王大瑋 汪蓓蕾 姚遠 陳皓 張欣 郭剛 張瑞

（天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室，天津 300070）

大鼠NKx6.1啟動子克隆及特異性表達分析

王大瑋 汪蓓蕾 姚遠 陳皓 張欣 郭剛 張瑞

（天津醫(yī)科大學代謝病醫(yī)院內分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室，天津 300070）

旨在構建大鼠NKx6.l啟動子的報告載體，驗證轉錄因子T3R對NKx6.l啟動子的調控活性。用PCR擴增大鼠腦組織NKx6.l的 5'上游啟動子片段2.4 kb，應用生物信息學方法預測該片段上潛在的轉錄因子T3R結合位點，根據不同的結合位點作系列截短，獲得3段長度不等的啟動子缺失片段，分別克隆到熒光素酶報告基因表達質粒（pGL3-Basic）上，構建相應的報告載體。將報告載體和T3R共轉染大鼠星形膠質細胞（rat astrocytes，RA），并檢測報告基因熒光素酶的活性。結果顯示，成功構建大鼠NKx6.l啟動子報告載體，雙熒光素酶報告基因活性檢測表明T3R對NKx6.l啟動子有明顯調控作用，其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高，即存在關鍵順式調控元件?？寺〔⒑Y選出啟動子核心區(qū)域，揭示了甲狀腺激素對大鼠NKx6.l的表達調控機制。

同源盒基因NKx6.l；甲狀腺激素；雙熒光素酶報告檢測；啟動子活性

碘缺乏?。╥odine deficiency disorders，IDD）的最大危害是導致不同程度的腦發(fā)育障礙，其具體的分子作用機制仍是當前的主要研究方向。同源盒基因Nkx6.1作為一種反式作用因子，與神經系統(tǒng)的分化與發(fā)育關系極為密切，對于甲狀腺特異基因的表達有重要的作用［1］。Nkx6.1在胚胎期可影響神經元分化［2］，并在隨后的腦發(fā)育及成熟階段對髓鞘形成、神經元軸突-膠質細胞連接和維持髓鞘穩(wěn)定等產生影響［3］。研究表明，大鼠仔鼠Nkx6.l基因表達水平會因母體低碘膳食而發(fā)生顯著改變［4］。腦發(fā)育時期甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）缺乏會導致中樞神經系統(tǒng)重要神經細胞異常，并伴隨NKx6.l的低表達［5］。以上的研究事實可以初步表明甲狀腺激素可能通過影響NKx6.l的表達來進一步影響腦部神經系統(tǒng)的發(fā)育與成熟，但甲狀腺激素影響NKx6.l表達的具體機制并沒有得到闡釋。甲狀腺激素的基因組功能是通過甲狀腺激素受體（TRs）介導完成的，它們結合形成 TH-TR 復合物，再輔與激活因子、抑制因子，直接調節(jié)目標基因的轉錄［6］。本實驗以研究T3核受體（T3R）對NKx6.l啟動子活性的影響為切入點，來揭示甲狀腺素對NKx6.l的調控機制，以期為進一步研究同源盒基因NKx6.l在甲狀腺素缺乏導致腦發(fā)育遲滯過程中的分子作用機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種、載體和細胞 大鼠星形膠質細胞、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、pRL-SV40、pGL3-Basic質粒為天津市內分泌研究所保藏，pEASY-T3購自北京全式金公司。

1.1.2試劑及耗材 Tissue DNA Kit購自OMEGA，限制性內切酶Kpn I和Bgl II購自大連寶生物（TaKaRa），T4 DNA連接酶購自Thermo，TransTaq DNA Polymerase High Fidelity和TransStart FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA marker均購自天根公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega，Lipofectine 2000購自Invitrogen。

1.1.3基因與引物 PCR引物根據UCSC和GenBank核酸數(shù)據庫應用Primer Premier 5設計，由北京奧科鼎盛公司合成，目的基因測序由Invitrogen公司完成。引物序列見表1。

