羅嫚王宇，2胡亞修江帆王濤彭建尚小麗吳建偉

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004；2. 貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004）

家蠅肽聚糖識(shí)別蛋白（PGRP-SA）的克隆表達(dá)及細(xì)菌結(jié)合研究

羅嫚1王宇1，2胡亞1修江帆1王濤1彭建1尚小麗1吳建偉1

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004；2. 貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng) 550004）

對(duì)家蠅PGRP-SA 基因進(jìn)行克隆表達(dá)以及研究其重組蛋白與細(xì)菌結(jié)合能力。從構(gòu)建的家蠅（Musca domestica）幼蟲(chóng)cDNA 質(zhì)粒文庫(kù)中篩選到PGRP-SA基因，以cDNA 質(zhì)粒為模板設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR 擴(kuò)增，獲得PGRP-SA 基因完整編碼序列。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化。利用半定量RT-PCR 檢測(cè)PGRP-SA在家蠅3齡幼蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)量差異。PGRP-SA重組蛋白進(jìn)行微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，PGRP-SA基因ORF 全長(zhǎng)615 bp，編碼204個(gè)氨基酸，理論分子量22.8 kD，等電點(diǎn)9.11，具有保守的PGRP結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建了pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒，蛋白經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后在大腸桿菌中獲得表達(dá)，經(jīng)親和層析柱純化獲得目的蛋白，利用Western blot 檢測(cè)證明純化蛋白與預(yù)期大小相符。PGRP-SA在家蠅3齡幼蟲(chóng)血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管都有表達(dá)，血淋巴組織中表達(dá)量最高，后腸無(wú)表達(dá)，由此說(shuō)明PGRP-SA基因的表達(dá)具有一定的組織性。PGRP-SA重組蛋白能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合，與白色念珠菌不能結(jié)合。成功表達(dá)及純化家蠅PGRP-SA蛋白，證實(shí)家蠅PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

家蠅；先天免疫；肽聚糖識(shí)別蛋白；原核表達(dá)；微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)

先天免疫是多細(xì)胞生物抵御微生物入侵的第一道防線，機(jī)體的識(shí)別受體通過(guò)識(shí)別入侵的微生物來(lái)引發(fā)免疫反應(yīng)。對(duì)于昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，它是直接且唯一的應(yīng)對(duì)微生物感染的途徑。其中，肽聚糖識(shí)別蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）家族是昆蟲(chóng)先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，從昆蟲(chóng)到人類(lèi)都高度保守，其在識(shí)別入侵病原物和激活免疫途徑的調(diào)控方面起著重要作用［1］。肽聚糖識(shí)別蛋白具有一個(gè)約為165個(gè)氨基酸的保守的肽聚糖（peptidoglycan，PGN）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為PGRP結(jié)構(gòu)域，其序列與T7溶菌酶有30％的相似性［2］。有些PGRPs能夠識(shí)別細(xì)菌所獨(dú)有的肽聚糖結(jié)構(gòu)，并且啟動(dòng)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄及合成［3-5］；PGRPs對(duì)肽聚糖的識(shí)別也會(huì)啟動(dòng)酚氧化酶原途徑的激活，引起黑化反應(yīng)。具有酰胺酶活性的PGRPs可以促進(jìn)吞噬作用，還可以抑制抗菌肽合成從而減弱過(guò)度的免疫反應(yīng)所帶來(lái)的損害。還有一些PGRPs可作為效應(yīng)因子直接將細(xì)菌殺死［6-8］。

目前，果蠅已鑒定的PGRPs有13個(gè)。其中，PGRP-SA是果蠅第一個(gè)被鑒定為主要在血淋巴中表達(dá)的PGRP［9］，它主要與革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖結(jié)合，然后和PGRP-SD以及GNBP1 共同作用于Spatzle，Spatzle能激活Toll信號(hào)通路誘導(dǎo)抗菌肽產(chǎn)生從而消滅病原體［10］。果蠅的PGRP-LC是Imd信號(hào)通路上游一個(gè)重要的跨膜受體，主要識(shí)別革蘭氏陰性菌肽聚糖激活抗菌肽的合成［11］。另外，研究表明果蠅的PGRP-SC1a/b，LB，SB1/2，SC2具有酰胺酶活性，能對(duì)Imd途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控，消除過(guò)多的抗菌肽，避免過(guò)度免疫反應(yīng)造成的損害，其對(duì)果蠅幼蟲(chóng)的發(fā)育是至關(guān)重要的［12］。

