張鑫濤 唐紅萍 趙亮 范里 劉旭平 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

金屬離子對CHO細胞抗體表達及抗體電荷分布的影響

張鑫濤 唐紅萍 趙亮 范里 劉旭平 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

旨在深入認識金屬離子在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養(yǎng)生產單克隆抗體過程中所發(fā)揮的作用。綜合考察了不同銅離子和鋅離子濃度下CHO細胞的生長、抗體的表達以及抗體的電荷分布情況。結果顯示，一方面，當培養(yǎng)基中銅離子濃度為120 nmol/L、鋅離子濃度為50 μmol/L時，最有利于CHO細胞的生長和抗體的表達。過高或過低的銅離子和鋅離子均對細胞的生長和活性的維持產生了不利影響。另一方面，作為堿性羧肽酶抑制劑和輔因子的銅離子和鋅離子對抗體的電荷分布有著重要的影響。當培養(yǎng)基中銅離子濃度為50 nmol/L、鋅離子濃度為50 μmol/L時，最有利于減少抗體的電荷變體，提高主峰含量。過高或過低的銅離子和鋅離子均導致了電荷變體的增加，主峰含量的降低。且兩者的濃度和比例影響了抗體C末端賴氨酸的酶切過程，進而影響了堿性變體的含量。此外，對銅、鋅離子的操作空間進行了初步的研究。金屬離子在CHO細胞培養(yǎng)過程中對細胞的生長、抗體的表達以及抗體的電荷分布等方面都發(fā)揮著重要的作用。

動物細胞培養(yǎng)；電荷分布；金屬離子；單克隆抗體

抗體類藥物具有靶點明確、副作用小等優(yōu)點，已被廣泛應用于癌癥、自身免疫性疾病、器官移植后排異以及各類炎癥的治療［1］。運用動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術高效生產抗體類藥物已成為了當今生物醫(yī)藥產業(yè)的核心技術。其中CHO細胞具有高效的蛋白質翻譯后修飾功能以及較低的宿主蛋白分泌，已被廣泛應用于復雜蛋白質，尤其是抗體類藥物的生產。作為一類糖蛋白，抗體類藥物在動物細胞表達過程中會發(fā)生一系列的翻譯后修飾，如糖基化、C末端賴氨酸的切除、N末端谷氨酰胺的環(huán)化等，同時存在許多物理和化學降解，如天冬酰胺的去酰胺化、天冬氨酸的異構化、二硫鍵的還原等，從而導致單克隆抗體異質性的產生［2］。這些抗體的異質性往往體現在糖型的差異、電荷的差異、分子量的差異以及疏水性的差異。

抗體的電荷異質性是由于翻譯后修飾和降解導致抗體所帶的凈電荷或電荷空間分布發(fā)生了改變。這類變體可以通過離子交換色譜、疏水作用色譜和毛細管等電聚焦等方法進行分離和鑒定。在陽離子交換色譜中，抗體的酸性變體和堿性變體分別指洗脫時間小于和大于主峰的那部分電荷變體。其中酸性變體主要由天冬酰胺去酰胺化、賴氨酸的糖化、二硫鍵的錯誤連接、糖基化（唾液酸）等引起，而堿性變體則主要由賴氨酸變體、焦谷氨酸的形成、天冬氨酸的異構化、甲硫氨酸的氧化等引起。賴氨酸變體是由于抗體C末端賴氨酸的不完全酶切而引起的，它的存在會抑制補體的激活，進而影響抗體補體依賴的細胞毒作用（Complement dependent cytotoxicity，CDC）活性，是一類重要的堿性變體［3］。此外，抗體電荷變體的存在還會引起抗體穩(wěn)定性、生物學活性、藥物動力學、免疫原性等抗體結構和功能的改變［4］，是抗體類藥物的關鍵質量屬性（Critical quality attribution，CQA）之一。因此，在單克隆抗體生產過程中，需要對其電荷變體含量進行嚴格的監(jiān)測和控制。

