1±6.9）S，明顯短于HTK組（79.9±6.6）S、D25組（74.3±9.2）S（P＜0.05）（表4）。圖2可見臺盼藍溶液灌注60 s后肝臟染色情況，其中D100和D50組的染色明顯較HTK與D25組彌散、均勻。

表4 臺盼藍溶液灌注檢測微循環(huán)改變（x±s）

2.4 細胞凋亡觀察

冷保存結束后，各組肝臟細胞均存在凋亡現(xiàn)象（棕黃色顆粒），且各組凋亡情況存在統(tǒng)計學差異（F =9.25，P＜0.001）。添加了DFO的試驗各組其凋亡現(xiàn)象明顯較HTK組減輕（圖2）。定量分析的結果提示，HTK組與D25組凋亡細胞密度分別為（33.9± 3.9）cell number／mm2、（30.2±4.9）cell number／mm2其明顯高于D50組（25.7±5.1）cell number／mm2及D100組的（23.8±4.9）cell number／mm2（P＜0.05）（表5）。

表5 冷缺血24 h凋亡細胞密度(x±s)細胞數(shù)／mm2

圖2 冷保存12 h后各組肝臟細胞凋亡情況（TUNEL×400）

2.5 MDA含量比較

冷保存結束后，HTK，D25、D50、D100各組中肝組織內(nèi)MDA含量存在統(tǒng)計學差異（F=77.94，P＜0.001），分別為（2.55±0.25）nmol/mgprot，（2.40± 0.27）nmol/mgprot，（1.49±0.15）nmol/mgprot以及（1.35±0.25）nmol/mgprot。隨著DFO濃度的升高，肝組織內(nèi)MDA含量呈下降趨勢。D100、D50組與HTK組及D25組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；D25組與HTK組之間及D100、D25組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 冷缺血24 h后肝組織內(nèi)MDA含量（x±s）（nmol/mgprot）

3 討論

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，在添加DFO的器官保存液中，肝細胞損傷明顯減輕，肝臟冷保存后的微循環(huán)狀態(tài)得到明顯改善，同時中濃度和高濃度的DFO含量較低濃度有著更為明顯的保護作用，而在中濃度和高濃度之間，這種差異并不明顯。

低溫保存（4℃）是肝移植供體保存的最主要手段。盡管低溫狀態(tài)下降低了組織器官的代謝程度，但是冷缺血導致的能量耗竭，細胞水腫，酸中毒等仍是造成組織損害的重要因素[8]。目前臨床上常使用的UW液，HTK液，Celsor液等離體器官保存液通過添加能量底物,膠體物質，緩沖液等成分對減輕供體器官的冷缺血損傷可以起到積極的作用[8-9]。然而，作為缺血耐受作用較差的器官，肝臟的冷保存效果仍不是十分滿意，目前肝臟的冷保存安全時限仍限制在12 h左右[9]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，冷保存過程細胞內(nèi)有大量可螯合狀態(tài)鐵（chelatable iron）生成,而這類鐵離子超載在器官冷保存期間可通過催化Haber-Weiss反應誘導如OH-，F(xiàn)e-O2等氧自由基（ROS）產(chǎn)物產(chǎn)生。這些ROS產(chǎn)物可引起線粒體膜通透性改變，誘發(fā)細胞凋亡，從而造成組織損傷[4，10-11]。因此，降低冷保存期間此類可螯合狀態(tài)鐵水平，減少ROS損害，是提高保存器官冷缺血耐受的重要途徑。

DFO是一種高選擇性的鐵螯合劑，對游離鐵離子有較強的絡合能力。目前臨床上，此類藥物主要用于治療急性鐵中毒以及血色素沉積等疾病方面。而近年來，有研究發(fā)現(xiàn)DFO對缺血性損傷也明顯的保護作用，比如Chan等[12]采用大鼠心肌梗塞模型發(fā)現(xiàn)，注射DFO的大鼠較注射生理鹽水的對照組，心肌梗塞面積明顯減輕，同時心肌組織內(nèi)氧自由基水平也顯著下降；Bernardi等[13]聯(lián)合使用N-乙酰半胱氨酸和DFO也明顯降低了腎缺血再灌注模型中大鼠的血清肌酐以及組織內(nèi)ROS產(chǎn)物水平，同時腎臟組織的病理損傷也明顯減輕。因此，我們考慮選用在冷保存期間添加DFO，從而螯合超載的游離鐵離子，以達到進一步減輕離體肝臟冷缺血損害的目的。

我們的前期已通過細胞學試驗發(fā)現(xiàn)，在冷保存期間添加DFO可以減少冷缺血狀態(tài)下的肝細胞凋亡[4]。在本實驗中，我們采用能更好模擬臨床過程的動物實驗，進一步證實了DFO對離體保存的肝臟供體具有積極的保護作用。同時研究還發(fā)現(xiàn)，在添加DFO的實驗組中，肝臟組織的MDA含量也明顯降低，這提示DFO的保護效能極有可能是通過絡合超載鐵離子，從而減少ROS產(chǎn)物生成而引起。同時，DFO的保護效果有劑量依賴性傾向，與低濃度組比較，高～中濃度組中，保存供肝的損傷情況明顯減輕。但在高～中濃度組間，各研究指標比較無統(tǒng)計學差異，我們推測可能是由于DFO是水溶性鐵絡合劑，其對細胞膜滲透能力有限，在DFO在細胞外達到到一定濃度后，難以繼續(xù)進入細胞內(nèi)，從而導致胞內(nèi)DFO水平不能繼續(xù)增加所導致[14]。因此，在接下來的研究中，我們擬考慮選用或聯(lián)合使用對細胞膜滲透能力更強的脂溶性的鐵螯合劑，以進一步增強對肝細胞內(nèi)游離Fe3+的絡合作用，從而更好的改善肝臟組織的冷保存效果。

