周偉，李妙齡，范學(xué)慧，李濤，王笑宇，于風(fēng)旭

（西南醫(yī)科大學(xué)：1附屬醫(yī)院胸心外科；2心肌電生理學(xué)研究室，四川瀘州646000）

人心房成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定*

周偉1，李妙齡2，范學(xué)慧2，李濤2，王笑宇2，于風(fēng)旭1

（西南醫(yī)科大學(xué)：1附屬醫(yī)院胸心外科；2心肌電生理學(xué)研究室，四川瀘州646000）

目的：探索和建立適用于人心房成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定的可靠的技術(shù)方法。方法：采用組織塊貼壁法對(duì)人心房成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)及傳代。并在倒置相差顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞的生長情況，利用波形蛋白免疫熒光染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果：在倒置相差顯微鏡下人心房成纖維細(xì)胞呈長梭形、多角形，胞質(zhì)透明，胞核2~3個(gè)，無自發(fā)性搏動(dòng)，細(xì)胞免疫熒光檢測波形蛋白表達(dá)陽性。結(jié)論：建立了穩(wěn)定培養(yǎng)人心房成纖維細(xì)胞的方法，為研究心肌纖維化相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理提供了充足的種子細(xì)胞。

成纖維細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞鑒定

心房顫動(dòng)是臨床實(shí)踐中最為常見的心律失常之一。目前研究表明，心房顫動(dòng)的病理生理機(jī)制主要包括結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，而心房纖維化導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)重構(gòu)是永久性房顫發(fā)生及持續(xù)的底物，在臨床中也發(fā)現(xiàn)心房纖維化是房顫發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要特點(diǎn)[1]。由于對(duì)心房纖維化的在體研究受諸多條件的限制，因此，建立一種便捷、安全的人心房成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，對(duì)研究心房纖維化的特點(diǎn)及與房顫發(fā)生關(guān)系有重要意義。目前，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行人心房成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)方法不一，主要包括組織塊貼壁法和酶消化法[2]。酶消化法主要是使用胰蛋白酶與膠原蛋白酶聯(lián)合消化組織塊后采用差速貼壁法分離得到心房成纖維細(xì)胞，此法雖獲取細(xì)胞時(shí)間短，但是步驟多，過程復(fù)雜，操作中易污染，且該法比組織塊貼壁培養(yǎng)法技術(shù)要求高，費(fèi)用昂貴，同時(shí)還存在對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷和化學(xué)污染[3]。因此，本研究以心臟手術(shù)患者右心耳組織為材料，通過優(yōu)化組織塊貼壁法培養(yǎng)人心房成纖維細(xì)胞，且已獲得成功。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 心房肌標(biāo)本來源

經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意后，實(shí)驗(yàn)所獲人心房肌取自于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科體外循環(huán)手術(shù)患者。

1.1.2 主要試劑

DME/F-12 1∶1（1x）高糖培養(yǎng)基（hyclone公司），胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），膠原酶Ⅱ（worthington公司），山羊抗兔波形蛋白（vimentin），兔抗山羊IgG及DaPi（Sigma公司），平衡鹽溶液（PBS），青鏈霉素（100X）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

從西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸心外科體外循環(huán)心臟手術(shù)患者獲取右心耳組織約40 mg，置于盛有無菌PBS的EP管中，將EP管移入裝有冰的保溫杯中迅速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)。在超凈操作臺(tái)上，將右心耳組織塊移入裝有PBS的3 cm培養(yǎng)皿中。用無菌眼科剪和鑷子去除外膜和脂肪，將組織塊剪成約1 mm3大小均勻小塊。PBS反復(fù)沖洗組織塊，至無血色為止，去除多余的PBS。將剪成小塊的組織塊移入裝有1 mL DMEM培養(yǎng)基的EP管中，用眼科剪盡量剪碎組織塊，然后將組織碎塊吸入到無菌玻璃瓶。用DMEM配制0.1%膠原酶Ⅱ溶液10 mL，過濾后備用。取5 mL酶液于有組織塊的玻璃瓶中，37℃水浴箱中消化10 min，然后去除上清液。再加入剩下的5 mL酶溶液，繼續(xù)37℃水浴箱中消化10 min后離心（1 000 r/m，5 min），去除上清液。加入10 mL含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，吹打混勻后用吸管將組織碎塊懸浮液吸入到10 cm的培養(yǎng)皿，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長。前4 d避免大幅度移動(dòng)培養(yǎng)皿，以免影響組織塊貼壁。如若培養(yǎng)基變渾濁，說明可能存在細(xì)菌污染，要將培養(yǎng)皿及時(shí)拿出培養(yǎng)箱，防止繼續(xù)污染其他細(xì)胞。4 d后可以在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周邊爬出少許成纖維細(xì)胞，此后，需每天觀察培養(yǎng)基顏色變化，如若變黃，要及時(shí)更換培養(yǎng)基。