金屬離子是動物細胞無血清培養(yǎng)過程中一類重要的添加劑。研究表明，培養(yǎng)基中金屬離子的濃度對CHO細胞的生長、代謝以及抗體的表達都具有一定的影響［5］。近年來，越來越多的研究開始關注金屬離子對抗體質量方面的影響，如聚體［6］、碎片［7］、糖基化［8］、脯氨酸酰胺化［9］等。然而，細胞培養(yǎng)過程是一個復雜的非均相反應體系，其中涉及細胞的生理狀態(tài)、底物的供給和相互交織的調控網絡。因此，在保證抗體產量的前提下如何有效控制抗體的電荷異質性仍是抗體類藥物生產過程中遇到的關鍵問題之一。為此，本研究以表達單克隆抗體的CHO細胞為研究對象，考察銅離子和鋅離子在細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布中發(fā)揮的作用，旨在為動物細胞培養(yǎng)基中金屬離子的濃度提供合理的操作空間，從而為抗體類藥物生產過程中電荷異質性的有效控制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用細胞為一株表達人源化單克隆抗體的重組CHO細胞株。所使用的培養(yǎng)基為本實驗室開發(fā)具有自主知識產權的無血清培養(yǎng)基。專利號為：CN 104328158 A。培養(yǎng)基配制所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基配制完后經0.22 μm微孔濾膜（Millipore）過濾除菌使用。

1.2方法

1.2.1種子細胞培養(yǎng) 從細胞庫中復蘇CHO細胞，以5.0×105cells/mL的活細胞密度接種于125 mL搖瓶（Corning），接種體積為30 mL，置于37℃、5％ CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行懸浮培養(yǎng)，搖床轉速為120 r/min。每隔2 d進行種子細胞傳代擴增，傳代后活細胞密度控制在5.0×105cells/mL左右。

1.2.2批式培養(yǎng) 取指數生長期的CHO種子細胞，經1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮（不含銅離子和鋅離子）培養(yǎng)基進行重懸。以1.0×106cells/mL的活細胞密度接種于125 mL搖瓶，接種體積為30 mL。根據實驗設計額外添加所需的硫酸銅和硫酸鋅濃縮液。將搖瓶置于37℃、5％ CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中進行懸浮培養(yǎng)，搖床轉速為120 r/min。每組實驗重復3次。培養(yǎng)過程中每天取樣1 mL進行細胞計數，經10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于抗體產量和質量的檢測。

1.2.3細胞計數 細胞密度采用血球計數板進行計算，并用臺盼藍拒染法確定細胞的活性。

1.2.4抗體濃度檢測 抗體濃度采用親和色譜的方法進行檢測，色譜柱為POROS Protein A affinity column，4.0×50 mm（Applied Biosystems），具體步驟見參考Yang等［10］的方法。

1.2.5抗體純化 抗體純化采用親和層析的方法，層析柱為HiTrap Protein A HP（GE Healthcare），具體方法步驟見產品說明書。

1.2.6抗體電荷變體檢測 抗體的電荷變體采用弱陽離子交換色譜進行檢測，色譜柱為ProPac WCX-10 column，4.0×250 mm（Dionex），具體步驟參考Zhang等［11］方法。為了檢測堿性變體中賴氨酸變體的含量，將純化后抗體用羧肽酶B進行酶切（37℃，30 min），對比酶切前后抗體的弱陽離子交換色譜圖即可計算出賴氨酸變體的含量。圖1為典型的弱陽離子交換色譜圖及羧肽酶酶切示意圖。

圖1　典型弱陽離子交換色譜圖

1.2.7數據分析 抗體的比生成速率qmAb（mg/109cells/day）通過以下公式進行計算：

其中，P為抗體濃度（mg/L）；IVCC為活細胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

2　結果

2.1銅離子對CHO細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布的影響

為了研究銅離子對CHO細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布的影響，向起始培養(yǎng)基中添加不同量的硫酸銅濃縮液使銅離子濃度分別為0、10、50、120、200、400、1 000和50 000 nmol/L。同時將鋅離子濃度調整到10 μmol/L（無血清培養(yǎng)基中鋅離子的原始濃度）。

