聶毅磊 陳宏 羅立津 賈緯 陳星偉

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

一種浸礦混合菌種的篩選、鑒定及浸礦的研究

聶毅磊 陳宏 羅立津 賈緯 陳星偉

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

旨在從某低品位硫化銅礦酸性礦坑水中分離獲得浸礦效果優(yōu)良的細菌，同時對細菌的浸礦行為進行初步的研究。采集福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水樣品，9K培養(yǎng)基富集獲得混合菌種FIM-201304。利用9K固體平板，從混合菌FIM-201304中分離獲得優(yōu)勢浸礦菌D-1。應用高通量Illumina Miseq測序技術分析混合菌FIM-201304 的群落結構。通過表型特征和16S rRNA基因序列分析鑒定菌株D-1。采用搖瓶培養(yǎng)對比研究混合菌和單菌對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的浸出效果。結果顯示，高通量測序技術分析結果表明，混合菌FIM-201304 的優(yōu)勢菌是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A. f errooxidans）（豐度占比85.02％）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas sp.）（豐度占比10.07％）、嗜酸異養(yǎng)菌（Acidiphilium acidophilum，A.acidophilum）（豐度占比1.30％）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）（豐度占比1.21％）。表型特征和16S rRNA 基因序列分析確定菌株D-1屬于氧化亞鐵硫桿菌。搖瓶實驗結果表明，浸出反應20 d后，接種混合菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別為65％和56％，相同條件下，接種單菌的浸出體系中銅、鎳的浸出率為41％和36％，接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％?；旌暇鷮ΦV石的浸出效果顯著優(yōu)于單菌。異養(yǎng)菌促進了自養(yǎng)菌對礦石中金屬元素的浸出。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；生物浸出；混合菌；高通量測序；16S rRNA 基因

生物濕法冶金是利用微生物對礦石進行直接、間接或者兩者共同作用浸出礦石中有用金屬的一種工藝。與傳統(tǒng)冶金技術相比，生物冶金具有成本低、工藝簡單、對環(huán)境友好等優(yōu)點，尤其對于采用傳統(tǒng)的冶金方法難以處理的低品位礦石、原礦和尾礦等，生物冶金更顯其獨特之處［1-5］。生物冶金的核心技術是篩選獲得高效、適應能力強、選擇性好的微生物菌種。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A. ferrooxidans）被認為是酸性環(huán)境中浸礦的主導菌種。但該類微生物生長緩慢，這也是導致生物浸出周期長和浸出效率低的主要原因［6］。研究表明，浸礦微生物的一些代謝產物對其自身的生長具有抑制作用［7，8］。若浸礦體系中含有以有機底物作為能源物質的異養(yǎng)菌，例如嗜酸異養(yǎng)菌（Acidiphilium acidophilum，A. acidophilum），可以在一定程度上解除代謝產物對自養(yǎng)菌的抑制作用，有利于主要自養(yǎng)浸礦菌的生長，充分發(fā)揮其浸礦作用，提高浸出率［9，10］。像這種兩類或多類微生物在浸礦過程中相互作用，更好地進行單類種群不能完成或不能高效完成的物質轉化，增強各自的生長代謝活動，從而提高金屬浸出速率和浸出率的微生物作用機制稱為協(xié)同作用［11］。微生物協(xié)同作用在生物冶金中發(fā)揮著重要的作用［12，13］。

本研究從福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水樣品中富集到一種浸礦混合菌種FIM-201301和一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌D-1，分析混合菌種的優(yōu)勢菌，旨在為開發(fā)利用以氧化亞鐵硫桿菌為主的浸礦混合菌種的應用及豐富浸礦微生物協(xié)同作用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基 9K液體培養(yǎng)基：A液：（NH4）2SO43.0 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，800 mL去離子水溶解，H2SO4調節(jié)pH至2.0，121℃高壓滅菌 20 min；B液：FeSO4·7H2O 44.78 g，去離子水200 mL溶解，H2SO4調節(jié)pH至2.0，孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌。將滅菌后的A液與B液混勻后分裝待用。

9K固體培養(yǎng)基：A液：（NH4）2SO41.5 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，KSCN 15.4 g，450 mL去離子水溶解，H2SO4調節(jié)pH至3.0，121℃高壓滅菌20 min；B液：FeSO4·7H2O 22.5 g，去離子水50 mL溶解，H2SO4調節(jié)pH至2.0，孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌；C液：瓊脂糖 10 g，500 mL去離子水溶解，121℃高壓滅菌20 min。