家蠅在地球上廣泛分布，長(zhǎng)期暴露于比果蠅生存條件更惡劣的環(huán)境中，家蠅能夠攜帶大量的致病微生物而健康的生活，具有強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)，是研究昆蟲(chóng)與病原物互作機(jī)制的理想模型之一［13，14］。家蠅肽聚糖識(shí)別蛋白功能的研究有助于理解家蠅的先天性免疫機(jī)制。此外，家蠅PGRPs的鑒定及功能研究對(duì)了解果蠅和家蠅之間的共性和差異是有所幫助的。對(duì)家蠅的PGRP-SC研究表明，PGRP-SC的下調(diào)導(dǎo)致抗菌肽的高表達(dá)以及抑制家蠅幼蟲(chóng)的化蛹［15］。果蠅PGRP-SC的相關(guān)研究表明PGRP-SC能延長(zhǎng)衰老蒼蠅的壽命，未見(jiàn)抑制蛹化的報(bào)道。目前關(guān)于果蠅的PGRP-SA有很多報(bào)道，但家蠅肽聚糖識(shí)別蛋白SA類(lèi)基因的研究鮮有報(bào)道。本研究以家蠅為研究對(duì)象，克隆得到PGRP家族的基因PGRP-SA及對(duì)其進(jìn)行不同組織的表達(dá)分析，并進(jìn)行蛋白的表達(dá)純化，利用重組蛋白進(jìn)行微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以期為進(jìn)一步揭示該基因在家蠅免疫防御體系中的功能提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株 家蠅3 齡幼蟲(chóng)由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。pET-28a（+）質(zhì)粒，大腸桿菌BL21（DE3），金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，白色念珠菌均由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

1.1.2主要試劑和儀器 總RNA 提取試劑TRIzol Reagent、rTaq 酶、T4連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DL2000及DL10000 DNA Marker、蛋白Marker、抗His標(biāo)簽抗體、羊抗兔IgG/HRP等購(gòu)置于TaKaRa 公司；所用引物由上海生工生物工程公司合成。無(wú)水乙醇、甲醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭CR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng)IQuant400（美國(guó)Amersham Pharmacia公司），冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI Blast（http//www.ncbi.blastX）檢測(cè)PGRP-SA基因的完整編碼序列和開(kāi)放閱讀框；運(yùn)用Signal P4.1（http：//www. cbs. dtu. Dk/services/SignalP/）分析信號(hào)肽位點(diǎn)；利用蛋白分析專(zhuān)家系統(tǒng)（ExPASy）分析預(yù)測(cè)PGR-SA基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；用Smart軟件分析PGRP-SA的功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成 按照TakaRa公司TRIzol說(shuō)明書(shū)分別提取家蠅3齡幼蟲(chóng)的不同組織（血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、后腸、氣管、馬氏管）及整蟲(chóng)的總RNA?？俁NA經(jīng)電泳檢測(cè)，并利用GeneQuant核酸定量分析儀測(cè)定A260/A280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.2.3引物的設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物的軟件為Premier 5.0 軟件，PGRP-SA-F：5'-AAACATATG TCGAATGATTCGCAGCCATCGTC-3'（下劃線為Nde I）酶切位點(diǎn)；PGRP-SA-R：5'-CGCCTCGAGTCAT TTTTTATTCGACGCATT-3'（下劃線為Xho I酶切位點(diǎn)）。以整蟲(chóng)cDNA為模板，應(yīng)用上述引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行DNA回收。

1.2.4重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物和pET-28a（+）質(zhì)粒分別雙酶切后回收，利用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+抗性的LB平板上篩選陽(yáng)性單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后對(duì)陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

1.2.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot 鑒定 將鑒定正確的pET-28a（+）-PGRP-SA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至E.coli BL21/ DE3感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Kan+抗性的LB平板上篩選陽(yáng)性單克隆，然后接種于含卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床培養(yǎng)，搖至OD600約為0.6 時(shí)，加入IPTG 至終濃度為0.4 mmol/L，繼續(xù)37℃搖5 h，進(jìn)行15％SDS-PAGE電泳分析表達(dá)情況。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解后離心收集沉淀，用強(qiáng)變性劑尿素進(jìn)行蛋白沉淀的溶解及透析復(fù)性，根據(jù)Ni-IDA Agarose說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化，進(jìn)行15％ SDS-PAGE電泳分析，將蛋白于-80℃保存?zhèn)溆?。利用兔?lái)源的抗His標(biāo)簽的抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體為二抗，Western blot 鑒定純化的PGRP-SA重組蛋白。