表1　引物序列表

1.2方法

1.2.1NKx6.l啟動子截短載體構建 提取大鼠腦組織基因組DNA，根據GenBank提供的大鼠NKx6.l基因（登錄號：NM031737）第一個外顯子的起始密碼子的5'上游3 000 bp序列，設計帶有酶切位點Kpn I和Bgl II的上下游引物，并擴增2 325 bp啟動子片段。PCR反應條件為：預變性95℃ 5min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2.5 min，共35個循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產物電泳，回收目的片段，克隆至pEASY-T3載體進行酶切測序鑒定。測序正確的目的片段與pGL3-Basic熒光報告載體連接，命名為pGL3-2.3。利用JASPAR（http：//jaspar.genereg. net/）和alggen（http：//alggen.lsi.upc.es），對T3R潛在結合位點進行預測，根據預測的結合位點，設計帶酶切位點的引物，擴增啟動子截短片段，克隆到pGL3-Basic上，分別命名為pGL3-1.8、pGL3-1.5。

1.2.2細胞培養(yǎng)與轉染 大鼠星形膠質細胞用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素），在37℃、含有5％ CO2的細胞培養(yǎng)箱內貼壁培養(yǎng)。轉染前24 h，將大鼠星形膠質細胞接種于24孔板，細胞匯合度達到60％-70％時轉染。按照Lipofectine 2000使用說明書，將構建的系列截短片段熒光素酶報告質粒和轉錄因子表達載體以及pRL-SV40共轉大鼠星形膠質細胞，轉染36 h后收集細胞并進行熒光素酶活性檢測。每個啟動子做3次獨立實驗，每次3個重復。

1.2.3雙熒光素酶活性分析 轉染36 h的細胞，除去細胞培養(yǎng)基，用1×PBS洗滌1次，24孔板每孔加入100 μL 1×PLB，用槍頭刮下細胞，轉至離心管中，8 000×g離心1 min。樣品20 μL與Luciferase Assay Buffer II混合，立即用熒光發(fā)光計測量活性，然后再加入Stop ＆amp; Glo測量活性，熒光素酶檢測試劑LAR II和Stop ＆amp; Glo的進樣體積均為50 μL，延遲時間2 s，檢測時間10 s；先后讀數(shù)分別為螢火蟲熒光素酶活性和海腎螢光素酶活性，計算相對熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據均用x-±s表示，并經方差分析檢驗差異是否具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠NKx6.l啟動子序列及生物信息學分析

本實驗以大鼠腦組織基因組DNA為模板，通過PCR特異性擴增了2 325 bp的NKx6.l基因5'端上游啟動子片段。用生物信息學的方法分析預測序列上存在2個潛在的T3R轉錄因子結合位點（圖1）。

圖1　NKx6.1啟動子克隆及生物信息學分析

2.2Nkx6.l啟動子區(qū)系列截短片段的擴增

根據預測的T3R結合位點，以測序正確的TA克隆為模板用對應的引物對NKx6.1的5'端上游啟動子序列進行截短，獲得2 325 bp、1 887 bp和1 507 bp的片段，經瓊脂糖凝膠電泳分析驗證（圖2-A），PCR擴增產物與預期片段大小相符。

2.3NKx6.l重組報告載體的構建

以限制性核酸內切酶Kpn I和Bgl II對重組質粒酶切可見約4 800 bp的載體片段和2 325 bp、1 887 bp，1 507 bp目的片段，與預期片段大小吻合，表明載體構建正確（圖2-B）。

2.4報告基因活性和大鼠NKx6.l啟動子核心調控區(qū)篩選

根據生物信息學軟件預測得T3R結合位點，以系列截短得方式進行敲除，獲得了pGL3-2.3，pGL3-1.8，pGL3-1.5三個報告載體（圖3），與T3R表達載體及其對照共轉染大鼠星形膠質細胞，檢測報告載體熒光素酶活性，以篩選T3R對NKx6.l啟動子的核心調控區(qū)。結果發(fā)現(xiàn)T3R表達載體的對照pcDNA對熒光報告載體幾乎沒有激活作用，且pcDNA-T3R對空熒光報告載體pGL3-basic幾乎沒有激活作用。pcDNA-T3R對pGL3-basic-2.3與pGL3-basic-1.8的激活作用相當，而對pGL3-basic-1.5的激活作用顯著下降（P＜0.05）（圖3）。提示1.5 kb-1.8 kb可能存在啟動子核心調控區(qū)。