待A液和C液冷卻到60-70℃時將A液、B液和C液混合均勻，迅速倒入培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中倒入10-15 mL，冷卻凝固后即成固體平板。

1.1.2礦石樣 實驗所用硫化銅礦石經過縮分、篩分、破碎與磨碎等流程，礦樣的粒度＜0.075 mm，主要礦物成分為黃銅礦、斑銅礦、黃鐵礦和方鉛礦，銅品位為0.47％。試樣化學組成成分見表1。

表1　硫化銅礦石化學組成分析結果

所用低品位硫化鎳礦為礦樣，礦樣的粒度＜0.075 mm，主要礦物成份為鎳磁黃鐵礦、鎳黃鐵礦和黃銅礦。鎳品位為0.73％。試樣化學組成成分見表2。

表2　硫化鎳礦石化學組成分析結果

1.1.3主要試劑和儀器 所用化學試劑均為分析純。ZHWY-3112B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。Miseq/E250高通量測序平臺（美國Illumina公司）。PCR擴增儀（S1000，Bio-Rad公司）。電泳儀（6003EN，上海申能博彩生物科技有限公司）。WFX-120原子吸收分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）。HH-4恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1樣品采集 細菌樣品采自福建某銅礦礦山酸性礦坑水，取樣時礦坑水溫度27℃，pH≈2.6。將礦坑水移至滅菌容器，容器上方留有一定的空氣，加入少量滅菌的硫酸亞鐵。置于-20℃冰箱保存。

1.2.2菌種分離 將10 mL采集的原始細菌樣品加入到盛有200 mL 9K液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃，180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液的顏色呈棕紅色，獲得第一代富集培養(yǎng)物。將第一代富集培養(yǎng)物轉代培養(yǎng)，方法同上，振蕩培養(yǎng)，但細菌接種量要逐代減少。轉代培養(yǎng)10次左右，獲得最終的富集培養(yǎng)物，此時，鏡檢觀察有大量運動細菌存在。取0.2 mL富集培養(yǎng)物劃線培養(yǎng)于9K固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)，挑取優(yōu)勢單菌落接入9K液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)，至培養(yǎng)液的顏色呈棕紅色，再劃線于平板固體培養(yǎng)，重復上述操作3次，分離到一株具有Fe2+氧化活性的嗜酸性細菌。將純化菌株保存于9K固體培養(yǎng)基中，待用。

1.2.3菌群總DNA的提取、擴增 取培養(yǎng)72 h的富集培養(yǎng)物，過濾去除黃鉀鐵礬，8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，收集菌體，用TENP緩沖液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.01 g/mL PVP，pH10）洗滌至基本無色，再用PBS緩沖液（8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于1 L水中，pH7.4）洗滌菌體2次，去除腐殖質；采用CTAB/NaCl法［14］提取菌群基因組DNA。步驟如下：腐殖質去除后的富集培養(yǎng)物中加入500 mL TE溶液（pH8.0），懸浮，加入60 μL 10％十二烷基硫酸鈉（SDS）和6 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混勻，60℃水浴1 h，加2.5 mL 5 mol/L NaCl 和2 mL CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10 min，以等體積的苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇、各抽提1次，異丙醇沉淀DNA，DNA溶于50 μL TE中，-20℃保存?zhèn)溆?。利?％瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R （5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對提取的DNA進行PCR擴增。將擴增后的DNA產物送至上海銳翌生物科技有限公司采用高通量Illumina MiSeq測序技術分析微生物群落結構。

1.2.4菌群高通量Illumina MiSeq測序技術分析

1.2.4.1測序與數(shù)據(jù)處理過濾 對16S rRNA基因V3-V4區(qū)序列進行測序，對rawreads按照以下標準進行過濾拼接，得到Long reads：（1）將ambiguous bases＞6的reads過濾掉；（2）將平均質量Q＜25的reads過濾掉；（3）對所有reads切除正反向引物序列；（4）將進行以上三步處理后的序列長度小于200 bp的reads過濾掉。

1.2.4.2OTU聚類 為便于下游物種多樣性分析，將Tags聚類為OTU（Operational Taxonomic Units）。首先把拼接的Tags中的singletons（對應reads只有一條的序列）過濾掉，利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU。

1.2.4.3物種注釋 從各個OTU中挑選出一條序列，作為該OTU的代表序列。將該代表序列，用RDP方法，與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫（GreenGenes，http：//greengenes.lbl.gov）進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類。歸類后，根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)，得到OTU豐度表。