1.2.6PGRP-SA在不同組織的半定量RT-PCR分析 以家蠅RPSl8基因?yàn)閮?nèi)參，其引物為RPS18-F：5'-ATGTCGCTCGTTATCCCAGAAAAG-3'，RPS18-R：5'-TTACTTCTTCTTGGATACACCGACA-3'。以家蠅3齡幼蟲(chóng)不同組織cDNA為模板，應(yīng)用RTPCR分別擴(kuò)增PGRP-SA基因及RPSl8基因。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.7PGRP-SA重組蛋白與微生物的結(jié)合實(shí)驗(yàn) 將進(jìn)行微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)的目的菌株（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌）進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，第2天以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min收集菌體，用1 mL TBS 緩沖液懸起，洗滌兩次，棄上清，分別加入1 mL重組蛋白PGRP-SA，室溫條件（25℃）下?lián)u床孵育1 h；6 000 r/min離心5 min后棄上清，用1 mL TBS緩沖液洗滌沉淀，重復(fù)3次。離心后收集最后的菌體沉淀和洗滌液。處理樣品后利用Western blot方法檢測(cè)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的效果［16］。使用抗His 標(biāo)簽的抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體為二抗。

2　結(jié)果

2.1家蠅PGRP-SA基因的生物信息學(xué)分析

該cDNA序列ORF 長(zhǎng)為615 bp（登錄號(hào)：XM_005186981），編碼204個(gè)氨基酸（圖1）。預(yù)測(cè)家蠅PGRP-SA蛋白的理論分子量為22 821.1 Da，等電點(diǎn)為9.11，屬于堿性蛋白質(zhì)。預(yù)測(cè)在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。運(yùn)用Signal P結(jié)果顯示該編碼蛋白存在信號(hào)肽序列，位于 1-24位氨基酸之間，因此判定該編碼蛋白為分泌型蛋白。運(yùn)用Smart 軟件分析PGRP-SA的功能結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了它的功能結(jié)構(gòu)域PGRP結(jié)構(gòu)域位于第35-第177位氨基酸，推測(cè)此蛋白可能具有能與肽聚糖結(jié)合并在信號(hào)通路中發(fā)揮作用的功能。

2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定

將切除信號(hào)肽后的目的基因PCR擴(kuò)增，分別將PGRP-SA 的PCR 產(chǎn)物和pET-28a（+）雙酶切回收后，通過(guò)T4 連接酶連接并轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌。對(duì)陽(yáng)性克隆提取重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示約500 bp處有一目的條帶，大小與目的基因基本相符，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1　PGRP-SA基因開(kāi)放閱讀框cDNA序列及對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列

圖2　pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒 PCR 鑒定

圖3　PGRP-SA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3蛋白表達(dá)、純化及鑒定

將構(gòu)建好的pET-28a（+）-PGRP-SA轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌中經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行15％ SDS-PAGE 電泳。結(jié)果（圖3第4、6泳道）所示，約在 24 kD左右出現(xiàn)蛋白表達(dá)條帶，純化后的重組蛋白為單一條帶（第7泳道），表明目的蛋白純化成功。對(duì)純化蛋白做Western blot 驗(yàn)證，結(jié)果顯示目的條帶單一且清晰（第8泳道），說(shuō)明目的蛋白表達(dá)正確。

2.4家蠅3齡幼蟲(chóng)不同組織PGRP-SA基因的表達(dá)分析

以家蠅3齡幼蟲(chóng)不同組織（血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、后腸、氣管、馬氏管）cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖4）顯示內(nèi)參基因RPS18呈一致性表達(dá)，且表達(dá)量較為穩(wěn)定。PGRPSA在血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管都有表達(dá)，血淋巴中表達(dá)量最高，后腸組織無(wú)表達(dá)。

圖4　家蠅不同組織PGRP-SA基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.5PGRP-SA重組蛋白與微生物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