圖2　NKx6.1啟動子的系列截短片段（A）及相應的熒光素酶報告載體雙酶切鑒定（B）

圖3　大鼠NKx6.1啟動子系列截短片段的雙熒光素酶活性檢測

3　討論

甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）是哺乳動物生長發(fā)育過程中最重要的激素之一，大鼠妊娠兩周，腦組織即在TH的調節(jié)下開始快速發(fā)育，一直延續(xù)到出生后一個月左右［7］。低碘造成的甲狀腺激素缺乏會對腦組織的正常發(fā)育產生影響［8］。同源盒基因Nkx6.l作為一種反式作用因子與神經系統(tǒng)的分化與發(fā)育關系極為密切，對于甲狀腺特異基因的表達有重要作用［1］。研究表明低碘膳食會造成特定時期大鼠腦組織中NKx6.l的表達水平下降，并且適時的補充適量的甲狀腺激素可以改善甲狀腺激素水平低下狀態(tài)，有利于促進Nkx6.l在基因和蛋白水平接近于正常同期水平［9］。然而，甲狀腺激素對NKx6.1的表達調控機制卻沒有得到進一步揭示。甲狀腺激素參與調控基因轉錄主要是通過與甲狀腺激素受體結合形成復合物進而調控下游基因的轉錄［10］，甲狀腺激素受體（TRs）是一種 DNA 結合轉錄因子，屬于配體依賴型核激素受體超家族［11-13］。甲狀腺激素在體內的活性形式是T3［14］，相對應的T3R是一種重要的轉錄因子，可能在NKx6.l的表達調控中起重要作用。體外研究NKx6.l的表達調控模型，選擇大鼠星形膠質細胞（Astrocytes），因其作為中樞神經系統(tǒng)中數(shù)量最多的細胞，承擔著CNS發(fā)育和功能執(zhí)行等作用［15-19］。Astrocytes能夠控制突觸的數(shù)量，可以直接或者間接的調控突觸的活性，而且對突觸具有維持作用，此外大量的證據顯示阿爾茲海默癥與Astrocytes相關［20］。

4　結論

構建了大鼠NKx6.l的啟動子的報告載體，應用生物信息學預測了NKx6.l啟動子上潛在的T3R結合位點。雙熒光素酶報告載體實驗發(fā)現(xiàn)，這些潛在的結合位點在一定程度上能夠激活NKx6.l啟動子。

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（責任編輯 李楠）

Cloning and Specific Expression Analysis of Rat NKx6.1 Promoter

WANG Da-wei WANG Bei-lei YAO Yuan CHEN Hao ZHANG Xin GUO Gang ZHANG Rui
（Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Institute of Endocrinology，Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

This work aims to construct the reporter vector of rat NKx6.1 promoter and verify the activity of transcription factor T3R in the regulation of NKx6.l promoter. We cloned a 2.4 kb 5' upstream promoter segment of NKx6.l from the brain tissue of rat by PCR and predicted the binding sites of potential transcription factor T3R in the segment via bioinformatics method. Three promoter-deficient segments with different lengths were obtained by promoter deletion analysis and then cloned into the expression plasmids of luciferase reporter gene（pGL3-Basic），and corresponding reporter vectors were constructed. The reporter vectors and T3R were co-transfected into rat astroytes，then the activities of the gene's luciferase were determined. Above results demonstrated that we successfully constructed the reporter vector of NKx6.l promoter，and the results of dual luciferase assay showed that T3R regulated significantly NKx6.l promoter，and the region of -1 887 bp-1 507 bp presented the highest activities，i.e.，contained the key cis-regulatory element. In conclusion，we cloned and screened the core promoter region and revealed the transcriptional regulation mechanism of thyroid hormones on NKx6.l in brain tissue of rat.

homeobox gene Nkx6.l；thyroid hormones；dual-luciferase reporter assay system；promoter activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.017

2015-10-30

王大瑋，男，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：grabbydowa@sina.com

張瑞，女，助理研究員，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：1683039118@qq.com