1.2.4.4Profiling 在門、綱、目、科、屬水平，將每個注釋上的物種或OTU在不同樣品中的序列數(shù)整理在一張表格，形成profiling柱狀圖及統(tǒng)計表。

1.2.4.5單個樣品復雜度分析 利用QIIME軟件計算樣品的Alpha多樣性值，并利用已測得的16S rRNA序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得reads序列總數(shù)）reads時各Alpha指數(shù)的期望值，然后根據(jù)一組n值（一般為一組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列）與其相對應的Alpha指數(shù)的期望值做出稀釋曲線。

1.2.5純菌株DNA提取、擴增和分析 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液，離心收集菌體，同上述方法提取菌株基因組DNA和對提取的DNA進行PCR 擴增。將擴增后的DNA產物送至上海生物工程有限公司進行測序。用BLAST軟件與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的的16S rRNA序列進行比對分析。

1.2.6浸礦實驗 將分離獲得的浸礦混合菌種和單菌分別接入9K培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期。菌液在8 000 r/min下離心10 min，棄上清液得到沉淀，用pH2.0預先滅過菌的硫酸溶液洗滌沉淀，離心棄除上清液，如此反復操作3次，以達到去除菌液中Fe3+的目的，得到無鐵細胞懸液，在生物顯微鏡下進行計數(shù)，調整細胞濃度為1×109cell/mL。取9K培養(yǎng)基（不含F(xiàn)e2+）180 mL置于500 mL錐形瓶中，稱取20 g礦樣放入錐形瓶中，硫酸調節(jié)礦漿pH值，控制初始pH值在1.8-2.0。加入浸礦菌（單菌和混合菌）（5％接種量），30℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)。每個條件均包括3組平行實驗，并設無菌空白對照。浸出過程中的酸耗通過10 mol/L的硫酸補充，蒸發(fā)損失的水分通過添加蒸餾水補充。浸出20 d后用原子吸收光譜測定浸出液中的目標金屬元素濃度。

2　結果

2.1富集、分離培養(yǎng)

利用9K培養(yǎng)基從酸性礦坑水中獲得最終的富集培養(yǎng)物，將該富集培養(yǎng)物命名為FIM-201304。從固體平板分離獲得一株具有Fe2 +氧化活性的菌株，命名為D-1。光學顯微鏡觀察（圖1）表明，分離純化的菌株D-1具有嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的特征，個體形狀為桿狀，兩端鈍圓，以單個、雙個或幾個成短鏈狀存在。

圖1　菌株D-1結晶紫染色形態(tài)（100×）

2.2菌群的群落結構分析

2.2.1數(shù)據(jù)統(tǒng)計 通過Illumina平臺（Miseq）進行Paired-end測序，下機數(shù)據(jù)經過數(shù)據(jù)過濾去除低質量reads，數(shù)據(jù)產出詳細統(tǒng)計結果見表3。

表3　樣品測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2.2OTU 聚類 將序列完全一樣的HQ reads歸為一種tag，并統(tǒng)計每條tag對應的豐度（即reads數(shù)目），然后將tags根據(jù)其豐度大小進行排序，考慮到singletons可能由于測序錯誤造成，故將其中的singletons（對應reads只有一條的序列）這部分序列去除，不進行后期OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU，最后將所有HQ reads比對到OTU序列上，將能比對上OTU的reads提取出來，得到最終的Clean reads。統(tǒng)計樣品每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。樣品OTU統(tǒng)計結果見表4。

表4　樣品OTU統(tǒng)計

2.2.3OTU 抽平處理 由于不同樣本對應的reads數(shù)量差距較大，為了保證后期分析結果合理，對每個樣本的數(shù)據(jù)進行隨機抽平處理，每個樣品隨機抽取71 545條reads。抽平后的樣品統(tǒng)計表明OTU數(shù)量為215個。

2.2.4物種歸類分析 從各個OTU中挑選出豐度最高的一條序列，作為該OTU的代表序列。使用RDP方法，將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類，結果表明共歸屬51個科，141個屬。

2.2.5樣品復雜度分析 Alpha多樣性反映的是單個樣品內部的物種多樣性，包括observed species指數(shù)、chao指數(shù)、shannon指數(shù)、simpson指數(shù)以及PD_ whole_tree指數(shù)等。反映樣品中群落的豐富度（species richness）的observed species指數(shù)和chao指數(shù)對應的稀釋曲線（圖2）表明，曲線趨于平緩，可以認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。

圖2　Alpha多樣性指數(shù)稀釋曲線圖

高通量Illumina Miseq測序技術分析結果（圖3）表明，富集體系FIM-201301中優(yōu)勢種群主要有嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）（豐度占比85.02％），銅綠色假單胞菌（Pseudomonas sp.）（豐度占比10.07％），嗜酸異養(yǎng)菌（A. acidophilum）（豐度占比1.30％）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）（豐度占比1.21％）。菌株D-1與A. ferrooxidans sp. KCT17，A. ferrooxidans sp. ST2和A. ferrooxidans sp. PS107 的16S rRNA基因序列的相似性均為100％，因而確定D1屬于氧化亞鐵硫桿菌。

圖3　富集體系FIM-201301種群結構豐度占比圖

2.2.6礦石浸出效果 混合菌FIM-201301和單菌D1對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的搖瓶浸出實驗表明，浸出反應20 d后，接種混合菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別為65％和56％，在相同條件下，接種單菌的浸出體系中銅、鎳的浸出率分別為41％和36％。接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％。混合菌對礦石的浸出效果顯著優(yōu)于單菌，表明異養(yǎng)菌促進了自養(yǎng)菌對礦石中金屬元素的浸出。自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌組成的混合菌通過協(xié)同作用，能更好地完成物質轉化，提高各自的生長代謝活動，從而提高金屬浸出率。

3　討論

與傳統(tǒng)微生物多樣性分析手段相比，高通量測序技術具有通量高、讀長長且準確率高等特點，能在測定浸礦微生物群落結構多樣性上檢測到豐度較低的微生物［15］，因而本實驗采用高通量Illumina Miseq測序技術對篩選獲得的混合菌種FIM-201304的群落結構進行分析。后續(xù)我們將探討浸礦過程中細菌的群落結構動態(tài)變化，為改善生物浸礦工藝提供一定理論依據(jù)。

浸礦微生物種類繁多，按不同營養(yǎng)類型可劃分為自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌。目前，在微生物浸礦中研究比較多，在生產中得到應用的主要是氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵鉤端螺旋菌等化能自養(yǎng)微生物［16-20］。該類微生物在生長繁殖過程中不需要任何有機營養(yǎng)，完全靠各種礦物鹽生存。但該類微生物生長較為緩慢。浸礦體系中有機物的存在會一定程度上抑制自養(yǎng)菌的生長，尤其是生物浸出后期，微生物代謝產物積累和自身衰亡都會產生較多的有機物，從而抑制自養(yǎng)菌的氧化活性，最終降低金屬浸出效率。研究表明自然環(huán)境浸礦體系中自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌往往共同存在［21-23］。異養(yǎng)菌，如A. acidophilum，不僅能夠利用自養(yǎng)菌代謝產生的有機物作為能源，一定程度上消除有機物對自養(yǎng)菌的抑制作用，而且在生長過程中會產生有機酸等代謝物，此類產物的生成對礦石的溶解有重要的作用。自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌的混合菌對有價金屬的浸出率往往高于自養(yǎng)菌單一菌種。Liu等［12］研究了異養(yǎng)菌A. acidophilum 在轉錄水平上對A. ferrooxidans 生長代謝的影響。結果顯示，混合培養(yǎng)時A. ferrooxidans 的指數(shù)期延長2 d，細胞數(shù)量是純培養(yǎng)的5倍多，培養(yǎng)液中亞鐵離子的濃度增大，與鐵離子氧化有關的基因表達量上調。混合培養(yǎng)時，A. acidophilum激活了A. ferrooxidans 中的鐵離子氧化相關基因及固定CO2的相關基因，對A. ferrooxidans的生長代謝起到了極大的促進作用。Yang等［24］考察了A. ferrooxidans單菌和A. ferrooxidans 與A. acidophilum 的混合菌對低品位銅礦礦石的柱浸效果，結果表明，A. ferrooxidans單菌浸礦體系中銅的浸出率為14.8％，而混合菌浸礦體系中銅的浸出率為20.11％。A. acidophilum 的加入促進了A. ferrooxidans對銅的浸出率。王秀美［25］進行了A. ferrooxidans單獨菌和A. ferrooxidans與A. acidophilum的混合菌對鐵閃鋅礦的浸出行為研究，結果發(fā)現(xiàn)混合菌的浸出效果要好于單獨菌，異養(yǎng)菌的加入提高了自養(yǎng)菌的浸礦效率。

