劉友勛 閆明陽 耿園園 黃娟

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003）

嗜堿芽孢桿菌cotA基因克隆表達及部分性質(zhì)研究

劉友勛 閆明陽 耿園園 黃娟

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003）

為了獲得具有高性能的多銅離子氧化酶，從極端微生物嗜堿芽孢桿菌（Bacillus clausii KSM-K16）中克隆表達了其芽孢外衣蛋白CotA。根據(jù)B. clausii KSM-K16的CotA序列及大腸桿菌密碼子的偏愛性，設計和合成出該基因全長序列，構建pET28a-cotA重組表達載體，將其轉化到Escherichia coli BL21（DE3）并誘導表達出重組蛋白，純化并研究了CotA部分生化特性。重組CotA約62 kD，表現(xiàn)出藍綠色并在波長609 nm有銅離子特征吸收峰，能氧化ABTS、SGZ和膽紅素等底物；以SGZ為底物，最適pH和溫度分別為7.5和90℃；在80℃孵育2 h，能保持70％活性；在pH4-11范圍分別孵育1 h，能保持90％活性。結果顯示，嗜堿芽孢桿菌CotA是一種具有漆酶和膽紅素氧化酶活性的典型多銅離子氧化酶，表現(xiàn)出熱和酸堿穩(wěn)定性。

嗜堿芽孢桿菌；芽孢外衣蛋白；漆酶；多銅離子氧化酶

芽孢桿菌（Bacillus）是一類能產(chǎn)生內(nèi)生孢子的桿狀細菌，擁有多個種屬，在自然界中分布非常廣泛，在各種土壤、水體、動物腸道和植物體內(nèi)都存在［1］。與其它種屬的細菌相比，芽孢桿菌能生存在各種不利因素的環(huán)境中，甚至在很多極端環(huán)境中也能很好的存活［2］。芽孢桿菌的這種能力是由其內(nèi)生孢子所賦予的，它們對很多理化因素如：高溫、紫外線、酸、堿和化學消毒劑等有較強的抵抗力［3］。芽孢衣殼中除含有少量脂類和多糖等化合物外，主要成分是蛋白質(zhì)，這些獨特外殼蛋白引起了研究者的興趣［4］。

近年來發(fā)現(xiàn)芽孢外衣殼蛋白（CotA）具有多銅離子氧化酶的活性［4，5］，能氧化多數(shù)真菌漆酶的底物，被認為是細菌漆酶，有可能取代真菌漆酶而應用于各種領域［6，7］，并且還發(fā)現(xiàn)有些CotA可以氧化膽紅素，顯示出膽紅素氧化酶活性，能用于測定血液中的膽紅素，這預示著其在醫(yī)療診斷中也有潛在的應用價值［7］。這些發(fā)現(xiàn)為利用芽孢外衣殼蛋白提供了科學依據(jù)，但大規(guī)模應用CotA還存在一些需要解決的問題：其一，尋找高性能的CotA蛋白；其二，如何大量獲得這些CotA蛋白。許多微生物研究資料顯示，極端微生物是產(chǎn)生高性能和高利用價值蛋白的重要來源［8］。目前成熟的基因克隆表達技術則是獲得大量目的蛋白的有效途徑，甚至一些難從生物體直接獲取模板的基因，可根據(jù)其已知的基因序列，通過人工合成基因來進行表達重組蛋白，這種途徑也大大提高了獲得目的蛋白的便利性和可行性。

為了尋求高性能的CotA蛋白，本研究擬從極端嗜堿芽孢桿菌（B. clausii KSM-K16）中克隆表達CotA蛋白（簡稱BC-CotA）基因，并對其生化特性進行研究。由于這種極端嗜堿芽孢桿菌不易培養(yǎng)，難以從其菌體中獲得所需要的基因模板，但其基因組測序已經(jīng)完成，可從GenBank查到cotA序列，通過優(yōu)化其密碼子，采用基因合成的方式獲得該基因全長，使重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達出有活性的BC-CotA，以期為利用極端嗜堿芽孢桿菌的BC-CotA提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