1.2.2 傳代培養(yǎng)

在原代培養(yǎng)2周左右，在倒置顯微鏡下可觀察到成纖維細(xì)胞幾乎已長滿培養(yǎng)皿的90%以上，此時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。去除原培養(yǎng)基，加入5 mL PBS清洗兩次后，加2 mL 0.1%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱消化約2 min后，在倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓后，立即加入3 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，然后離心（1 000 r/m，5 min），去除上清液，加含20%胎牛血清的DMEM，按1:2的比例分別接種到一新的10 cm培養(yǎng)皿，再將其放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 成纖維細(xì)胞的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

可直接在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光染色鑒定

在傳代培養(yǎng)時(shí)，取稀釋后的細(xì)胞懸液接種到3 cm培養(yǎng)皿的載玻片上，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)1～2 d取出玻片，用0.01 mol/L PBS液清洗3次，每次3～5 min。去除PBS液，再加入1 mL 40 g/L多聚甲醛（4%）固定5～10 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min。去除液體后加入1 mL 0.5%Triton×100室溫封閉30 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min，洗滌時(shí)可用搖床輕微搖動(dòng)。去除液體后加入1 mL 1%BSA室溫封閉1 h，盡量去除多余液體，取1 mL 1∶300的稀釋一抗（兔波形蛋白vimentin）加入到接種有成纖維細(xì)胞的載玻片上，對(duì)照組滴加PBS，4℃過夜。第二天用PBS液清洗3次，每次5～10 min，去除液體后加1 mL 1∶100稀釋二抗（抗兔）室溫避光孵育1 h，PBS液清洗3次，每次5～10 min。加入500 uL DAPI染細(xì)胞核，室溫避光孵育5 min，PBS液清洗3次，每次5～10 min。滴一滴抗熒光淬滅封片于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的玻片，使細(xì)胞接觸封片液封片，便可于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

心房成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)可見黑色組織塊，4～5 d細(xì)胞開始從組織塊邊緣爬出，呈放射狀，排列較紊亂，有重疊現(xiàn)象，此后細(xì)胞數(shù)明顯增多，14 d左右可長滿培養(yǎng)皿（圖1），可見細(xì)胞體積較大，呈梭形，細(xì)胞質(zhì)透明，胞體較大，胞核明顯，呈扁圓形，常含2～3個(gè)核，傳代細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞呈長梭形、多角形，無搏動(dòng)（圖2）。

圖1 不同倍數(shù)下的原代成纖維細(xì)胞（A：4×B：10×C：20×D：40×）

圖2 不同倍數(shù)下傳代成纖維細(xì)胞（A：4×B：10×C：20×D：40×）

2.2 細(xì)胞免疫熒光染色

將傳代培養(yǎng)貼壁于蓋玻片上的人心房成纖維細(xì)胞行波形蛋白熒光染色和DAPI細(xì)胞核染色后，在熒光顯微鏡下可觀察到成纖維細(xì)胞波形蛋白抗原表達(dá)陽性，在藍(lán)色細(xì)胞核邊緣可見紅色的細(xì)胞漿呈絲狀改變，純度大于95%（圖3A），對(duì)照組用PBS代替一抗，僅加二抗,熒光顯微鏡下細(xì)胞僅能見藍(lán)色細(xì)胞核（圖3B）。

圖3 成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫反應(yīng)（20×）

3 討論

心房顫動(dòng)是臨床上最為常見的心律失常之一。研究表明，心房纖維化導(dǎo)致的心房重構(gòu)是心房顫動(dòng)發(fā)生和持續(xù)的重要生理病理機(jī)制之一。纖維化表現(xiàn)為心肌成纖維型細(xì)胞合成的大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的堆積（主要為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原），從而引起心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)[4]。心肌成纖維細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化是心房發(fā)生纖維化的基礎(chǔ)，直接從人心房中獲取的成纖維細(xì)胞在研究房顫與心肌纖維化的關(guān)系與在動(dòng)物模型上的研究相比，其臨床價(jià)值更高。