目前還未見采用A. ferrooxidans、Pseudomonas sp.、A. acidophilum和 Sphingomonas sp.的混合菌種浸礦的研究報道。該混合菌種是從自然環(huán)境中篩選而來，各菌種之間是一個相對穩(wěn)定和相容的整體，它們通過協(xié)同效應在浸礦中發(fā)揮作用。下一步我們將對其進行馴化以及浸礦工藝優(yōu)化的研究，以期更好地提高金屬元素的浸出速率和浸出率。

本實驗為開發(fā)利用以氧化亞鐵硫桿菌為主的浸礦混合菌種的應用打下了基礎，同時豐富了浸礦微生物協(xié)同作用理論。

4　結論

本實驗從福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水中分離獲得一種浸礦菌群FIM-201304和一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌D-1。菌群FIM-201304的優(yōu)勢菌是自養(yǎng)型嗜酸氧化亞鐵硫菌和異養(yǎng)型銅綠色假單胞菌、嗜酸異養(yǎng)菌及鞘氨醇單胞菌。采用搖瓶方法對比研究混合菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌單菌對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的浸出效果。結果表明，接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％。異養(yǎng)菌促進了自養(yǎng)菌對礦石中金屬元素的浸出。

［1］喻連香， 周丹， 石麗娟， 等. 國內某低品位難選銅礦的生物浸出研究［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展， 2014， 14（10）：1861-1864.

［2］Wang J， Zhu S， Zhang YS， et al. Bioleaching of low-grade copper sulfide ores by Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans［J］. Journal of Central South University， 2014， 21（2）：728-734.

［3］Davis-Belmar CS， Cautivo D， Demergasso C， et al. Bioleaching of copper secondary sulfide ore in the presence of chloride by means of inoculation with chloride-tolerant microbial culture［J］. Hydrometallurgy， 2014， 21（150）：308-312.

［4］Shabani MA， Irannajad M， Azadmehr AR， et al. Bioleaching of copper oxide ore by Pseudomonas aeruginosa［J］. International Journal of Minerals， Metallurgy and Materials， 2013， 20（12）：1130-1133.

［5］Ramanathan T， Ting YP. Selective copper bioleaching by pure and mixed cultures of alkaliphilic bacteria isolated from a fly ash landfill site［J］. Water Air Pollut， 2015， 226（11）：373-387.

［6］ 朱永光， 楊柳， 張火云， 等. 微生物菌劑的研究與開發(fā)現(xiàn)狀［J］.四川環(huán)境， 2004， 23（3）：5-12.

［7］Johnson DB. Importance of microbial ecology in the development of new mineral technologies［J］. Hydrometallurgy， 2001， 59（2）：147-157.

［8］ Johnson DB. Biodiversity and ecology of acidophilic microorganisms ［J］. FEMS Microbiol Ecol， 1998， 27（4）：307-317.

［9］錢林. Acidithiobacilius ferrooxidans和Acidiphilium spp. 細菌的分離鑒定及其協(xié)同浸出黃銅礦能力研究［D］. 長沙：中南大學，2008.

［10］Romo E， Weinacker DF， Zepeda AB， et al. Bacterial consortium for copper extraction from sulphide oreconsisting mainly of chalcopyrite ［J］. Brazilian Journal of Microbiology， 2013， 44（2）：523-528.

［11］Jain R， Ashish P， Sreekrishnan TR， Dastidr MG. Autoheated thermophilic aerobic sludge digestion and metal bioleaching in a two-stage reactor system［J］. Journal of Environmental Sciences，2010， 22（2）：230-236.

［12］Liu HW， Yin HQ， Dai YX， et al. The co-culture of Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidiphilium acidophilum enhances the growth，iron oxidation， and CO2 fixation［J］. Archives of Microbiology，2011， 193（12）：857-866.

［13］余潤蘭， 石麗娟， 周丹， 等. 生物浸出過程中微生物協(xié)同作用機制的研究進展［J］. 中國有色金屬學報， 2013， 23（10）：3006-3014.

［14］邵碧英， 陳彬， 湯敏英， 等. 沙門氏菌DNA提取及PCR反應條件的優(yōu)化［J］. 食品科學， 2007， 28（7）：331-334.

［15］郝曉東， 曾偉民， 彭堂見， 等. 高通量測序技術分析不同溫度下贊比亞低品位銅礦生物浸出過程中的微生物多樣性［J］.中國有色金屬學報， 2015， 25（9）：2558-2564.

［16］Xin BP， Li T， Li X， et al. Reductive dissolution of manganese from manganese dioxide ore by autotrophic mixed culture under aerobic conditions［J］. Journal of Cleaner Production， 2015， 92：54-64.