綜上，本研究模擬臨床肝臟冷保存過程，探討了去鐵胺對肝臟冷缺血損傷的保護作用及機制，該發(fā)現(xiàn)為繼續(xù)提高肝臟的冷保存效果提供了新的思路。但本研究也發(fā)現(xiàn)，盡管去鐵胺保護作用有劑量依賴性傾向，但是在達到一定濃度后，并不能顯著增加其保護效果，因此在接下來的研究中，在選擇更為適宜的鐵螯合劑或是多種鐵螯合劑的聯(lián)合應用是我們下一步的研究方向。

1.Latchana N,Peck JR,Whitson BA,et al.Preservation solutions used during abdominal transplantation:Current status and outcomes.World J Transplant[J].2015,5（4）:154-164.

2.Liu Q,Bruns H,Schultze D,et al.HTK-N,a modified HTK solution,decreases preservation injury in a model of microsteatotic rat liver transplantation[J].Langenbecks Arch Surg，2012，397（8）:1323-1331.

3.Jiménez-Castro MB,Gracia-Sancho J,Peralta C.Brain death and marginal grafts in liver transplantation[J].Cell Death Dis,2015,4（6）:e1777.

4.蘇松,向證文,賀凱,等.鐵離子螯合劑對肝細胞冷缺血再灌注損傷的保護機制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志, 2014,31（24）:21-25.

5.賀凱,蘇松,鄒慶偉,等.大鼠“二袖套法”原位肝移植模型的手術體會[J].中國醫(yī)藥導報,2010,7（26）:39-41.

6.Wu S,Wohlschlaeger J,de Groot H,et al.Evaluation of a modified HTK solution containing the new iron chelator LK 614 in an isolated rat liver perfusion model[J].J Invest Surg,2009,22（5）:340-347.

7.Rauen U,de Groot H.Mammalian cell injury induced by hypothermia-the emerging role for reactive oxygen species [J].BiolChem,2002,383:477-488.

8.Latchana N,Peck JR,Whitson BA,et al.Preservation solutions used during abdominal transplantation:Current sta-tus and outcomes[J].World J Transplant，2015,5（4）: 154-164.

9.Cameron AM,Barandiaran Cornejo JF.Organ preservation review:history of organ preservation[J].Curr Opin Organ Transplant，2015,20（2）:146-151.

10.Rauen,U,de Groot,H.New insights into the cellular and molecular mechanisms of cold storage injury[J].J Investig Med,2004,52（5）:299-309.

11.宋建生，夏先明.肝臟缺血再灌注損傷機制的研究進展.瀘州醫(yī)學院學報，2013,36（4）:409-412.

12.Chan W,Taylor AJ,Ellims AH,et al.Effect of iron chelation on myocardial infarct size and oxidative stress in ST-elevation-myocardial infarction[J].Circ Cardiovasc Interv,2012,5（2）:270-278.

13.Bernardi RM,Constantino L,Machado RA,et al.N-acetylcysteine and deferrioxamine protects against acute renal failure induced by ischemia/reperfusion in rats[J].Rev Bras Ter Intensiva[J].2012,24（3）:219-223.

14.Radovits T,Lin LN,Zotkina J,et al.Endothelial dysfunction after long-term cold storage in HTK organ preservation solutions:effects of iron chelators and N-alphaacetyl-L-histidine[J].J Heart Lung Transplant,2008,27（2）:208-216.

（2016-05-13收稿）

Desferrioxamine in HTK solution attenuates the cold ischemic injury of preserved rat liver graft

Su Song，Song Jiansheng，Luo De，Liu Jiang，He Kai，Li Bo，Xia Xiangming
Department of Hepatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou, Sichuan Province，646000,China

Objective：To investigate the effect of Desferrioxamine（DFO）on isolated rat liver graft in cold preservation.Methods：Eighty SD rats were divided into four groups,which were HTK preservation group（HTK group）,25 umol/L DFO group（D25 group）,50 umol/L DFO group（D50 group）,and 100 umol/L DFO group（D100 group）.All grafts were subjected to 24 hours cold preservation at 4℃with the aforementioned 4 solutions separately.Liver enzymes（ALT,AST,LDH）,hepatic histological damage,Typan blue perfusion,apoptosis and malondialdehyde（MDA）levels were analyzed.Results：Compared with HTK group,the grafts in D50 group and D100 group showed significant lower levels of enzymes,shorter Typan blue perfusion time,lower rate of apoptosis and lower MDA levels（allP＜0.05）.Furthermore,compared with HTK group,the samples in D100 group showed significant lower histological damage score（P＜0.05）.No statistical significance of any variables was found in DFO group when compared to the HTK group.Conclusion：DFO in HTK solution attenuates the cold ischemia injury during cold preservation,which may be attributed to its anti-oxidative and anti-apoptotic effects.

Iron chelator;Liver transplantation;Organ preservation;Ischemia injury;Free radical

R657.3

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.010

*四川省人事及社會保障廳歸國留學人才擇優(yōu)資助項目（2010-1021）;四川省科技廳科研資助項目（2014JY0068）

蘇松（1978-），男，博士，副主任醫(yī)師

夏先明（1961-）,男，碩士，主任醫(yī)師。E-mail:13882778554@163.com