2.1.1銅離子對CHO細胞生長、抗體表達的影響 批式培養(yǎng)過程中，CHO細胞在不同銅離子濃度條件下的生長曲線（圖2-A）顯示，當培養(yǎng)基中不含銅離子（0 nmol/L）時，細胞生長到第3天時達到最大活細胞密度為4.0×106cells/mL，隨后細胞逐漸死亡，培養(yǎng)結束時（10 day），活細胞密度僅為0.4× 106cells/mL。隨著銅離子濃度的升高，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度呈現出先上升后下降的趨勢。當銅離子濃度為120 nmol/L時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度最高，為5.9×106cells/mL。同時更有利于活細胞密度的維持，培養(yǎng)結束時，活細胞密度仍有4.5×106cells/mL。隨著銅離子濃度的進一步升高（＞120 nmol/L），培養(yǎng)過程所能達到的最大活細胞密度逐漸下降。當銅離子濃度達到50 000 nmol/L時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度下降到4.8×106cells/mL。此外，隨著銅離子濃度的升高，活細胞密度對時間的積分（IVCC，圖2-B）、最終抗體濃度（Titer，圖2-C）以及抗體的比生成速率（qmAb，圖2-D）也呈現出先上升后下降的趨勢。當銅離子濃度為120 nmol/L時，IVCC和最終抗體濃度都達到最高值，分別為不含銅離子條件下的1.65倍和2.39倍。而當銅離子濃度為1 000 nmol/L時，抗體的比生成速率達到最大，為不含銅離子條件下的1.62倍。

2.1.2銅離子對抗體電荷分布的影響 此外，考察了不同銅離子濃度條件下抗體的電荷分布情況，結果（圖3）顯示，當培養(yǎng)基中不含銅離子時，抗體中酸性變體、主峰以及堿性變體含量分別為33.17％、49.63％和17.19％。通過羧肽酶B的酶切實驗發(fā)現，其中7.14％的堿性變體來自于賴氨酸變體。當銅離子濃度小于50 nmol/L時，隨著銅離子濃度的升高，抗體酸性變體含量隨之下降，而主峰、堿性變體以及賴氨酸變體含量則隨之上升。對比堿性變體和賴氨酸變體含量（圖3-C）發(fā)現，堿性變體含量的提高是由于賴氨酸變體含量的上升所導致的。當銅離子濃度為50 nmol/L時，抗體的主峰含量達到最高，為54.10％。此時，抗體酸性變體、堿性變體以及賴氨酸變體含量分別為26.6％、19.3％和9.3％。隨著銅離子濃度的進一步升高（＜400 nmol/L），抗體的酸性變體含量進一步下降，主峰含量由上升轉為下降，同時堿性變體以及賴氨酸變體含量進一步上升。當銅離子濃度為400 nmol/L時，抗體的酸性變體含量達到最低，為24.46％，而抗體的堿性變體以及賴氨酸變體同時達到最高，分別為23.20％和13.59％。當進一步提高銅離子濃度時（＞400 nmol/L），抗體的酸性變體含量由下降轉為上升，同時主峰含量進一步下降，堿性變體和賴氨酸變體的含量略有下降。

圖2　不同銅離子濃度下CHO細胞的生長（A）、活細胞密度對時間的積分（B）、抗體濃度（C）以及抗體比生產速率（D）情況

以上結果表明，銅離子對CHO細胞的生長、抗體表達以及抗體的電荷分布均有顯著影響。其中120 nmol/L的銅離子濃度最適合細胞的生長以及抗體的表達，而50 nmol/L的銅離子濃度則最有利于減少抗體的電荷變體，獲得較高的主峰含量。