PGRP-SA蛋白分別與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分別收集細(xì)菌沉淀及最后一次洗滌液，利用Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖5第2、4泳道所示約在24 kD大小有蛋白目的條帶，且第3、5泳道顯示最后一次洗滌液都沒(méi)有目的蛋白，蛋白與第1泳道的PGRP-SA蛋白位置相一致。說(shuō)明PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌結(jié)合。第6泳道顯示PGRP-SA不能與真菌白色念珠菌結(jié)合。

3　討論

當(dāng)細(xì)菌、病毒等病原體入侵昆蟲(chóng)時(shí)，昆蟲(chóng)首先靠自身的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來(lái)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），從而激活相關(guān)先天免疫通路消除病原物［17］。在昆蟲(chóng)先天免疫系統(tǒng)中，模式識(shí)別受體主要有PGRPs、β-葡聚糖識(shí)別蛋白（β-glucan recognitionprotein，β-GRP）和革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（Gram-negative binding protein，GNBP）［18］。但其中最主要的模式識(shí)別受體是PGRPs，它通過(guò)識(shí)別病原生物表面的病原相關(guān)分子模式如肽聚糖，從而啟動(dòng)先天免疫反應(yīng)，激活Toll途徑、JAK-STAT途徑、IMD等途徑來(lái)產(chǎn)生抗菌肽對(duì)病原物進(jìn)行清除。PGRPs是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究昆蟲(chóng)免疫調(diào)控關(guān)鍵因子的熱點(diǎn)之一。

圖5　PGRP-SA蛋白微生物結(jié)合實(shí)驗(yàn)

PGRPs是于1996年由Yoshida 等［19］首次在家蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)有較高的結(jié)合能力，并且能導(dǎo)致黑化反應(yīng)。對(duì)PGRPs識(shí)別肽聚糖的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的識(shí)別機(jī)制并不完全相同，革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖是直接暴露在細(xì)胞壁的外層，PGRPs 直接與其結(jié)合；但革蘭氏陰性菌的肽聚糖則被細(xì)胞壁外層膜包被，PGRPs 如何識(shí)別革蘭氏陰性菌肽聚糖的機(jī)制還不完全清楚，目前有兩種假設(shè)，一種是革蘭氏陰性菌的部分肽聚糖發(fā)生了脫離，PGRPs 通過(guò)識(shí)別脫離的肽聚糖來(lái)激活免疫反應(yīng)［20］。另外一種是吞噬細(xì)胞對(duì)革蘭氏陰性菌進(jìn)行吞噬的時(shí)候，肽聚糖被暴露出來(lái)從而被果蠅PGRP所識(shí)別［21］。這兩種觀點(diǎn)還需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在關(guān)于PGRPs殺菌活性機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的肽聚糖識(shí)別蛋白沒(méi)有酰胺酶活性也能使細(xì)菌死亡，原因是在革蘭氏陽(yáng)性菌分裂時(shí)哺乳動(dòng)物PGRP能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞壁終止胞內(nèi)肽聚糖的合成［22］。果蠅PGRP的殺菌機(jī)制是利用其特異的酰胺酶活性殺死細(xì)菌。說(shuō)明肽聚糖識(shí)別蛋白的殺菌機(jī)制存在物種間的差異，是否所有昆蟲(chóng)的PGRPs殺菌機(jī)制都相似也是未知的。