［17］Nkulu G， Gaydardzhiev S， Mwema E， et al. SEM and EDS observations of carrollite bioleaching with a mixed culture of acidophilic bacteria［J］. Minerals Engineering， 2015， 75：70-76.

［18］Ahmadi A， Mousavi SJ. The influence of physicochemical parameters on the bioleaching of zinc sulfide concentrates using a mixed culture of moderately thermophilic microorganisms［J］. International Journal of Mineral Processing， 2015， 135（10）：32-39.

［19］Zhao HB， WangJ， Gan XW， et al. Bioleaching of chalcopyrite and bornite by moderately thermophilic bacteria：an emphasis on their interactions［J］. International Journal of Minerals， Metallurgy and Materials， 2015， 22（8）：777-787.

［20］Wang J， Zhu S， Zhang YS， et al. Bioleaching of low-grade copper sulfide ores by Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans ［J］. Journal of Central South University， 2014， 21（2）：728-734.

［21］聶立， 稅劉楊， 王建英. 包頭泉山金礦浸礦酸性微生物群落優(yōu)勢度變化的比較研究［J］. 微生物學通報， 2014， 41（1）：43-49.

［22］Zeng WM， Qiu GZ， Zhou HB， et al. Community structure and dynamics of the free and attached microorganisms during moderately thermophilic bioleaching of chalcopyrite concentrate［J］. Bioresource Technology， 2010， 101（18）：7068-7075.

［23］楊國斌. PCR-測序法分析鈾生物堆浸過程中微生物群落結構變化特征［J］. 廣東化工， 2014（9）：21-23.

［24］Yang Y， Diao MX， Liu K， et al. Column bioleaching of low-grade copper ore by Acidithiobacillus ferrooxidans in pure and mixed cultures with a heterotrophic Acidophile acidiphilium sp. ［J］. Hydrometallurgy， 2013， 131（1）：93-98.

［25］王秀美. 自養(yǎng)與異養(yǎng)浸礦細菌的分離鑒定、浸礦及其生長代謝熱的基礎研究［D］. 長沙：中南大學， 2008.

（責任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of Mixed Culture，and Its Bioleaching Capacity

NIE Yi-lei CHEN Hong LUO Li-jin JIA Wei CHEN Xing-wei
（Fujian Institute of Microbiology，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)uzhou 350007）

It is aimed to screen the highly efficient leaching bacteria from acid mining water of low-grade copper sulfide mine，and also preliminarily investigate the bioleaching capacities of the bacteria. Firstly，a mixed culture FIM-201304 was obtained by 9K enrichment from acid mining water of a low-grade copper sulfide mine in Fujian province. Then，one dominated bacterium D-1 was isolated from the FIM-201304 using 9K solid culture medium. Sequencing technology by high-throughput Illumina Miseq was used to analyze the community structure of FIM-201304. D-1 was identified by phenotypic characteristics and 16S rRNA gene sequencing analysis. Flask experiment was utilized to compare the effects of leaching low-grade copper- and nickel-sulfide between the mixed culture FIM-201304 and a single bacterium D-1. Results from high-throughput sequencing analysis showed that the mixed culture FIM-201304 contained the dominated bacteria of Acidithiobacillus ferrooxidans（Abundance accounted for 85.02％），Pseudomonas sp.（Abundance accounted for 10.07％），Acidiphilium acidophilum（Abundance accounted for 1.30％）and Sphingomonas sp.（Abundance accounted for 1.21％）. According to phenotypic characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis，strain D-1 was identified as Acidithiobacillus ferrooxidans.The results after 20 days of bioleaching with flasks showed that leaching ratio of copper and nickel by FIM-201304 was 65％ and 56％ respectively，while the leaching ratio by D-1 was 41％ and 36％ under the same conditions，i.e.，the bioleaching ratio of copper and nickel by mixed culture increased 24％ and 20％ compared to that by single bacterium，respectively. Conclusively，the mixed culture resulted in the better leaching effect as heterotrophic bacteria promoted the metalleaching capacity of autotrophic bacteria from the ore.

Acidithiobacillus ferrooxidans；bioleaching；mixed culture；high-throughput sequencing；16S rRNA gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.026

2015-11-17

福建省科技計劃重點項目（2013Y0017）

聶毅磊，男，碩士，副研究員，研究方向：生物工程；E-mail：nie2050@sina.com

陳宏，碩士，高級工程師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：peaceful88@163.com