2.2鋅離子對CHO細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布的影響

為了研究鋅離子對CHO細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布的影響，向起始培養(yǎng)基中添加不同量的硫酸鋅濃縮液使鋅離子濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、1、10、50和200 μmol/L。同時將銅離子濃度調整到120 nmol/L（無血清培養(yǎng)基中銅離子的原始濃度）。

2.2.1鋅離子對CHO細胞生長、抗體表達的影響 批式培養(yǎng)過程中，CHO細胞在不同鋅離子濃度條件下的生長曲線（圖4-A）顯示，當培養(yǎng)基中不含鋅離子時，細胞生長到第2天時就達到最大活細胞密度為2.2×106cells/mL。隨后細胞迅速進入衰亡期，培養(yǎng)到第6天時，活細胞密度下降到0。隨著培養(yǎng)基中鋅離子濃度的升高，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度呈現出先上升后下降的趨勢。當鋅離子濃度為50 μmol/L時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度最高，為4.9×106cells/mL，同時延長了活細胞密度的維持，培養(yǎng)結束時，活細胞密度仍有3.1×106cells/mL。隨著鋅離子濃度的進一步升高（＞50 μmol/L），培養(yǎng)過程所能達到的最大活細胞密度逐漸下降。當鋅離子濃度達到200 μmol/L時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度下降到4.0×106cells/mL。此外，隨著鋅離子濃度的升高，IVCC（圖4-B）和最終抗體濃度（圖4-C）也呈現出先上升后下降的趨勢。當鋅離子濃度為50 μmol/L時，IVCC和最終抗體濃度同時達到最高值，分別為不含鋅離子條件下的3.74倍和11.28倍。而抗體的比生成速率隨著鋅離子濃度的升高而一直上升（圖4-D），當鋅離子濃度達到最高時（200 μmol/L），抗體的比生成速率為不含鋅離子條件下的2.49倍。

圖3　不同銅離子濃度下抗體電荷分布情況

2.2.2鋅離子對抗體電荷分布的影響 此外，考察了不同鋅離子濃度條件下抗體的電荷分布情況，結果（圖5）顯示，當培養(yǎng)基中不含鋅離子時，抗體中酸性變體、主峰以及堿性變體含量分別為31.97％、32.38％和35.65％，其中21.79％的堿性變體來自于賴氨酸變體。當鋅離子濃度小于50 μmol/L時，隨著鋅離子濃度的升高，抗體酸性變體、堿性變體以及賴氨酸變體含量都隨之下降，同時主峰含量逐漸上升。對比堿性變體和賴氨酸變體含量發(fā)現，堿性變體含量的下降主要是由于賴氨酸變體含量的降低所導致的。當鋅離子濃度為50 μmol/L時，抗體酸性變體含量達到最低，為18.64％，同時主峰含量達到最高，為54.53％。隨著鋅離子濃度的進一步升高（＞50 μmol/L），抗體酸性變體含量由下降轉為上升，主峰含量由上升轉為下降，同時堿性變體和賴氨酸變體含量進一步下降。當鋅離子濃度達到200 μmol/L時，抗體的酸性變體、主峰、堿性變體以及賴氨酸變體含量分別為24.18％、53.52％、22.30％和3.05％。

以上結果表明，鋅離子對CHO細胞的生長、抗體表達以及抗體電荷分布具有顯著影響。其中鋅離子濃度為50 μmol/L時最適合細胞的生長以及抗體的表達，同時有利于減少抗體的電荷變體，獲得較高的主峰含量。