革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖主要被PGRP-SA或PGRP-SD識(shí)別從而激活Toll信號(hào)通路，啟動(dòng)抗菌肽的合成。孫強(qiáng)［23］運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)亞洲玉米螟PGRP-SA基因在不同組織表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示PGRP-SA的主要表達(dá)部位為中腸、表皮、脂肪體，并且對(duì)玉米螟4齡幼蟲(chóng)進(jìn)行革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌感染，發(fā)現(xiàn)PGRP-SA表達(dá)上調(diào)，革蘭氏陽(yáng)性菌誘導(dǎo)后PGRP-SA上調(diào)量高于革蘭氏陰性菌。Zheng［24］對(duì)小菜蛾P(guān)GRP-SA研究發(fā)現(xiàn)PGRP-SA主要在血淋巴和脂肪體表達(dá)，與本研究結(jié)果相同。說(shuō)明家蠅PGRP-SA基因的表達(dá)具有一定的組織性，顯示該基因可能在對(duì)病原生物表面的病原體相關(guān)分子模式的相互識(shí)別和作用并啟動(dòng)家蠅先天性免疫應(yīng)答進(jìn)而抵御微生物發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)果蠅肽聚糖識(shí)別蛋白的研究發(fā)現(xiàn)果蠅PGRP-SA能夠激活Toll途徑，果蠅PGRP-SA（Cys80Tyr）的突變會(huì)導(dǎo)致其激活Toll途徑的活性失效。PGRP-SA能與Lys型肽聚糖和DAP型肽聚糖發(fā)生結(jié)合，但Toll途徑優(yōu)先被Lys型肽聚糖激活，對(duì)DAP型反應(yīng)較弱［25］。Lys型肽聚糖即主要存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中。本研究表明家蠅PGRP-SA能與革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌結(jié)合，推測(cè)PGRP-SA可能是家蠅先天免疫系統(tǒng)中應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染的一個(gè)重要因子。為下一步研究家蠅PGRP-SA參與激活Toll信號(hào)通路及抗菌肽的合成奠定了基礎(chǔ)。與果蠅同屬雙翅目的家蠅是否與果蠅具有相似的免疫識(shí)別機(jī)制呢？

本研究從家蠅幼蟲(chóng)cDNA 文庫(kù)中篩選到并成功克隆了家蠅PGRP-SA基因，全長(zhǎng)615 bp，編碼204個(gè)氨基酸，構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA 重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中成功表達(dá)，利用親和層析法純化了PGRP-SA蛋白，繼而用Western blot 驗(yàn)證目的蛋白表達(dá)正確。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PGRP-SA在家蠅血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管均有表達(dá)，血淋巴組織中表達(dá)量最高。細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明PGRPSA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

4　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA重組原核表達(dá)載體并表達(dá)出PGRP-SA蛋白，獲得純化蛋白。發(fā)現(xiàn)PGRP-SA在家蠅血淋巴中表達(dá)量最高，血淋巴是家蠅主要的免疫組織之一。證實(shí)了家蠅PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Bacterial Binding of Peptidoglycan Recognition Proteins-SA Gene from Musca domestica

LUO Man1WANG Yu1，2HU Ya1XIU Jiang-fan1WANG Tao1PENG Jian1SHANG Xiao-li1WU Jian-wei1
（1. Department of Parasitology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004；2. Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004）

This work is to clone and express the Musca domestica peptidoglycan recognition proteins-SA（PGRP-SA）gene and research the microbial binding activity of it. The PGRP-SA gene was isolated from M. domestica larvae cDNA library，then primers were designed using cDNA plasmid as the template，and the complete encoding sequence of PGRP-SA was acquired by PCR. The bioinformatics methods were employed to predict and analyze the gene and its encoded proteins. The recombinant plasmid pET-28a（+）-PGRP-SA was expressed in Escherichia coli for induced expression and protein purification. RT-PCR was used to test the varied transcription levels of PGRP-SA gene in different tissues. The microbial binding activity of PGRP-SA protein was studied by the microorganism binding assay. The results indicated that the ORF full-length of PGRP-SA gene was 615 bp，encoding 204 amino acids. The molecular weight was 22.8 kD and pI 9.11 and had the conserved PGRP domain. After the recombinant plasmid pET-28a（+）-PGRP-SA was successfully constructed，it was expressed in E. coli by IPTG. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the functional protein purified by Ni2+affinity chromatography was in consistent as the predicted in size. PGRP-SA was expressed in three instars hemolymph，fat body，foregut，midgut，trachea，malpighian tube excepthindgut，the highest in the hemolymph，indicating that the expression of PGRP-SA was tissue-specific. Recombinant PGRP-SA protein bound to Staphylococcus aureus and E. coli，but not Monilia albica. Conclusively，the M. domestica PGRP-SA protein was successfully expressed and purified，and also it was confirmed that PGRP-SA protein from M. domestica bound to S. aureus and E. coli.

Musca domestica；innate immunity；peptidoglycan recognition proteins；prokaryotic expression；microorganism binding assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.022

2016-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360254），貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（NY［2014］3054）

羅嫚，女，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)免疫及應(yīng)用；E-mail：214722912@qq.com

吳建偉，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)免疫及應(yīng)用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn