黃文俊，李濤，范學(xué)慧，余奕言，楊艷，曾曉榮，譚曉秋

（西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所、醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川瀘州646000）

論著

Flag和GFP雙標(biāo)記的SK2通道表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和序列分析*

黃文俊，李濤，范學(xué)慧，余奕言，楊艷，曾曉榮，譚曉秋

（西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所、醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川瀘州646000）

目的：采用Overlapping PCR（重疊PCR）法進(jìn)行人源SK2通道Flag和GFP融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，為下一步胞外運(yùn)用Flag抗體進(jìn)行SK2通道的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。方法：在既往克隆的人SK2通道基因的表達(dá)質(zhì)粒pIRES-SK2的基礎(chǔ)上，采用重疊PCR法構(gòu)建Flag和GFP雙標(biāo)簽標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-Flag-SK2（簡(jiǎn)寫為Flag-SK2-GFP）。結(jié)果：構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒Flag標(biāo)簽插入SK2通道的S1-S2胞外環(huán)區(qū)域，GFP標(biāo)簽連接SK2通道胞內(nèi)的C末端，通過酶切、測(cè)序等證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)論：成功構(gòu)建人心房肌SK2通道基因表達(dá)質(zhì)粒Flag-SK2-GFP，為下一步研究SK2通道轉(zhuǎn)運(yùn)過程及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

小電導(dǎo)鈣激活鉀通道；重疊PCR；基因工程

近年來，小電導(dǎo)鈣激活鉀通道（small conductance calcium activated potassium channels,SK2）在人心房肌上被發(fā)現(xiàn)并且證明其在心肌細(xì)胞的復(fù)極化過程中扮演重要的角色[1-3]。由于SK2通道在心房肌的表達(dá)原高于心室肌，因此，尋找針對(duì)SK2通道調(diào)控的靶點(diǎn)將為房性心律失常（如心房顫動(dòng)）的治療提供新的思路[4-7]。對(duì)SK2通道的深入研究，尤其是調(diào)控機(jī)制的研究就顯得尤為重要。目前異源表達(dá)表達(dá)離子通道在工具細(xì)胞如HEK293，CHO等已成為研究離子通道功能活動(dòng)和藥物篩選的主要方法之一，本研究旨在采用重疊PCR方法進(jìn)行含標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，為下一步研究SK2通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程以及功能活性奠定基礎(chǔ)。

圖1 重疊PCR構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Flag-SK2示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

主要試劑包括膠回收試劑盒（北京天根）、質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根）、PCR反應(yīng)試劑（寶生物生物科技）、限制性內(nèi)切酶（寶生物生物科技）、瓊脂糖粉（Biowest公司）、LB培養(yǎng)基（上海生工），大腸桿菌DH5α（碧云天）、DNA Marker（碧云天）和連接反應(yīng)試劑（Promega公司），其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。主要實(shí)驗(yàn)儀器有PCR儀（ABI公司）、紫外分光光度儀（Nanodrop公司）和離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)旨在已有編碼人心肌SK2通道的表達(dá)質(zhì)粒pIRES-SK2和pEGFP-N3的基礎(chǔ)上，構(gòu)建Flag和GFP雙標(biāo)簽標(biāo)記的SK2通道表達(dá)質(zhì)粒Flag-SK2-GFP，其中Flag標(biāo)簽的氨基酸序列為：DYKDDDDK，擬將其插入SK2通道S1與S2跨膜序列的胞外側(cè)連接處，插入后的氨基酸序列為：SNPIESDYKDDDDKCQNFYKDF。構(gòu)建Flag標(biāo)簽的目的是用于檢測(cè)SK2通道蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。GFP標(biāo)簽連接于SK2通道胞內(nèi)的C末端，用于檢測(cè)SK2通道蛋白在細(xì)胞整體的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)的基因克隆在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pIRES-SK2的基礎(chǔ)上[8]，進(jìn)行重疊PCR法和酶切連接完成的。引物序列見表1所示，引物由Invitrogen公司合成。

Flag標(biāo)簽插入pEGFP-N3-Flag-SK2的具體步驟和實(shí)驗(yàn)流程見圖1所示：①將Flag（紅色）插入到含有酶切位點(diǎn)Hind III和BamH I的表達(dá)質(zhì)粒pIRES-SK2（藍(lán)色）S1與S2胞外環(huán)的位點(diǎn)（圖1A）。以質(zhì)粒pIRES-SK2為模板，分段擴(kuò)增包含有部分SK2通道和Flag標(biāo)簽的片段1和片段2（圖1B）；②以片段1和片段2的混合片段為模板，使用片段1的上游引物和片段2的下游引物，進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)得到包含有Flag的SK2通道片段3（圖1C）；③選擇酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ，采用雙酶切法酶切質(zhì)粒pEGFP-N3和片段3后，然后進(jìn)行T4連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化就得到含有Flag標(biāo)簽的SK2通道表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-Flag-SK2（圖1D）。