2.3銅離子和鋅離子對抗體電荷分布的影響

圖4　不同鋅離子濃度下CHO細胞的生長（A）、活細胞密度對時間的積分（B）、抗體濃度（C）以及抗體比生產速率（D）情況

圖5　不同鋅離子濃度下抗體電荷分布情況

從以上結果可以看出，銅離子和鋅離子對抗體賴氨酸變體含量起著相反的作用。為此，進一步考察了銅離子和鋅離子兩者之間的比例對抗體賴氨酸變體的影響。17個不同銅離子和鋅離子比例條件下賴氨酸變體的含量情況（圖6-A）顯示，當銅/鋅［（nmol/L）/（μmol/L）］比例為0.6時，賴氨酸變體的含量只有3.05％。隨著銅/鋅比例的升高，賴氨酸變體的含量也隨之上升。當銅/鋅比例為600時，賴氨酸變體的含量上升到了21.79％。這些數據進一步說明了銅離子和鋅離子在抗體C末端賴氨酸的酶切過程中所發(fā)揮的相反的作用，調節(jié)兩者之間的比例是控制抗體賴氨酸變體含量的有效手段。

抗體電荷變體的有效控制是抗體類藥物生產過程中過程優(yōu)化和控制的關鍵。根據質量設計（quality by design，QbD）的基本理念，為了確定合適的操作空間，進一步考察了不同銅離子和鋅離子條件下抗體的主峰含量，并做出主峰含量的等高線圖（圖6-B）。如圖所示，在我們的考察范圍內（圖6-B右側實線范圍內），顏色越深，代表主峰含量越高。當鋅離子低于10 μmol/L時，抗體主峰含量均低于50％，且隨著鋅離子濃度的增加，抗體主峰含量顯著上升。當鋅離子高于10 μmol/L時，抗體主峰含量均高于50％，且當銅離子濃度為50 nmol/L左右時，抗體主峰含量達到最高。可以看出，抗體的主峰含量由銅、鋅離子濃度以及兩者的配比共同決定。為了有效地控制電荷變體含量，需要將銅、鋅離子控制在一個合適的濃度范圍內，即操作空間。

圖6　銅離子和鋅離子對抗體電荷分布的影響

3　討論

作為動物細胞培養(yǎng)過程中不可或缺的一部分，金屬離子在細胞的生長、代謝、抗體的表達以及抗體質量等方面都發(fā)揮著重要的作用。本研究以一株表達單克隆抗體的CHO細胞為對象，綜合考察了銅離子和鋅離子對細胞生長、抗體表達以及抗體電荷分布的影響。

在細胞生長和抗體表達方面，過低或過高的銅離子和鋅離子均抑制了CHO細胞的生長和活細胞密度的維持，進而影響了抗體的表達。銅離子是細胞培養(yǎng)過程中一種重要的微量元素，它是細胞有氧代謝途徑中諸多關鍵酶的輔因子［12］。在銅離子不足的情況下，細胞的有氧代謝將受到抑制，乳酸等代謝副產物會大量積累，最終導致抗體表達水平的下降和細胞的死亡。同時，銅離子具有調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)的作用，高濃度的銅離子會使胞內累積大量的活性氧物質（ROS），對細胞產生毒副作用，進而影響細胞的生長和抗體的表達。鋅離子是細胞培養(yǎng)過程中另一種重要的微量元素，細胞內有超過300個關鍵性的細胞過程，包括DNA和蛋白質的合成、有絲分裂、細胞擴增、能量代謝和信號轉導，需要鋅離子的參與［13］。在動物細胞無蛋白懸浮培養(yǎng)過程中，鋅離子往往被作為胰島素的替代物來添加［14］。此外，鋅離子還具有提高mRNA穩(wěn)定性和抗細胞凋亡的作用［15］。因此，鋅離子的不足將直接影響到葡萄糖的利用和細胞代謝，進而影響到細胞的生長以及產物的表達。同時，作為重金屬，高濃度的鋅離子同樣會給細胞帶來毒副作用。本研究發(fā)現，50 μmol/L的鋅離子濃度最適合CHO細胞的生長以及抗體的表達，該結果與Kim等［13］的研究結論基本一致。