cotA基因和相關引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；用于表達的質(zhì)粒pET28a、XL10-gold感受態(tài)細胞及表達菌株E.coli BL21（DE3）為本實驗室保存；各種限制性內(nèi)切酶購自New England公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京全式金公司；蛋白質(zhì)Ni-IDA 高親和力純化柱試劑盒購自德國QIAGEN公司；2，2'-連氮-雙-（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS），丁香醛連氮（SGZ）和膽紅素購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1基因設計、合成及鑒定 根據(jù)GenBank中BC-CotA序列和大腸桿菌密碼子的偏愛性，優(yōu)化了基因全長序列，末端包含有Nde I和 Xho I兩個酶切位點，合成的全長基因序列長度為1 539 bp，基因合成及重組質(zhì)粒構建路線如圖1所示。用Nde I 和 Xho I酶切合成的基因片段，然后與同樣酶切的pET28a+的載體連接，轉化大腸桿菌（XL10-gold），篩選重組克隆子，提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR和酶切鑒定的重組質(zhì)粒送上海生工公司測序驗證。

圖1　基因合成路線

1.2.2BC-CotA表達及純化 鑒定正確的重組質(zhì)粒轉化于表達菌株E.coli BL21（DE3）中，挑取單菌落接種到含30 g/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600≈0.6時，加入1 mmol/L的IPTG和0.3 mmol/L的硫酸銅，于28℃誘導12 h，采用SDS-PAGE分析誘導表達的蛋白。蛋白純化使用Ni-IDA高親和力純化柱，按試劑盒說明書操作，純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3電泳 SDS-PAGE的濃縮膠5％、分離膠濃度為12％，用考馬斯亮藍R250染色2 h，脫色4 h；活性PAGE檢測時，樣品不需要加熱和用變性劑處理，用底物ABTS、SGZ和愈創(chuàng)木酚分別浸泡膠條20 min至顯色［9，10］。

1.2.4生物信息學分析 為了分析不同來源CotA之間以及與真菌多銅離子氧化酶的相關性，選取了3種芽孢桿菌CotA、2種真菌漆酶和1種真菌膽紅素氧化酶進行比較。生物信息學分析采用在線軟件：Cobalt Constraint-based Multiple Protein Alignment Tool、ClustalW2和SWISS-MODEL。

1.2.5酶學性質(zhì)

1.2.5.1活性測定 以SGZ（50 mmol/L）作為底物，反應溫度為25℃，反應體系共3 mL，分別為2.4 mL緩沖液（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.5）、0.1 mL酶液、0.5 mL SGZ，記錄反應3 min前后在波長525 nm的吸光值變化。酶活定義：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol SGZ氧化所需的酶量稱為一個酶活力單位（U）。

1.2.5.2最適反應溫度 先將加有底物的反應緩沖液在不同溫度（50-100℃，以5℃為間隔）下保溫5 min，然后在測試之前加入酶液測其活力。

1.2.5.3最適反應pH 在酶活性測定時，將反應體系緩沖液換為Britton-Robinson緩沖液（pH6-9）測其活力。

1.2.5.4溫度穩(wěn)定性 將含有酶液的緩沖液置于80℃烘箱孵育，每隔10 min，取出部分酶液測定酶活性，共2 h。

1.2.5.5酸堿穩(wěn)定性 將酶液加入不同pH Britton-Robinson緩沖液（pH4-11）中并置于37℃培養(yǎng)箱中孵育，1 h后，測定酶活性。

2　結果

表1　cotA基因合成前后密碼子變化

2.1cotA 基因合成及重組質(zhì)粒鑒定

cotA 基因（GI：56961782）1 530 bp，編碼509個氨基酸，根據(jù)大腸桿菌表達偏愛性對編碼CotA的密碼子進行了優(yōu)化，同時去除了一些潛在的發(fā)卡結構。從優(yōu)化的密碼子（表1）中看出，調(diào)整了原cotA基因密碼子比例和分布，將其編碼氨基酸的密碼子集中于適合在大腸桿菌中表達的密碼子上。例如，編碼Arg有6種密碼子，在原基因中都有存在，而經(jīng)過優(yōu)化后，在合成基因中編碼Arg的密碼子主要集中在CGC和CGU。重組質(zhì)粒命名為pET28a-cotA，經(jīng)過PCR和酶切檢測（圖2），正確的克隆子送公司測序，測序的結果與設計的基因序列一致，表明已獲得正確的cotA基因全長序列，該合成的全長序列在GenBank中已注冊（GI：607344463）。