首先以pIRES-SK2質(zhì)粒為模板，利用表1中引物分別擴(kuò)增得到產(chǎn)物片段1和片段2（圖2A）。再以片段1和片段2為模板，利用片段1的上游引物和片段2下游引物PCR擴(kuò)增得到含F(xiàn)lag標(biāo)簽序列的片段3產(chǎn)物（圖2B）。利用HindⅢ和BamHⅠ對(duì)片段3和pEGFP-N3進(jìn)行雙酶切，繼而進(jìn)行連接反應(yīng)，從而可以將含有Flag標(biāo)簽序列的SK2序列克隆到pEGFP-N3載體，繼而得到含有Flag和GFP雙標(biāo)記的SK2表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-Flag-SK2（圖3A）。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

PCR反應(yīng)體系、酶切反應(yīng)體系和連接反應(yīng)體系都是根據(jù)試劑公司推薦的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。PCR反應(yīng)的退火溫度根據(jù)引物的Tm降低2℃設(shè)置，酶切反應(yīng)為37℃水浴過夜，連接反應(yīng)為16℃水浴過夜。轉(zhuǎn)化步驟按照碧云天大腸桿菌DH5α說明書進(jìn)行。

表1 重疊PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 Flag標(biāo)簽插入質(zhì)粒pIRES-SK2以及pEGFPN3-Flag-SK2質(zhì)粒酶切鑒定

使用PCR分別得到含有部分SK2通道和Flag標(biāo)簽的片段1和片段2，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2A所示，目標(biāo)條帶位置與預(yù)測(cè)大小基本一致。然后以這兩個(gè)片段為模板，使用重疊PCR方法得到片段3后，F(xiàn)lag標(biāo)簽插入SK2通道S1-S2之間，同時(shí)還含有BamHⅠ與HindⅢ酶切位點(diǎn)，片段3條帶大小約2 000 bp，電泳條帶位置符合預(yù)期（圖3B）。質(zhì)粒pEGFP-N3雙酶切后，與片段3進(jìn)行連接反應(yīng)，得到含有Flag標(biāo)簽的質(zhì)粒pEGFP-N3-Flag-SK2。得到的質(zhì)粒首先經(jīng)過BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2C所示，經(jīng)BamHⅠ與HindⅢ雙酶切之后能夠得到一約2 000 bp左右的目的條帶。

圖2 重疊PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 Flag-SK2-GFP質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示：Flag插入SK2通道的S1-S2胞外環(huán)（圖3B），GFP標(biāo)簽連接與SK2通道的胞內(nèi)C末端（圖3C）。

圖3 Flag-SK2-GFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖和測(cè)序結(jié)果

3 討論

由于SK2通道在心房表達(dá)的特異性，同時(shí)又將胞內(nèi)鈣與膜電位相偶聯(lián)，因此，SK2通道被認(rèn)為房性心律失常的潛在治療靶點(diǎn)[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SK2通道在心房快速起搏的家兔心房肌表達(dá)量增加，更為重要的是心房快速起搏促進(jìn)了SK2通道蛋白由胞漿向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[10]。這提示我們，SK2通道轉(zhuǎn)運(yùn)過程在心房快速起搏（或房顫）是出現(xiàn)了異常，但是其深入機(jī)制未明。離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能調(diào)節(jié)可能為疾?。ㄐ穆墒С＃┑闹委熖峁┧悸穂11-12]。目前離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究的策略較少，為此，本研究構(gòu)建Flag與GFP雙標(biāo)記的SK2通道表達(dá)質(zhì)粒Flag-SK2-GFP，其中Flag插于胞外環(huán)S1-S2之間，GFP連接于C末端。插入GFP標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì)是可以直接使用激光共聚焦顯微鏡和活細(xì)胞工作站、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的觀察活細(xì)胞SK2通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和調(diào)控機(jī)制。插入Flag標(biāo)簽是基于目前直接針對(duì)SK2通道蛋白胞外抗體的特異性和親和力較差，不能準(zhǔn)確反映通道蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。而針對(duì)Flag標(biāo)簽抗體的特異性和親和力要高很多，因而更能準(zhǔn)確的研究SK2通道在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。由于僅僅只有離子通道在細(xì)胞膜上表達(dá)的高低是不能準(zhǔn)確反映通道蛋白在向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程是促進(jìn)還是抑制，結(jié)合GFP熒光強(qiáng)度代表SK2通道的總體表達(dá)水平，可以使用流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微成像技術(shù)等準(zhǔn)確地研究細(xì)胞膜上通道蛋白與整體表達(dá)水平之間的比例關(guān)系，從而更加準(zhǔn)確反映通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。因此，采用Flag標(biāo)簽抗體研究蛋白定位和表達(dá)時(shí)，比直接使用目的蛋白的抗體陽性率、準(zhǔn)確性均有明顯提高，同時(shí)還能降低研究的科研成本，是一項(xiàng)可以值得推廣的研究策略。而采用該質(zhì)粒，結(jié)合配套的熒光顯微鏡膜片鉗系統(tǒng)，研究SK2通道的電生理特性及其藥物作用機(jī)制，大大提高實(shí)驗(yàn)效率并簡(jiǎn)化篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆的過程。