在抗體的電荷分布方面，高濃度的銅離子提高了抗體賴氨酸變體含量，進而提高了堿性變體含量（圖3-C）。相反，高濃度的鋅離子則降低了抗體賴氨酸變體含量，進而降低了堿性變體含量（圖5-C）。兩者之間的比例對抗體賴氨酸變體的含量發(fā)揮著重要的調節(jié)作用（圖6-A）。賴氨酸變體是由于抗體重鏈C末端賴氨酸的不完全酶切而引起的，是一類重要的堿性電荷變體。在我們前期的研究中發(fā)現，堿性羧肽酶B（CpB）和堿性羧肽酶H（CpH）是CHO細胞中兩種主要的負責抗體C末端賴氨酸酶切的羧肽酶，它們的表達及活性受溫度、pH以及各類抑制劑的調節(jié)［11，16］。此外，有文獻［17］報道，銅離子和鋅離子分別是堿性羧肽酶的抑制劑和輔因子，它們的濃度和比例將直接影響到羧肽酶的活性，進而影響抗體賴氨酸變體以及堿性變體的含量。另一方面，過高或過低的銅離子和鋅離子均導致了較高的酸性變體（圖3-A和圖5-A），這可能與銅離子和鋅離子所發(fā)揮的氧化還原作用有關。Hossler等［18］研究表明，培養(yǎng)基中氧化還原劑的添加可以有效地調節(jié)抗體的酸性變體。此外，銅離子和鋅離子還會影響到抗體聚體和碎片的含量［6，7］，而聚體和碎片恰恰與抗體的電荷分布密切相關［19］。

抗體的電荷異質性是評價抗體質量優(yōu)劣的一項重要指標。然而，電荷變體由于其種類繁多、分離鑒定困難且形成機制復雜，如何有效地控制其含量已成為抗體類藥物生產過程中一個普遍的難題。本研究通過對銅、鋅離子重要性的研究，以及對其操作空間的討論，為動物細胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)及抗體類藥物電荷異質性的有效過程控制奠定了基礎。

4　結論

本研究通過運用過程分析技術（Process analytical technology，PAT）對影響抗體電荷分布的兩個關鍵過程參數（Critical process parameters，CPPs）銅離子和鋅離子進行了考察。結果表明，銅離子和鋅離子對CHO細胞的生長、抗體表達以及抗體的電荷分布都有顯著影響。調節(jié)兩者的濃度和配比是控制抗體電荷變體的有效手段。

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（責任編輯 馬鑫）

Effects of Metal Ions on Antibody Production and Charge Heterogeneity in CHO Cell Cultures

ZHANG Xin-tao TANG Hong-ping ZHAO Liang FAN Li LIU Xu-ping MIAO Shi-wei TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The objective of this work is to get insights into the role of metal ions in the production of the monoclonal antibody（mAb）during Chinese hamster ovary（CHO）cell cultures. Cell growth，antibody production and antibody charge distribution at different concentrations of copper and zinc ions during cell cultures were comprehensively investigated. It was found that 120 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion were the optimal concentrations for cell growth and antibody production. Excessively low or high levels of copper and zinc ions brought negative impacts on cell growth and viability maintenance. Additionally，copper ion and zinc ion，as the inhibitor and cofactor of basic carboxypeptidase respectively，showed considerable effects on antibody charge distribution. The medium containing 50 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion was the most conducive to the reduction of charge variants and the increase of main species. Both excessively low or high concentrations of copper and zinc ions led to the increase of the antibody charge variants and the reduction of main species. The concentrations and ratios of copper and zinc ions altered the enzymatic digestion at antibody C-terminal lysine，subsequently affected the content of the basic variant. Additionally，the working space of copper and zinc ions for process control of antibody charge variants was preliminarily discussed. In conclusion，the metal ions play important roles in cell growth，mAb production and mAb charge distribution during CHO cell cultures.

animal cell culture；charge distribution；metal ions；monoclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.034

2016-01-01

國家自然科學基金項目（21406066），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003）

張鑫濤，男，博士研究生，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：zhangxintao@mail.ecust.edu.cn

趙亮，男，講師，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：zhaoliang@ecust.edu.cn譚文松，男，教授，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：wstan@ecust.edu.cn