圖2　重組質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定

2.2合成基因表達及活性檢測

將誘導表達后的菌體進行超聲破碎，SDS-PAGE分析沉淀和上清液蛋白條帶，與未經(jīng)誘導的對照相比，發(fā)現(xiàn)沉淀和上清都有一條接近66 kD的顯著蛋白條帶，其中在沉淀中約占目的條帶總量的73％，上清中約為27％，表明目標蛋白大部分以包涵體的形式存在于沉淀中（圖3）。收集的上清液經(jīng)過Ni-IDA樹脂純化，得到純化后的重組蛋白BC-CotA。理論上BC-CotA包含有509個氨基酸，大小約59 kD，連接載體上融合有20個氨基酸，約為2.3 kD，預測的重組蛋白大小約為62 kD，與蛋白質(zhì)Marker中66 kD相比，基本與表達出的目的蛋白分子量大小一致。將純化的重組蛋白進行活性電泳檢測，發(fā)現(xiàn)能夠氧化漆酶的典型底物SGZ、ABTS和愈創(chuàng)木酚，表明純化的重組CotA具有漆酶活性。

2.3蛋白序列生物信息學分析

BC-CotA中結合銅離子的區(qū)域在氨基酸序列101-105、148-152、408-416、482-492等4個位置，與部分已知的芽孢桿菌CotA有約60％的同源性（表2），除第3個銅離子結合區(qū)域有一個氨基酸差異外，與不同CotA其他3個銅離子結合區(qū)域完全一樣，這表明本研究表達出的CotA蛋白與已知的CotA功能上具有相似性，但蛋白質(zhì)序列有明顯的差異。與兩種真菌漆酶相比較，同源性在20％以下，4個銅離子結合區(qū)域也有較大的差異。與已知的漆斑菌膽紅素氧化酶（Bilimbin oxidase，BOD）相比，有40％的序列同源性，4個銅離子結合區(qū)域一致，這表明CotA在功能上可能更接近于BOD。表2顯示，不論是細菌還是真菌，這些多銅離子氧化酶的結合區(qū)域中組氨酸（H）有高度的保守性。以細菌多銅離子氧化酶（PDB ID：3OD3）為模型，通過SWISS-MODEL軟件建模獲得其BC-CotA 3D結構（圖4）。從其結構分析可知，整個蛋白分子由2個杯狀（Cupredoxin-like）結構域組成，有3個α螺旋，5個β轉角，10個β片層。其中由4個氨基酸殘基（通常有1個Met）圍繞著1個銅離子形成了第1個活性中心，接近于蛋白分子的外部，主要功能是結合酶底物；另外3個銅離子與一些保守殘基形成了第2個活性中心，深埋于蛋白分子的內(nèi)部，主要功能是將電子傳遞給氧分子。

圖3　SDS-PAGE（A）和活性電泳檢測（B）

2.4BC-CotA部分生化特性研究

純化后的重組蛋白CotA表現(xiàn)出藍綠色，在波長609 nm處有一個明顯的吸收峰（圖5），這是二型銅離子的特征峰，表明BC-CotA是一種典型的多銅離子氧化酶。BC-CotA能將無色的SGZ溶液氧化成粉紅色、無色的ABTS溶液氧化成綠色、深紅色的膽紅素氧化成綠色（圖6），表現(xiàn)出多銅離子氧化酶活性。以SGZ為底物，隨著溫度升高，其CotA活性逐漸增加，最適溫度為90℃左右，并且在100℃還能檢測到較高的活性（圖7）。溫度穩(wěn)定性結果（圖8）顯示，BC-CotA在80℃孵育時，活性先增加后下降，有明顯的熱激效應，1 h內(nèi)活性保持不變，2 h后還能保持原活性的70％，表明BC-CotA有很強的熱穩(wěn)定性。圖9顯示，隨著pH升高，酶活性逐漸增加，其最適pH為7.5，并且在pH7-9保持30％以上的活性。pH穩(wěn)定性結果（圖10）顯示，在pH4-11，BC-CotA能保持在80％以上活性，其中在pH7 和8活性基本不變，表明BC-CotA在寬泛的酸堿范圍中都能保持穩(wěn)定。