目前國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的技術(shù)方法主要包括酶消化法和組織塊貼壁法，前者由于過程復(fù)雜，操作繁瑣，且易受胰蛋白酶的濃度，作用時(shí)間及溫度等多方面的影響，分離得到的成纖維細(xì)胞也易受到心肌細(xì)胞的影響，純度不高。傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法，未經(jīng)酶消化，組織塊貼壁困難，心肌成纖維細(xì)胞的存活率不高，細(xì)胞生長極其緩慢，原代培養(yǎng)耗時(shí)長，易引起污染，且細(xì)胞生長密度低，不易傳代培養(yǎng)。因此，本研究從多個(gè)環(huán)節(jié)優(yōu)化組織塊貼壁培養(yǎng)法，貼壁較快，體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞存活率在90%以上，細(xì)胞生長密度較高，容易傳代培養(yǎng)。本培養(yǎng)方法的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①為避免組織塊或細(xì)胞受到細(xì)菌與真菌的污染，在培養(yǎng)基中添加青鏈霉素和兩性霉素B，提高了細(xì)胞的存活率；②在前期培養(yǎng)階段，發(fā)現(xiàn)普通的DMEM配制的10%胎牛血清，細(xì)胞生長緩慢，后將其換成DME/F-12 1∶1（1X），并提高胎牛血清的濃度到20%，細(xì)胞生長速度明顯增快，大大縮短了原代培養(yǎng)時(shí)間；③優(yōu)化了組織塊貼壁，Ⅱ型膠原酶特異作用于結(jié)締組織的膠原，對(duì)膠原和細(xì)胞外基質(zhì)有很好的消化作用，減輕了對(duì)細(xì)胞的損傷程度[5]。本研究使用0.1%Ⅱ型膠原酶消化組織塊，第一次消化后靜置2 min去除上清液，即將消化下來的膠原蛋白及結(jié)締組織去除，使組織塊更易貼壁，培養(yǎng)過程中成纖維細(xì)胞更易于從組織塊內(nèi)遷出。

本研究方法可獲得純度較高的成纖維細(xì)胞，該類細(xì)胞從形態(tài)學(xué)特征上看，成纖維細(xì)胞呈有突起的梭形或多角形細(xì)胞，平行排列或放射狀伸開，界限清楚，與張建成[6]等人培養(yǎng)的人心房成纖維細(xì)胞形態(tài)相似。波形蛋白（vimentin）是存在于成纖維細(xì)胞和胚胎間充質(zhì)細(xì)胞中間絲的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要對(duì)細(xì)胞核起支持作用，穩(wěn)定核的位置，與心肌細(xì)胞的橋連蛋白有明顯差異，波形蛋白為成纖維細(xì)胞的相對(duì)特異性標(biāo)志[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞免疫熒光染色顯示波形蛋白強(qiáng)陽性，且純度大于95%，可證實(shí)其為成纖維細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)以心臟手術(shù)患者右心耳為材料來源，從形態(tài)學(xué)及細(xì)胞免疫熒光檢測波形蛋白兩方面證實(shí)了所培養(yǎng)的為心房成纖維細(xì)胞，建立了安全、穩(wěn)定、便捷的人心房成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步研究心肌纖維化的特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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（2016-01-08收稿）

Isolation and culture of human atrial fibroblasts cells in vitro

Zhou Wei1，Li Miao ling2，F(xiàn)an Xuehui2，Li Tao2，Wang Xiaoyu2，Yu Fengxu11Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University;2Kgy Laboratory of Medical Electrophysioloy of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000,China

Objective：To establish a reliable method for isolation and culturing of human atrial fibroblasts. Methods：Hu man atrial fibroblasts were cultured by tissue block method in vitro,an inverted phase contrast microscope was used to observe the morphology,and vimentin was immuno-fluorescence stained to identify the fibroblasts.Results：Human atrial fibroblasts were long spindle shaped or polygonal with transparent cytoplasm,2～3 nucleuses,and no spontaneous beating;immuno-fluorescence staining showed positive for vimentin.Conclusion：A stable method of fibroblasts isolation and culturing was established,which provides a reliable source of cells for studying myocardial fibrosis related diseases.

Fibroblast;Cell culture;Cell identification

R541.7+5

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.008

*醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（KeyME-2014-02）；四川省科技廳基金（2011JY0065）資助；瀘州市-西南醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合課題（2015LZCYD-S03（3/7）

周偉（1992-），男，碩士生

于風(fēng)旭（1976-），男，博士，副教授。E-mail：yuluchuan@163.com