此外，本實(shí)驗(yàn)利用的重疊PCR技術(shù)具有不需要限制性內(nèi)切酶的消化和連接酶的處理的特點(diǎn)，可以很好的用于在融合基因的構(gòu)建、長(zhǎng)片段基因的擴(kuò)增等方面。

1.Y.Xu,D.Tuteja,Z.Zhang,et al.Molecular identification and functional roles of a Ca2+-activated K+channel in human and mouse hearts[J].J Biol Chem,2003,278（49）: 49085-94.

2.L.Skibsbye,C.Poulet,J.G.Diness,et al.Small-conductance calcium-activated potassium（SK）channels contribute to action potential repolarization in human atria[J]. Cardiovasc Res,2014,103（1）:156-67.

3.S.Mahida.Expanding role of SK channels in cardiac electrophysiology[J].Heart Rhythm,2014,11（7）:1233-8.

4.J.G.Diness,U.S.Sorensen,J.D.Nissen,et al.Inhibition of small-conductance Ca2+-activated K+channels terminates and protects against atrial fibrillation[J].Circ Arrhythm Electrophysiol,2010,3（4）:380-90.

5.X.Y.Qi,J.D.Diness,B.J.Brundel,et al.Role of smallconductance calcium-activated potassium channels in atrial electrophysiology and fibrillation in the dog[J].Circulation,2014,129（4）:430-40.

6.C.H.Hsueh,P.C.Chang,Y.C.Hsieh,et al.Proarrhythmic effect of blocking the small conductance calcium activated potassium channel in isolated canine left atrium[J]. Heart Rhythm,2013,10（6）:891-8.

7.X.D.Zhang,D.K.Lieu,N.Chiamvimonvat.Smallconductance Ca2+-activated K+channels and cardiacarrhythmias[J].Heart Rhythm,2015,12（8）:1845-1851.

8.譚曉秋,陳桂蘭,李濤,等.重疊PCR法構(gòu)建人心房肌SK2（KCNN2）基因表達(dá)質(zhì)粒及鑒定和序列分析[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2012,28（4）:381-384.

9.J.G.Diness,B.H.Bentzen,U.S.S?rensen,et al.Role of Calcium-activated Potassium Channels in Atrial Fibrillation Pathophysiology and Therapy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2015,66（5）:441-8.

10.N.Ozgen,W.Dun,E.A.Sosunov,et al.Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2 channels to membrane sites[J]. Cardiovasc Res,2007,75（4）:758-69.

11.S.M.Schumacher，J.R.Martens.Ion channel trafficking:a new therapeutic horizon for atrial fibrillation[J].Heart Rhythm,2010.7（9）:1309-15.

12.J.W.Smyth，R.M.Shaw.Forward trafficking of ion channels: what theclinician needs to know[J].Heart Rhythm,2010，7（8）:1135-1140.

（2016-04-23收稿）

Construction of SK2 channel expression plasmid with double labeling of Flag and GFP

Huang Wenjun,Li Tao,Fan Xuehui,Yu Yiyan,Yang Yang,Zen Xiaorong,Tan Xiaoqiu
Institute of Cardiovascular Research,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000, China；the Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education；Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease

Objective：This study aimed to construct a SK2 channel plasmid with two tags using overlapping PCR to provide the easiness to track the transportation of the channel protein.Methods：Based on human SK2 channel expression plasmid pIRES-SK2,the full length of SK2 cDNA with a Flag insertion was amplified using overlapping PCR method,which was then subcloned into pEGFP-N3 vector.The double-tagged expression plasmid,pEGFP-N3-Flag-SK2（Flag-SK2-GFP）was confirmed by DNA sequencing.Results：A Flag tag was inserted in-between the S1-S2 extracellular loops of SK2 channel whose C-terminus was fused in-frame to GFP. The constructed plasmid was further confirmed by DNA sequencing.Conclusion：The expression plasmid Flag-SK2-GFP was constructed successfully with overlapping PCR.

Small conductance calcium activated potassium channels;Overlapping PCR;Gene cloning

R972.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.009

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NO：31300948；81670310），四川省科技廳支撐計(jì)劃（2011FZ0106），瀘州市-四川醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合資助項(xiàng)目（2015LZCYD-S03）

黃文?。?983-），女，助理研究員，碩士

譚曉秋（1981-），男，副研究員。E-mail：tanxiaogiu1981@163.com