表2　不同銅離子氧化酶銅離子結合位點和同源性

圖4　BC-CotA的三維結構示意圖

圖5　純化的重組蛋白顯色（A）及掃描光譜（B）

圖6　BC-CotA催化不同底物顏色反應

圖7　溫度對酶活性的影響

圖8　80℃時的酶活穩(wěn)定性

圖9　pH對酶活性的影響

圖10　pH對酶活穩(wěn)定性的影響

3　討論

真菌漆酶底物范圍廣泛，在催化過程中不需要輔酶，副產(chǎn)物是水分子，因此有很好的應用價值，但多數(shù)真菌漆酶的最適pH值在酸性范圍且不耐高溫，這些是困擾真菌漆酶應用的難題，而挖掘新的漆酶來源是解決這些難題的有效途徑［11-15］。CotA具有多銅離子氧化酶的活性，能催化多種漆酶底物，被認為是真菌漆酶的最適替代者［5］。日本學者Horikoshi［11］于1971年分離鑒定了極端嗜堿芽孢桿菌（B. clausii KSM-K16），目前已從該細菌中分離出一種嗜堿蛋白酶并進行了工業(yè)化生產(chǎn)，這預示著該細菌能產(chǎn)生性能特異的蛋白。由于B. clausii KSM-K16具有重要的商業(yè)價值，國內(nèi)的菌種保藏中心沒有獲得該菌種，無法從該微生物中直接獲得模板DNA。當前人工基因合成技術已經(jīng)非常成熟，是基因獲取的手段之一，不受基因來源限制，只需根據(jù)基因序列就能快速得到該基因［16］。另一方面，基因合成有很好的靈活性，能夠修改基因的序列和內(nèi)部酶切位點，從而方便下游的克隆和實驗。還可以通過基因合成進行密碼子優(yōu)化，使合成基因在合適的宿主中得到高效表達［17，18］。因此，本研究通過人工基因合成的方法獲得cotA基因，然后成功地表達出有活性的芽孢外衣殼蛋白BC-CotA。

BC-CotA大小在59 kD，與已報道的多數(shù)CotA蛋白大小一致［19］。盡管本研究對BC-CotA已經(jīng)實現(xiàn)了可溶性表達，但大部分蛋白以包涵體的形式存在，一方面需要對表達條件進行優(yōu)化，另一方面可尋求其它合適的表達系統(tǒng)，Liu等［20，21］已成功地使不同芽孢桿菌的cotA基因在酵母表達系統(tǒng)中得到高效表達，這也為下一步研究提供了思路。在多銅離子氧化酶中，漆酶和膽紅素氧化酶的主要區(qū)別在于，漆酶不能氧化膽紅素［10］。從同源性比較來看，BCCotA與真菌的BOD有一定的同源性，其可能具有膽紅素氧化酶活性，活性檢測結果也證明了其確實具有BOD活性，Sakasegawa等［22］也有類似的發(fā)現(xiàn)，這表明BC-CotA有可能應用于臨床診斷中血液的膽紅素含量測定。BC-CotA能氧化典型的漆酶和膽紅素氧化酶底物，與真菌漆酶相比，其底物范圍更廣泛，有報道顯示CotA還具有錳酶活性、亞鐵氧化酶和酪氨酸酶等活性［23］，這表明芽孢外衣蛋白是一種復雜且功能多樣的銅離子氧化酶，將其簡單的定義成漆酶并不能反映其確切功能，對其酶結構的深入研究有利于了解其催化機制。在比較的幾種細菌和真菌銅離子氧化酶的銅離子結合區(qū)域中，其中的組氨基酸（His）保持高度保守性，這是因為His是結合銅離子和酶內(nèi)部傳遞電子中的必需氨基酸［24］。BCCotA與其它CotA同源性只有60％，這可能與BCCotA來源于極端細菌有關。

以SGZ為底物時，真菌來源的漆酶最適pH在3.5-5之間［25］，而BC-CotA最適pH在7.5，在堿性pH9也有活性，同時在pH4-11范圍都保持較高的穩(wěn)定性，Lu等［20］報道了多數(shù)細菌漆酶最適pH為堿性條件，這表明細菌漆酶能用于真菌漆酶不適用的堿性環(huán)境。在溫度穩(wěn)定性結果中，BC-CotA表現(xiàn)出熱激活效應，這一現(xiàn)象在其它純化的CotA也存在［26］。多數(shù)真菌漆酶最適溫度在70℃以下［25］，而BC-CotA最適溫度在90℃，并且其在80℃高溫能保持2 h的酶活性，證明BC-CotA是一種熱穩(wěn)定酶。芽孢外衣蛋白CotA，表現(xiàn)出的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性與其結構有關，Brander等［26］指出在銅離子結合位點T2向位點T3傳遞電子過程中的兩個氨基酸非常關鍵，但要闡明其機理還需要對其空間結構和電子傳遞路線進行詳細研究。

4　結論

本研究根據(jù)極端嗜堿芽孢桿菌的芽孢外衣蛋白序列及大腸桿菌密碼子的偏愛性，優(yōu)化并設計出其基因序列，通過合成基因的方法獲得了基因全長，并成功地使其在大腸桿菌中得到高效表達。BC-CotA表現(xiàn)出典型的多銅離子氧化酶活性，能氧化ABTS、SGZ、膽紅素等底物。其序列存在4個銅離子結合位點，與膽紅素氧化酶的同源性高于真菌漆酶。以SGZ為底物，BC-CotA最適pH為7.5，最適溫度為90℃，表現(xiàn)出很強的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，具有潛在的應用價值。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning，Expression，and Characterization of cotA from Alkalophilic Bacillus clausii

LIU You-xun YAN Ming-yang GENG Yuan-yuan HUANG Juan
（School of Basic Medical Sciences，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）

In order to obtain a multi-copper oxidase with unusual features，a cotA gene from alkalophilic Bacillus clausii KSM-K16 was cloned and expressed in Escherichia coli. According to the CotA sequence from B. clausii KSM-K16 and the codon preference in E. coli，the gene of full-length sequence was designed，synthesized，and cloned into the expression vector of pET28a. Then the pET28a-cotA was transformed to E. coli BL21（DE3）that was induced to express recombinant protein，which was subsequently purified and biochemically characterized. The purified recombinant CotA was about 62 kD，showed the blue green and had the characteristic absorption peak of Cu2+at 609 nm. Also the recombinant CotA oxidized the substrates such as ABTS，SGZ and bilirubin. When SGZ as substrate，the optimal temperature and pH was 90℃ and 7.5，respectively. CotA maintained more than 70％ of its original activity after incubating at 80℃ for 2 h. Furthermore，it was quite stable over pH ranging 4.0-11.0，more than 90％ of its original activity after incubating at 37℃ for 1 h still remained. The results showed that the CotA from alkalophilic B. clausii was a typical multi-copper oxidase with the activities of laccase and bilirubin oxidase，and presented strong acidic-，alkali-，and thermo-stability.

Bacillus clausii；spore coat protein；laccase；multi-copper oxidase

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.024

2015-10-14

國家自然科學基金項目（U1304302），河南省教育廳科學技術研究重點項目（12B180030）

劉友勛，男，博士，研究方向：酶工程及生物轉化；E-mail：liuyouxun@xxmu.edu.cn

黃娟，女，碩士，研究方向：基因工程；E-mail：huangjuan@xxmu.edu.cn